Методическая статья

Разработка нового криопротектора с низким содержанием ДМСО для сохранения стволовых клеток периферической крови

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В протоколе используется криопротектор гемопоэтических стволовых клеток, содержащий очень низкую концентрацию диметилсульфоксида, и демонстрируется его клиническая безопасность и эффективность в защите гемопоэтических стволовых клеток, обеспечивая новую стратегию криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток при клинической трансплантации аутологичных стволовых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоконсервация гемопоэтических стволовых клеток периферической крови (PBHSC) имеет решающее значение для трансплантации аутологичных стволовых клеток (ТГСК), но традиционные криопротекторы (ТЦА), содержащие 10% диметилсульфоксида (ДМСО), вызывают опасения по поводу безопасности из-за риска токсичности. Это исследование было направлено на валидацию нового криопротектора с низким содержанием ДМСО (CPA, 2% ДМСО) для сохранения PBHSC при -80 °C, устраняя необходимость в хранении жидкого азота. PBHSC от шести доноров были разделены на группы CPA и TCPA. CPA смешивали с PBHSC (1:1 об/об.) и непосредственно хранили при -80 °C. TCPA (10% ДМСО + 5% человеческого альбумина) подвергали постепенному охлаждению (1 °C/мин) и хранению жидкого азота. Через 1 месяц обе группы были разморожены на водяной бане при температуре 37 °C. Сравнивали жизнеспособность клеток, целостность цитоскелета (микрофиламенты/микротрубочки), активность митохондрий и способность к колониеобразованию. После размораживания выживаемость PBHSC была сопоставима между CPA (91,29%) и TCPA (90,07%). Тем не менее, CPA превзошел TCPA в анализах жизнеспособности клеток (CPA: 89,38% против TCPA: 79,55%; p < 0,05). Анализ цитоскелета выявил неповрежденные микрофиламенты и микротрубочки в клетках, сохраненных CPA, со структурной прозрачностью, превышающей TCPA. Митохондриальная активность в клетках, обработанных CPA, отражала свежие PBHSC, демонстрируя на 8,5% более высокую активность, чем TCPA (p < 0,05) и увеличивая количество митохондриальных комплексов. Колониеобразующие анализы еще раз подтвердили превосходство CPA, с более высоким количеством колоний после индукции. CPA обеспечивает безопасную и удобную криоконсервацию PBHSC при температуре -80 °C с использованием сверхнизкого уровня ДМСО (2%), устраняя зависимость от жидкого азота. Его повышенная жизнеспособность клеток и сохранность митохондрий свидетельствуют о клинических преимуществах за счет снижения рисков токсичности инфузии. Этот протокол предлагает трансформационную стратегию для ТГСК, оптимизируя безопасность и операционную эффективность.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является хорошо зарекомендовавшим себя вариантом лечения различных гематологических злокачественных новообразований, включая лейкемию, лимфому и множественную миелому, где она служит в качестве терапии первой или второй линии для восстановления кроветворения и восстановления иммунной компетентности после интенсивной химиотерапии или лучевой терапии 1,2,3,4,5,6,7 . Успешные исходы ТГСК в решающей степени зависят от жизнеспособности криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток (ПГСК) периферической крови, которые должны сохранять функциональную способность к восстановлению гемопоэтических и иммунных клеток 8,9,10,11,12. Хранение гемопоэтических стволовых клеток является критическим этапом в ТГСК, потому что после забора аутологичных гемопоэтических стволовых клеток пациенты обычно проходят лучевую, химиотерапию и другие методы лечения для уничтожения опухолевых клеток. Качество хранения гемопоэтических стволовых клеток напрямую связано с успехом или неудачей восстановления гемопоэтических и иммунных клеток 13,14,15,16,17,18. Чтобы обеспечить жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток после криоконсервации, клиническая практика часто включает добавление альбумина крови человека и диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве CPA. Эти агенты имеют решающее значение для поддержания активности клеток во время и после процесса криоконсервации. Как правило, концентрация используемого ДМСО колеблется от 5% до 10% (v/v). Исследования показали, что поддержание концентрации ДМСО на уровне от 3,5% до 10% (v/v) может повысить эффективность криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток19,20. Тем не менее, клиническое применение ДМСО остается проблематичным из-за дозозависимой токсичности: 30-60% реципиентов трансплантата сообщают о побочных эффектах, таких как тошнота, рвота и гипотензия. Чтобы устранить ограничения обычных криопротекторных агентов (CPA), содержащих 5%-10% диметилсульфоксида (ДМСО), данное исследование направлено на разработку нового CPA, который обеспечивает безопасную и эффективную криоконсервацию PBHSC при -80 °C с использованием сверхнизких концентраций ДМСО (2% v/v), тем самым устраняя необходимость в сложных протоколах жидкого азота и снижая токсичность, связанную с ДМСО.

Новые альтернативы, такие как CPA на основе трегалозы или с полимерным усилением, демонстрируют доклинические перспективы, но сталкиваются с препятствиями в клиническом применении из-за нормативных препятствий или несовместимости со стандартными протоколами размораживания23. В отличие от этого, наш CPA основан на установленном профиле безопасности систем HSA-DMSO, в то же время внедряя оптимизированные соотношения присадок, которые улучшают цитопротекцию. Этот метод особенно подходит для клинических центров, в которых отсутствует инфраструктура жидкого азота или требуется быстрое выполнение рабочих процессов. Однако для длительного хранения (>2 года) жидкий азот остается предпочтительным24. Клиницисты должны балансировать между простотой протокола и индивидуальной переносимостью пациента к ДМСО, обеспечивая индивидуальное применение этой стратегии для максимизации безопасности и операционной эффективности при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

В этом исследовании использование криопротекторов с пониженным содержанием ДМСО представляет собой важнейшую стратегию для одновременного сохранения эффективности криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток при минимизации связанной с этим токсичности. Эффективность, безопасность и удобство недавно разработанной КПА гемопоэтических стволовых клеток были оценены для сохранения гемопоэтических стволовых клеток (ПГГСК) периферической крови. Был реализован простой метод прямого замораживания с использованием нового CPA, избегающий традиционных протоколов криоконсервации. Полученные данные свидетельствуют о том, что одноэтапная криоконсервация клеточных суспензий при температуре -80 °C с использованием низкоконцентрированного ДМСО CPA обеспечивает превосходные эффекты консервации по сравнению с традиционными CPA (TCPA). Этот подход может предложить новые стратегии для оптимизации клинического процесса трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК).

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пациенты онкогематологической онкологии, перенесшие ТГСК, были набраны с июня 2020 года по июнь 2022 года в отделении гематологии онкологической больницы Шэньчжэня. Образцы клеток крови были взяты до и после мобилизации трансплантата для проведения ТГСК, включая два случая острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), два случая лимфомы Ходжкина (ЛХ), один случай кожной подлинно гистиоцитарной лимфомы (ГХЛ) и один случай первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы (ПМБЛ), с медианой возраста 53 года и диапазоном от 35 до 61 года. Исследование получило информированное согласие пациентов и одобрение комитета по этике онкологической больницы Шэньчжэня с этическим одобрением под номером AF-SC-07-2.0. Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных Онкологической больницы Китайской академии медицинских наук (Approval No. NCC2018A073) и соответствовали международным рекомендациям по исследованиям на животных.

1. Подупаковка и криоконсервация образцов гемопоэтических стволовых клеток

  1. Подготовка асептического рабочего места
    1. Тщательно мойте руки и надевайте стерильные маски и перчатки. Дезинфицируйте руки, запястья и локти с использованием 75% этанола.
    2. Стерилизуйте все запасные инструменты (пипетки, гемостаты) автоклавом или УФ-облучением. Разложите на шкафу для биобезопасности следующие материалы: 1 мл стерильных наконечников для пипеток без пирогена (2 коробки), пипетки объемом 1000 мкл, стерильные пробирки для криоконсервации объемом 1,8 мл, пробирки для центрифуги объемом 50 мл и коробку для хранения пробирок для криоконсервации (программируемую коробку для заморозки).
  2. Маркировка и смешивание клеточного CPA
    1. Маркируйте пробирки для криоконсервации с указанием идентификатора образца, даты, количества клеток и имени донора.
    2. Соедините пакет с гемопоэтическими стволовыми клетками, содержащий 180-200 мл гемопоэтических стволовых клеток, с пакетом, содержащим CPA, содержащий 100 мл нового криопротектора с низким содержанием ДМСО, с помощью стерильной инфузионной трубки.
    3. Зажмите середину трубки стерильным гемостатом. Прикрепите один конец к мешку со смесью cell-CPA, а другой — к центрифужной пробирке объемом 50 мл.
  3. Розлив и криоконсервация
    1. Отпустите гемостат, чтобы обеспечить контролируемый поток смеси ячейки и CPA в центрифужную трубку.
    2. Отсадите 1 мл аликвот из центрифужной пробирки с помощью пипетки. Переложите аликвоты в предварительно помеченные криопробирки (30 пробирок на образец). Затяните крышки и поместите пробирки в ящик для хранения.
  4. Хранение и транспортировка
    1. Немедленно перенесите ящик для хранения в холодильник с температурой -80 °C. Для транспортировки упакуйте криопробирки в сухой лед (-78,5 °C) с контролем температуры.

2. Криоконсервация и восстановление ПБДГСК

  1. Приготовление и смешивание CPA и TCPA
    1. Предварительно охладите ледовую платформу до 2-8 °C. Разморозьте гемопоэтические стволовые клетки CPA и TCPA в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу 1 для композиций CPA/TCPA).
    2. Смешайте CPA и TCPA с шестью образцами PBHSC в соотношении объема 1:1 на ледовой платформе. Перенесите клеточную суспензию в стерильные криовиалы.
  2. Криоконсервация CPA
    1. Поместите криовиалы непосредственно в морозильную камеру при температуре -80 °C. Убедитесь, что конечная концентрация ДМСО в суспензии составляет 2% (v/v). Хранить образцы в течение 1 месяца.
  3. Криоконсервация TCPA (сравнительный контроль)
    1. Приготовьте ТССА, содержащий 5% альбумина крови человека и 10% ДМСО (v/v). Загрузите суспензии PBHSC в криовиалы и охладите до -80 °C при 1 °C/мин с помощью программируемого морозильника.
    2. Переведите криовалиал в жидкий азот для длительного хранения. Хранить образцы в течение 1 месяца.
  4. Клеточная реанимация
    1. Извлекайте криописи через 1 месяц. Разморозьте ячейки на водяной бане при температуре 37 °C с легким перемешиванием (≤ 5 минут).
    2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут, чтобы удалить остатки CPA/TCPA. Ресуспендируйте 1 мл клеток в предварительно подогретой питательной среде RPMI 1640 для последующих анализов.

3. Анализ жизнеспособности клеток

  1. Подсчет ячеек на основе изображений
    1. Приготовьте смешанный раствор для окрашивания, содержащий 10 мкг/мл акридина оранжевого (AO) и 10 мкг/мл йодида пропидия (PI).
    2. Смешайте 100 μл клеточной суспензии со 100 μл окрашивающего раствора (в соотношении 1:1) в стерильной микроцентрифужной пробирке.
    3. Загрузите 10 мкл окрашенного образца в автоматический счетчик ячеек. Анализируйте жизнеспособность клеток с помощью интегрированного программного обеспечения:
      жизнеспособность = живые клетки / общее количество клеток x 100%
  2. Валидация проточной цитометрии
    1. Приготовьте окрашивающий раствор Annexin V-FITC/PI, смешав Annexin V-FITC (5 μL) и PI (5 μL) в 100 μL связующего буфера.
    2. Добавьте в окрашивающий раствор 300 μл клеточной суспензии и инкубируйте при 25 °C в течение 15 минут в темноте.
    3. Центрифугируйте смесь при 300 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл PBS и проанализируйте жизнеспособность с помощью проточного цитометра25.

4. Колониеобразующий анализ

  1. Приготовление клеточной суспензии
    1. Смешайте клеточную суспензию с 0,4% раствором трипанового синего в соотношении 1:1 и инкубируйте в течение 3 минут, чтобы различить жизнеспособные и мертвые клетки. Выполняйте подсчет дубликатов с помощью автоматического счетчика клеток для определения плотности жизнеспособных клеток (убедитесь, что жизнеспособность >90%). Отрегулируйте объем клеточной суспензии до целевой концентрации (1 x 10,6 клеток/мл) и отфильтруйте через сетчатое фильтр 40 мкм, чтобы обеспечить дисперсию одиночных клеток. Отфильтруйте клеточную суспензию через стерильное сетчатое фильтр 40 мкм, чтобы удалить агрегаты.
  2. Смешивание сред
    1. Смешайте 1 мл клеточной суспензии с 9 мл коммерческой среды для колониеобразующих единиц мыши в конической пробирке объемом 15 мл (1:10 v/v).
    2. Сделайте смесь вихревой при 1 500 об/мин в течение 30 с, чтобы обеспечить однородность. Центрифуга при 100 x g в течение 10 с для устранения пузырьков воздуха.
  3. Клеточный посев и настройка влажности
    1. Раздайте 1,5 мл смеси без пузырьков в стерильную чашку Петри диаметром 35 мм. Добавьте 3 мл стерильной дистиллированной воды в периферийную канавку посуды (или поместите отдельную стерильную емкость внутрь крышки посуды) для поддержания влажности.
    2. Запечатайте посуду во влажной камере (≥ влажности 95%).
      1. Чтобы подготовить камеру, поместите два слоя стерильной абсорбирующей бумаги в пластиковый контейнер с крышкой (например, чашку Петри 15 см). Добавьте 10 мл стерильной деионизированной воды, чтобы пропитать бумагу. Поместите испачканную культуру чашку в центр камеры, не допуская прямого контакта чашки с влажной бумагой. Оберните прозрачную пленку вокруг стыка крышки и контейнера 3 раза для герметичной герметизации. В качестве альтернативы можно закрепить края крышки лабораторным скотчем. Инкубируйте герметичную камеру при температуре 37 °C в течение 30 минут, чтобы выровнять влажность ≥ 95%.
  4. Выращивание и перепись колоний
    1. Инкубируйте клетки при 37 °C при 5%CO2 в течение 16 дней. Подсчитайте гемопоэтические колонии (≥ 50 клеток на кластер) с помощью инвертированного микроскопа при 40-кратном увеличении. Рассчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) на 1 x 104 высеянные клетки.

5. Определение митохондриальной активности

  1. Окрашивание клеток Родамином 123
    1. Ресуспендируйте ПБДГСК в концентрации 1 x 106 клеток/мл в 1 мл RPMI1640 среды. Добавьте краситель Rhodamine 123 до конечной концентрации 5-10 μM. Инкубируйте клетки в 5%CO2 при 37 °C в течение 10 минут.
    2. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл свежей RPMI1640. Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте в 1 мл PBS.
  2. Анализ конфокальной микроскопии
    1. Протрите чистое предметное стекло безворсовой бумагой, чтобы удалить пыль или загрязнения.
    2. Восстановите суспендию окрашенных PBHSC в PBS до соответствующей плотности, чтобы избежать наложения сигналов. Нанесите пипеткой 10-20 μл клеточной суспензии и медленно распределите ее по центру предметного стекла.
    3. Наклоните покровную крышку под углом 45°, осторожно коснитесь одного края капли и постепенно опускайте ее, чтобы свести к минимуму количество пузырьков воздуха. Слегка нажмите, чтобы ячейки равномерно распределились в монослой.
    4. Поместите предметное стекло горизонтально в темноту на 5 минут, чтобы клетки осяли. Немедленно приступайте к анализу с помощью конфокальной микроскопии.
    5. Закрепите витражные элементы на предметном стекле. Наблюдайте за распределением митохондрий с помощью конфокального микроскопа (ex/em: 488/525 нм).
  3. Количественное определение проточной цитометрии
    1. Анализируйте интенсивность флуоресценции Rhodamine 123 с помощью проточного цитометра (канал FL1). Используйте обработанные перекисью водорода PBHSC (1 мМ, 1 ч) в качестве положительного контроля26.

6. Окрашивание цитоскелета ПГХСК

  1. Окрашивание микрофиламентами (Actin Tracker Green-488)
    1. Приготовьте AF488-конъюгированный флуоресцентный зонд фаллоидина, растворенный в PBS при конечной концентрации 5 Ед/мл. Разбавить исходный раствор (200 Ед/мл в метаноле) путем смешивания 5 мкл исходного раствора со 195 мкл PBS (разведение 1:40). Тщательно перемешайте в течение 10 с для обеспечения однородности.
    2. Добавьте 200 μЛ приготовленного рабочего раствора Actin Tracker Green-488 (5 Ед/мл) в ПГСК. Инкубируйте клетки при 25 °С в течение 30 мин в темноте.
    3. Промойте ячейки 2 раза 1 мл иммуноокрашивающего промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Ядра контрокрашивать 200 мкл DAPI (1 мкг/мл) в течение 5 мин при 25 °C в темноте.
  2. Окрашивание микротрубочек (Tubulin Tracker Red)
    1. Приготовьте флуоресцентный зонд с инфракрасным конъюгированием паклитаксела, растворенный в PBS при конечной концентрации 1 мкМ. Разбавьте исходный раствор (100 мкМ в ДМСО), добавив 10 мкл исходного раствора к 990 мкл PBS (коэффициент разбавления 1:100). Вортсируйте смесь в течение 10 секунд для обеспечения однородности и защиты от света.
    2. Приготовьте рабочий раствор Tubulin Tracker Red в конечной концентрации 250 нМ в полной среде. Разбавить исходный раствор (1 мМ в ДМСО) путем добавления 2,5 мкл исходного раствора к среде 997,5 мкл (коэффициент разбавления 1:400). Переварите смесь в течение 10 с и добавьте 200 μл к ПГХСК. Выдерживайте при температуре 25 °C в течение 30 минут в темноте.
    3. Промойте ячейки 2 раза 1 мл иммуноокрашивающего буфера для промывки. Ядра контрокрашивать 200 мкл DAPI (1 мкг/мл) в течение 5 мин при 25 °C в темноте.
  3. Монтирование и микроскопия
    1. Промойте испачканные элементы 2 раза с помощью PBS. Смешайте окрашенные клетки с 90% раствором глицерина-PBS (90% глицерина и 10% PBS, v/v) в соотношении 1:1 по объему. Нанесите пипеткой 10 мкл смеси на предметное стекло. Наклоните покровную крышку под углом 45° и постепенно опускайте ее, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
    2. Анализируйте морфологию актина/микротрубочек с помощью флуоресцентного микроскопа (возбуждение 488 нм для Actin Green; 561 нм для Tubulin Red). Включите положительный контроль: обработанные цитохалазином B PBHSC (5 мкМ, 2 ч) для разрушения актина и обработанные колхицином PBHSC (10 мкМ, 3 ч) для деполимеризации микротрубочек.

7. Оценка безопасности CPA

  1. Тест на гемолиз
    1. Приготовьте 2% суспензию эритроцитов кролика с использованием антикоагулянта свежей крови с ЭДТА.
    2. Добавьте СРА (0,1-0,5 мл) и физиологический раствор (2,0-2,4 мл) в 2,5 мл клеточной суспензии в стеклянных пробирках.
    3. Используйте физиологический раствор в качестве отрицательного контроля и стерилизованную воду в качестве положительного контроля. Инкубировать при 37 °C в течение 3 ч и наблюдать за гемолизом/свертыванием крови под микроскопом.
  2. Тест на системную аллергию
    1. Подготовка животных
      1. Используйте 36 морских свинок с SPF Hartley (50% самцов, 271-307 г; 50% самок, 270-301 г) в возрасте 4-5 недель. Поддерживайте следующие условия содержания: Температура: 16-26 °C (± 4 °C ежедневное колебание), Влажность: 40%-70%, Вентиляция: 8-10 воздухообменов/ч, Световой цикл: 12 ч свет/темнота
    2. Фаза сенсибилизации
      1. Вводите CPA в нижний левый квадрант брюшной полости в дозе 2 мл/кг (низкий) или 6 мл/кг (высокий) в 1, 3 и 5 дни. Низкая доза (2 мл/кг) имитирует клинические уровни воздействия, в то время как высокая доза (6 мл/кг) представляет собой 3-кратный запас безопасности для оценки дозозависимой гиперчувствительности в соответствии с Директивой ОЭСР 406 для тестирования системной аллергии27,28.
      2. Используйте сывороточный альбумин человека (положительный контроль) и физиологический раствор (отрицательный контроль).
    3. Этап испытаний
      1. Введите ЦПА внутривенно через краевую ушную вену в дозе 4 мл/кг (низкий) или 12 мл/кг (высокий) на 19 и 26 дни. Провокационные дозы (2-кратные дозы сенсибилизации) согласуются с установленными протоколами для провоцирования анафилаксии у предварительно сенсибилизированных морских свинок, что было подтверждено в предыдущих исследованиях биосовместимости криопротекторов29.
      2. Контролируйте симптомы анафилаксии (респираторный дистресс, судороги) в течение 1 ч после инъекции.
    4. Постэкспериментальная обработка
      1. Вернуть морских свинок под ветеринарную помощь для 72-часового наблюдения. Эвтаназию проводят с помощью обескровливания брюшной аорты под анестезией изофлураном.
  3. Испытание на острую системную токсичность
    1. Инъекция мыши
      1. Введите 50 мл/кг CPA в хвостовую вену 10 самцов мышей ICR (32,0-37,1 г, возраст 6 недель). Используйте мышей, которым вводили физиологический раствор, в качестве отрицательного контроля (n = 10).
    2. Протокол наблюдения
      1. Контролируйте выживаемость, признаки токсичности и вес через 4, 24, 48 и 72 ч после инъекции. Поддерживайте условия содержания: Температура: 20-25 °C (± 3 °C ежедневно), Влажность: 40%-70%, Вентиляция: 10-20 воздухообменов/ч.
    3. Эвтаназия
      1. Обезболить мышей 3% изофлураном. Усыпить путем обескровливания брюшной аорты.
  4. Тест на раздражение сосудов
    1. Кролиководство
      1. Используйте 6 самцов новозеландских кроликов (3,65-4,36 кг, возраст 7-8 месяцев). Вводите 5 мл/кг CPA в правую ушную вену еженедельно (всего 3 дозы). Введите физиологический раствор в левое ухо в качестве отрицательного контроля.
    2. Оценка тканей
      1. Осмотрите места инъекций на предмет эритемы, отека или некроза на 18-19 день. Оценивайте раздражение места инъекции в зависимости от тяжести эритемы, отека и некроза. Применяйте систему оценки ISO 10993-12 с оценками от 0 (отсутствие реакции) до 4 (тяжелый некроз)30,31.
    3. Постэкспериментальная обработка
      1. Обезболить кроликов тилетамином-золазепамом (5 мг/кг, в/м). Усыпляют с помощью быстрого кровопускания сонной артерии.

8. Трансплантация ПБГСК

  1. Набор и мобилизация пациентов
    1. Запишите шесть пациентов, отвечающих критериям трансплантации: Мононуклеарные клетки ≥ 5 x 108 клеток/кг
      CD34+ клетки ≥ 2 x 106 клеток/кг23. Исключите пациентов в возрасте <18 или >65 лет, пациентов с активными инфекциями, тяжелой дисфункцией органов, беременностью/лактацией, недавней иммуносупрессивной терапией (в течение 4 недель) или неконтролируемыми психическими расстройствами.
    2. Мобилизуйте гемопоэтические стволовые клетки из костного мозга в периферическую кровь с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). Мобилизовать гемопоэтические стволовые клетки из костного мозга в периферическую кровь путем ежедневного введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора подкожно в дозе 10 мкг/кг (точная доза варьируется от человека к человеку) в течение 5 дней подряд.
  2. Сбор и криоконсервация ПГСК
    1. Соберите мобилизованные ПБДГСК с помощью устройства для афереза со скоростью кровотока 40 мл/мин и соотношением антикоагулянтов к цельной крови 1:12. Обрабатывайте 15-16 л цельной крови за сеанс с получением 180-200 мл концентрата ПГХСК. Разделите образец на две аликвоты, и каждый пакетик будет иметь емкость 90-100 мл.
    2. Ресуспендирование первой аликвоты в 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) и 5% сывороточном альбумине человека для клинического переливания. Поместите ресуспендированную аликвоту в программируемый контейнер для заморозки со скоростью охлаждения от -1 °C/мин до -80 °C. Наклейте на криопакет маркировку с указанием идентификатора пациента и параметров замораживания (например, номера партии, даты). Приготовьте вторую аликвоту в 5% ДМСО и 10% фетальной бычьей сыворотке для тестирования на жизнеспособность.
  3. Размораживание и реинфузия
    1. Разморозьте криоконсервированные ПБГСК на водяной бане при температуре 37 °C (≤ 2 минуты). Вводите размороженные клетки внутривенно после химиотерапии/лучевой терапии. Введите клетки внутривенно через центральный венозный катетер в течение 30 минут после размораживания с помощью шприцевого насоса со скоростью 3-5 мл/мин.
  4. Посттрансплантационный мониторинг
    1. Отслеживайте восстановление кроветворения по ежедневным показателям крови: порог успеха нейтрофилов: ≥ 0,5 x 109 клеток/л; порог успешности тромбоцитов: ≥ 20 x 109 клеток/л32.
    2. Контролируйте восстановление иммунитета с помощью анализа субпопуляции лимфоцитов. Соберите 5 мл образцов периферической крови в пробирки ЭДТА. Окрашивайте клетки флуоресцентными антителами против CD3, CD4, CD8, CD19 и CD56 в течение 15 минут в темноте. Анализируйте субпопуляции лимфоцитов с помощью проточного цитометра и стандартизированной стратегии гейтирования. Сравните абсолютное количество (клеток/л) с соответствующими по возрасту здоровыми референсными диапазонами для интерпретации.

9. Субпопуляционный анализ ПГСК

  1. Окрашивание антителами
    1. Приготовьте замороженные ПБДГСК (группы CPA/TCPA) и разморозьте на водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Клетки-метки флуоресцентными антителами: CLP: CD45-CD34+CD10+ (клоны HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (клоны HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Рисунок 1). Центрифуга размораживала ПГХСК при 300 х г в течение 5 мин для удаления криоконсервантов. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 106 клеток/мл в PBS, содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки.
    3. Готовят коктейли антител с использованием клонов HI30/4H11/HI10a для CLP и HIT2/4G8/5F3/HI100 для MEP/GMP по титрам, рекомендованным производителем. Инкубировать клетки со смесями антител в течение 30 минут в темноте при температуре 4°C с легким вихревым движением каждые 10 минут. Промойте окрашенные клетки 2 раза холодным PBS + 0,1% азидом натрия с помощью центрифугирования при 200 x g в течение 3 минут. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл PBS с 1 мкг/мл DAPI для гейтирования жизнеспособности перед анализом проточной цитометрии.
    4. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут в темноте. Постирайте 2 раза с PBS, содержащим 1% BSA.
  2. Настройка проточной цитометрии
    1. Ресуспендируйте окрашенные клетки в 500 мкл PBS. Анализируйте субпопуляции с помощью проточного цитометра: настраивайте лазеры (488 нм, 640 нм) и фильтры (FITC, PE, APC). Соберите ≥ 10 000 событий на образец.
    2. Популяции затворов на основе прямого/бокового рассеяния и интенсивности флуоресценции (рис. 1).
  3. Сравнение данных
    1. Рассчитайте проценты CLP/MEP/GMP с помощью программного обеспечения FlowJo v10.8. Сравните группы CPA и TCPA с помощью t-критерия Стьюдента (α = 0,05). Визуализация различий с помощью Prism 9.0 (гистограммы с SEM)33.

10. Статистический анализ

  1. Выполните сравнение средних непрерывных числовых переменных, которые соответствуют нормальному распределению с дисперсией хи-квадрат, используя t-критерий, а для непрерывных числовых переменных, которые не соответствуют нормальному распределению, проверьте их непараметрически.
  2. Выводить данные для непрерывных переменных в виде среднего значения ± стандартного отклонения или медианы, а также верхнего и нижнего квартилей. Используйте точный тест Фишера для сравнения показателей между двумя группами.
  3. Анализируйте данные и стройте графики с помощью SPSS 26.0 и программного обеспечения GraphPad Prism 9. Учитывайте все различия в двухсторонних тестах статистически значимыми, если p < 0,05. Часть данных представлена в виде статистических описаний.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение методов одноэтапной криоконсервации и криоконсервации жидким азотом
Жизнеспособность криоконсервированных ПХГСК после восстановления оценивали с помощью анализов AO/PI. Как показано на рисунке 2А, жизнеспособность ПГГСК, криоконсервированных при -80 °С с использованием ЦПА, составила 91,29% (n = 3, SD = 1,86), в то время как для консервированных в жидком азоте жизнеспособность составила 90,07% (n = 3, SD = 1,64). Статистический анализ не выявил существенной разницы между двумя методами (p > 0,05). Однако одномоментный метод криоконсервации оказался более быстрым и удобным. Эти результаты свидетельствуют о том, что одноступенчатый метод криоконсервации является превосходной альтернативой для сохранения клеток.

Эффект криоконсервации CPA на PBHSC превосходит традиционный метод криоконсервации
Клеточная жизнеспособность криоконсервированных ПГГСК после восстановления была обнаружена с помощью анализов AO/PI и Annexin V/PI. Как показано на рисунке 2, жизнеспособность клеток шести восстановленных образцов ПБДГСК, сохраненных с помощью CPA, составила 89,38% (n = 6, SD = 1,87, рисунок 2B) и 88,20% (n = 6, SD = 2,72, рисунок 2C) соответственно в этих двух анализах. Тем не менее, те, которые сохранились с помощью TCPA, составили 79,55% (n = 6, SD = 3,16, рисунок 2B) и 73,05% (n = 6, SD = 7,47, рисунок 2C). Эти результаты свидетельствуют о том, что CPA является более эффективным криопротектором для PBHSC по сравнению с TCPA, что приводит к лучшему сохранению жизнеспособности клеток и скорости восстановления.

ПГГСК, законсервированные с помощью CPA, сохраняют полную структуру цитоскелета и митохондриальную активность
Узкое определение цитоскелета относится к сети белковых волокон, микротрубочек (МТ), микрофиламентов (МФ) и промежуточных филаментов (ИФ) в эукариотических клетках34. В этом исследовании мы в основном изучали структурную целостность МТ и МФ после криоконсервации ПГХСК, чтобы доказать, что ПБГСК могут сохранять целостность цитоскелета после криоконсервации ЦПА. Для маркировки структур микрофиламентов и микротрубочек живых клеток в качестве флуоресцентных зондов использовали циклический пептид флуоресцентной ручки-призрака Alexa Fluor 488 и аналоги Taxol, меченные флуоресцентными группами в дальнем инфракрасном диапазоне, соответственно. Как показано на рисунках 3A, B, PBHSC, сохраненные с помощью CPA, все еще сохраняют неповрежденные структуры микрофиламентов и микротрубочек.

Митохондрии ПГБГСК, сохраненные с помощью ЦПА, были помечены раствором красителя родамина 123, а ПГБСК, обработанныеН2О2 , использовали в качестве положительного контроля. Результаты (рис. 3C) показали, что митохондриальная структура наблюдалась в клетках, сохраненных CPA, в то время как в положительной контрольной группе она не наблюдалась. Меченые родамином 123 митохондрии также были обнаружены с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что ПГХСК, сохраненные CPA, сохраняют лучшую митохондриальную активность, чем традиционный метод (рис. 4).

PBHSC, сохраненные с помощью CPA, сохраняют возможность формирования клонов
Кроме того, мы оценили пролиферативную и дифференцировочную способность ПГГСК, сохраненных с помощью ЦПА и ТКСА, путем проведения колониеобразующих анализов. В частности, мы оценили способность ПХГСК образовывать колонии BFU-E, CFU-E, CFU-GM и CFU-GEMM в культуре. Общее количество колоний, наблюдаемых в группе свежих клеток, составило 70,33 (n = 6, SD = 14,02). Напротив, группа CPA показала в общей сложности 65,33 колонии (n = 6, SD = 8,07), в то время как группа TCPA показала значительно меньшее количество колоний — 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Эти результаты демонстрируют, что ПГГСК, сохраненные с помощью CPA, сохранили свои пролиферативные и дифференцировочные способности по сравнению с контролем свежих клеток, о чем свидетельствует аналогичное количество колоний в различных клеточных линиях. Напротив, у ПГБСК, сохраненных с помощью ТКСА, наблюдалось снижение их пролиферативного и дифференцирующего потенциала. Эти результаты указывают на то, что PBHSC, криоконсервированные с помощью CPA, лучше сохраняют свои функциональные возможности (рис. 5 и рис. 6).

Оценка безопасности CPA in vitro
Проводили in vitro мониторинг гемолиза эритроцитов кроликов. Чтобы проверить влияние различных объемов CPA (в диапазоне от 0,1 до 0,5 мл) и нормального физиологического раствора (в диапазоне от 2,0 до 2,4 мл) на гемолиз, 2,5 мл 2% суспензии RBC кролика добавляли в стеклянные пробирки вместе с CPA или обычным физиологическим раствором. Также были включены отрицательный контроль (стерилизованная вода для инъекций) и положительный контроль (обычный физиологический раствор). В пробирках, содержащих CPA или обычный физиологический раствор, эритроциты располагались на дне пробирки, а верхний раствор был прозрачным и бесцветным. После встряхивания эритроциты равномерно диспергировались. Положительная контрольная группа (стерилизованная вода) показала ярко-красный цвет, расслоения не наблюдалось, на дне пробирки оставалось лишь небольшое количество эритроцитов (рис. 7). Эти результаты свидетельствуют о том, что ЦПА не вызывают гемолиза или конденсации кроличьих эритроцитов. Сосудистое раздражение ЦПА оценивали у новозеландских кроликов. Патологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ПЭ), а после окончательного введения проводили общеклинические и местные наблюдения за раздражением. У подопытных животных не наблюдалось аномальных реакций, а также патологических изменений в местах местного введения. Эти результаты указывают на то, что CPA не вызывает раздражения сосудов у новозеландских кроликов.

В эксперименте по активной системной гиперчувствительности у морских свинок для сенсибилизации животных применяли ЦПА с внутрибрюшинными инъекциями 1,25 мл/кг и 2,5 мл/кг 3 раза и внутривенными инъекциями 2,5 мл/кг и 5 мл/кг для возбуждения. В течение 21 дня после последней сенсибилизации у морских свинок не наблюдалось быстрой гиперчувствительности, что указывает на то, что CPA не вызывает быстрой анафилаксии у морских свинок (Таблица 2).

Острая системная токсичность оценивалась у мышей ICR. Пяти экспериментальным мышам и пяти контрольным мышам вводили CPA и физиологический раствор в дозе 50 мл/кг массы тела. Реакции опытной группы были не больше, чем в контрольной группе. Судорог или лежания лицом вниз не наблюдалось ни в одной из групп, и не наблюдалось никаких других аномальных симптомов. Кроме того, не было существенной потери веса ни в одной из групп. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЦПА не проявляют острой системной токсичности для мышей ICR (Таблица 3 и Таблица 4).

Оценка аутотрансплантации ПБДГСК, сохраненных с помощью CPA
Для оценки эффективности трансплантации ПГГСК, консервированных с ЦПА, для лечения заболеваний крови было набрано шесть пациентов, а ПГГСК, сохраненные с ЦПА, были пересажены пяти пациентам. Трансплантация была успешной у всех, кроме одного пациента, который получил еще одну аллогенную трансплантацию из-за рецидива заболевания. В качестве маркеров успешной трансплантации использовали количество нейтрофилов ≥ 0,5 x 109 клеток/л и количество тромбоцитов ≥ 20 x 109 клеток/л.

Образцы b, c и e были трансплантированы соответствующим пациентам с лимфомой, а цикл функциональной реконструкции составил 9 дней, 9 дней и 10 дней соответственно. Образцы a и f были транспланплантированы пациентам с острым миелоидным лейкозом, а цикл функциональной реконструкции составил 36 дней и 16 дней соответственно. Пациенты получали другое лечение в связи с рецидивом заболевания. За исключением данных, связанных с нарушением гемопоэтической и иммунной регенерации в результате инфекции в течение 36 дней, среднее время до успешной трансплантации в пяти случаях составило 11 дней, при этом количество нейтрофилов и тромбоцитов соответствовало требуемым нормам. Эта продолжительность короче, чем 12,5-дневный цикл восстановления кроветворения, описанный в предыдущей литературе19. В нашем исследовании, при аналогичных периодах восстановления, конечная концентрация ДМСО в составе ЦПА составляла всего 2%, что заметно ниже, чемобычно упоминаемая концентрация в 3,5%. Что еще более важно, у пациентов не наблюдалось побочных реакций, что еще раз подтверждает безопасность и эффективность нашего метода сохранения гемопоэтических стволовых клеток в клиническом применении (табл. 5).

Субпопуляционный анализ ПГГСК показал, что клеточная субпопуляция общих лимфоидных предшественников (CLP) и мегакариоцитов/эритроцитарных предшественников (MEP) в ПГХСК, сохраненных с помощью CPA, была выше, чем при традиционной схеме. Тем не менее, клеточная субпопуляция гранулоцитарных/макрофагальных предшественников (ГМФ) существенно не отличалась. Эти результаты могут объяснить более быстрое восстановление кроветворения и иммунитета, наблюдаемое у пациентов, получавших лечение (Рисунок 8A-C).

figure-results-1
Рисунок 1: Модели иерархии кроветворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
(A) Жизнеспособность ПГГСК, сохраненных одноступенчатым методом с CPA, составила 91,29% (SD = 1,86), а консервированных методом жидкого азота составила 90,07% (SD = 1,64), p > 0,05 по отношению к одноэтапному методу криоконсервации и методу криоконсервации жидким азотом. (B) Коэффициент извлечения ПБДГСК, хранящихся с CPA, составил 89,38% (n = 6, SD = 1,87), что значительно выше, чем коэффициент восстановления 79,55% ПБДГСК, хранящихся с TCPA (n = 6, SD = 3,16), измеренный с помощью обнаружения AO/PI. (C) Жизнеспособность восстановления ПГБСК, сохраненных с помощью CPA, составила 88,20% (n = 6, SD = 2,72), что было значительно выше, чем жизнеспособность 73,05% ПБДГСК, сохраненных с помощью TCPA (n = 6, SD = 7,47), измеренная с помощью обнаружения Annexin V/PI после восстановления. P<0.01 (T-критерий) по CPA и TCPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Структурный анализ PBHSC, сохраненных с помощью CPA и TCPA. (А) Структура микрофиламентов ПГГСК, включая группу свежих клеток, группу CPA, группу TCPA и положительную контрольную группу, визуализированную с помощью циклического пептида флуоресцентной ручки-призрака Alexa Fluor 488. (В) Структура микротрубочек ПГГСК, включая группу свежих клеток, группу CPA, группу TCPA и положительную контрольную группу, визуализируемую аналогами Таксола, меченными флуоресцентными группами в дальнем инфракрасном диапазоне. (C) Митохондриальная активность ПГГСК, меченных родамином 123 (включая группу свежих клеток, группу CPA, группу TCPA и положительную контрольную группу), определяли с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Функциональный анализ PBHSC, сохраненных с помощью CPA и TCPA. Митохондриальная активность ПГХСК, включая группу свежих клеток, группу CPA, группу TCPA и положительную контрольную группу, обнаруженную с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Тест на потенциал колониеобразования. Колониеобразующий потенциал ПХГСК, сохраненных с помощью ХПА, ТКСА, включая КОЕ-Э, БФУ-Э, КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ, по сравнению со свежими ПХГСК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Общее количество колоний. Общее количество колоний в группе свежих клеток составило 70,33 (n = 6, SD = 14,02), общее количество колоний в группе CPA — 65,33 (n = 6, SD = 8,07), а общее количество колоний в группе TCPA — 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Оценка безопасности CPA с помощью испытаний на животных. Репрезентативные изображения, сделанные с 10-кратным разрешением, показаны в форматах A1-B2. (А, Б) Оценка сосудистого раздражения CPA у новозеландского кролика. А1 и В1 представляли собой патологоанатомические разрезы тканей отрицательной контрольной группы, подготовленные через 72 ч и 14 дней после последнего введения, соответственно. А2 и В2 представляли собой патологоанатомические разрезы тканей в группе ХПА, подготовленные через 72 ч и 14 дней после последнего введения, соответственно. (В) Мониторинг in vitro гемолиза эритроцитов кроликов. Пробирки с маркировкой a-e представляли группу CPA, пробирки с маркировкой f были отрицательной контрольной группой, а пробирки с маркировкой g были положительной контрольной группой. В группе КПА и отрицательной контрольной группе гемолиз не наблюдался, в то время как в группе положительного контроля гемолиз происходил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Анализ субпопуляций PBHSCs. (A) CLP, (B) MEP и (C) от 6 пациентов с сохраненными CPA и TCPA. (A) Средние коэффициенты CLP для CPA и TCPA составили 16,38% (n = 6, SD = 13,53) и 8,97% (n = 6, SD = 7,88), субпопуляция CLP в PBHSC, замороженных в CPA, была выше, чем в TCPA. p > 0,05 (Т-критерий) по отношению к CPA и TCPA. (B) Средние коэффициенты MEP для CPA и TCPA составили 61,07% (n = 6, SD = 12,85) и 55,4% (n = 6, SD = 11,37), субпопуляция MEP в PBHSC, замороженных в CPA, была выше, чем в TCPA. p > 0,05 (Т-критерий) по отношению к CPA и TCPA. (C) Средние коэффициенты GMP для CPA и TCPA составили 62,68% (n = 6, SD = 8,20) и 64,70% (n = 6, SD = 11,66), субпопуляция GMP в PBHSC, замороженных в CPA, была выше, чем в TCPA. p > 0,05 (Т-критерий) по отношению к CPA и TCPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Составляющие CPAКоэффициент концентрацииКомпоненты TCPAКоэффициент концентрации
Диметилсульфоксид4% (v/v)Диметилсульфоксид10% (v/v)
Человеческий альбумин5% (м/в)Человеческий альбумин5% (м/в)
Глюкоза2% (м/в)--
Декстран 402% (м/в)--
Глицерофосфат натрия0,5% (м/в)--

Таблица 1: Компоненты и соотношение концентраций CPA и TCPA.

ГруппаКоличество животныхКоличество животных с разной степенью гиперчувствительности
ОтрицательнаяСлабо позитивныйПоложительнаяСильный позитивЧрезвычайно сильный позитив
Негативный контроль880000
Положительный контроль800053
CPA низкая дозировка880000
Высокая дозировка CPA880000

Таблица 2: Реакции гиперчувствительности у морских свинок после лечения ЦПА. В группе отрицательного контроля, группе с низкой дозой CPA и группе с высокой дозой CPA наблюдались негативные реакции гиперчувствительности. Напротив, у всех морских свинок в положительной контрольной группе наблюдались сильные положительные реакции гиперчувствительности, а у трех морских свинок наблюдалась анафилаксия.

ГруппаНумерацияДозировка при введении (мл)Вес (г)
0 ч24 ч48 ч72 ч
Негативный контроль11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Экспериментальная группа21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Таблица 3: Сводка по весу мышей в эксперименте по острой токсичности. В группе отрицательного контроля и опытной группе не наблюдалось существенной потери массы тела после приема препарата. Масса всех подопытных животных постепенно увеличивалась в разумных пределах после обычного кормления в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч после введения.

ГруппаНумерацияДозировка при введении (мл)Время наблюдения
4 ч24 ч48 ч72 ч
Негативный контроль11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Экспериментальная группа21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Таблица 4: Наблюдение за острой системной токсичностью у мышей. В таблице, - означает отсутствие острых реакций системной токсичности. В отрицательной контрольной и опытной группах не наблюдалось острых реакций системной токсичности после приема в течение 4 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после введения.

Характеристика пациентаНаши исследованияСообщается в литературе
N652
Возраст53 (35-61)55 (21-66)
МИЛЛИМЕТР024
HL223
ОМЛ20
CGHL/NHL10
ПМБЛ/НХЛ10
Другой тип заболевания05
На основе лучевой терапии234
На основе химиотерапии318
Нет. трансплантированных CD34+ клеток (106 /кг)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 /л восстановления (медиана дня, диапазон, аномальные данные были исключены)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /л восстановление (медиана дня, диапазон, аномальные данные были исключены)11 (9-16)12.5 (0-19)
Тошнота015
Рвота04
Головокружение01
Любые осложнения020

Таблица 5: Статистика данных ТГСК. Особенности пациента и восстановление кроветворения после ТГСК.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы оценивали новую CPA для криоконсервации PBHSC. Результаты показывают, что CPA повышает сохраняемую жизнеспособность PBHSC по сравнению с TCPA. В частности, жизнеспособность восстановления ПГСК, сохраненных с помощью CPA, превысила таковую у TCPA более чем на 10%. В стволовых клетках целостность цитоскелета является основным требованием для поддержания активности и дифференцировочной функции стволовых клеток35,36. На клеточном уровне мы заметили, что структуры микрофиламентов и микротрубочек в ПБДГСК, сохраненных с помощью CPA, были более интактными, чем в группе TCPA, с заметно более четкими структурами микротрубочек. Митохондрии – это энергетическая фабрика клеток. Митохондрии принимают непосредственное участие в клеточном дыхании, обмене веществ и других жизненных процессах, которые являются важными органеллами дляподдержания клеточной активности. Митохондриальная активность является важнейшим показателем функции гемопоэтических стволовых клеток после криоконсервации и восстановления. С точки зрения митохондриальной активности, группа CPA продемонстрировала сходство со свежими PBHSC. Прямое наблюдение за митохондриальными комплексами показало, что их количество в группе CPA превосходит количество в группе TCPA. Кроме того, для количественной оценки сохраненной митохондриальной активности в каждой группе была использована проточная цитометрия. Результаты не показали существенной разницы между группами CPA и свежими клетками, но активность была на 8,5% выше в группе CPA по сравнению с группой TCPA. Это сравнение данных о митохондриальной активности подтверждает выводы о жизнеспособности клеток. Кроме того, анализ образования колоний показал, что ПБДГСК, сохраненные с ЦПА, сохраняют свой потенциал дифференцировки. В группе CPA было выявлено большее количество колоний после индукции, что еще раз подтверждает превосходную эффективность сохранения CPA.

Целью данного исследования было применение КПА к клинической ТГСК для улучшения активности ПГХСК после сохранения и обеспечения успешности трансплантации. Перед применением CPA в клинических исследованиях были проведены оценки безопасности на экспериментальных животных, что обеспечило информационную поддержку безопасности CPA в клиническом применении. Предыдущие исследования показали, что некоторые новые CPA были определены как лучшая технология криоконсервации эндотелиальных клеток (MHECT-5) и эмбрионов38,39. При клиническом применении ЦПА для сохранения ПГГСК мы успешно криоконсервировали ПГХСК от шести пациентов с ТГСК. Примечательно, что одноэтапный метод криоконсервации с использованием CPA значительно упростил процесс сохранения образцов. В этом методе, по сравнению с ранее описанными методами одноэтапной криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток, использовалась более низкая концентрация ДМСО, что является значительным достижением для клинического применения. Из шести пациентов пятеро успешно перенесли трансплантацию. Оставшийся пациент получал альтернативное лечение в связи с рецидивом заболевания. Проведена статистическая оценка цикла функциональной реконструкции у пяти пациентов, которым была выполнена трансплантация. За исключением одного случая, когда цикл восстановления был продлен из-за инфекции, среднее время восстановления кроветворных и иммунных функций составило 11 дней, что быстрее, чем 12,5 дней, приведенных в предыдущей литературе. Важно отметить, что в процессе трансплантации не наблюдалось никакой токсичности. Этот результат особенно примечателен, если учесть, что конечная концентрация ДМСО в методе CPA составила всего 2% по сравнению с 10% (v/v) концентрацией, используемой в методе TCPA. Такое успешное использование более низкой концентрации ДМСО в ЦПА для минимизации побочных эффектов подтверждает нашу стратегию и имеет жизненно важное значение для клинической эффективности.

В свете ускоренного функционального восстановления, наблюдаемого в нашем исследовании, мы дополнительно изучили потенциальные различия в количестве перелитых CD34+ клеток. Статистический анализ показал, что количество перелитых CD34+ клеток составляло, в среднем, 2,4 х 106 клеток/кг, что ниже показателей, приведенных в предыдущей литературе40. Это привело нас к гипотезе о том, что CPA может обеспечить превосходную защиту для определенных субпопуляций в PBHSC, которые имеют решающее значение для восстановления гемопоэза и иммунитета. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы провели подробный анализ субпопуляций CLP, GMP и MEP в PBHSC, сохраненных как CPA, так и TCPA. Результат показал, что субпопуляции CLP и MEP в PBHSC, сохраненных с помощью CPA, увеличились по сравнению с теми, которые были сохранены с помощью TCPA, при этом не было существенной разницы в субпопуляции GMP. CLP может дифференцироваться в Т-клетки, В-клетки и NK-клетки в организме человека; повышенная доза CLP может ускорить восстановление иммунитета33. MEP может дифференцироваться в эритроциты и тромбоциты41. Глицерофосфат натрия в CPA усиливает синтез митохондриальной АТФ через глицерофосфатный челнок, устраняя дефицит энергии, вызванный криоконсервацией. Это имеет решающее значение для клеток CLP, которые полагаются на гликолиз для дифференцировки лимфоидов42. Кроме того, высокое стандартное отклонение жизнеспособности TCPA оказалось выше, чем у CPA (7,47 против 2,72, рис. 3), что указывает на вариабельность результатов TCPA, что может быть связано с нестабильными условиями замораживания. Таким образом, мы предполагаем, что улучшенная сохранность CLP и MEP может быть решающим фактором в сокращении времени восстановления кроветворной и иммунной функции. Превосходные защитные эффекты CPA в подгруппах CLP и MEP, по-видимому, способствуют более быстрой функциональной реконструкции во время клинической трансфузионной терапии. Это не только улучшает терапевтические результаты, но и снижает продолжительность и стоимость лечения пациентов, перенесших трансплантацию. По сути, наш метод предлагает более экономичный подход к ТГСК, оптимизируя как клинические, так и экономические аспекты ухода за пациентами.

Несмотря на продолжающиеся исследовательские усилия по выявлению веществ, которые могли бы заменить ДМСО, поиск альтернатив остается сложной задачей. Несмотря на сообщения о новых технологиях и веществах, появляющихся в этой области43,44, строгие демонстрации безопасности этих новых соединений in vitro все еще отсутствуют. Аналогичным образом, нет достаточных доказательств для подтверждения их безопасности и эффективности для клинического использования, особенно в отношении изучения примесей. Таким образом, эти новые вещества требуют обширной валидации, прежде чем их можно будет применять в клинических условиях. В этом контексте мы считаем, что оптимизация использования ДМСО при обеспечении эффективной сохранности клеток по-прежнему остается наиболее жизнеспособной стратегией для клинического применения. Предыдущие исследования подчеркнули роль челочного перемещения глицерофосфата в производстве АТФ и регуляции митохондриальной активности в клетках45,46. Исходя из этого понимания, мы предполагаем, что включение глицерофосфата натрия в CPA может послужить эффективной стратегией для замены значительной части ДМСО, традиционно используемого в TCPA в качестве осмотического защитного агента. Нет упоминания о недавних исследованиях альтернатив с низким содержанием диметилсульфоксида, что предполагает некоторую новизну в этом методе.

В целом, основные этапы нашего протокола криоконсервации включают: (i) точный контроль концентрации ДМСО на уровне 2% (v/v), (ii) контролируемую скорость охлаждения -1 °C/мин и (iii) быстрое размораживание на водяной бане при температуре 37 °C. Эти этапы обеспечивают минимальное осмотическое напряжение и образование кристаллов льда. В частности, сниженная концентрация ДМСО непосредственно решает проблемы цитотоксичности, связанные с традиционными 10% растворами ДМСО47. Контролируемое охлаждение предотвращает повреждение внутриклеточного льда, что подтверждено криоконсервацией мезенхимальных стволовых клеток48, в то время как быстрое размораживание сохраняет функцию митохондрий, что является критическим фактором для жизнеспособности после размораживания49. Мы оптимизировали три аспекта: (i) Метод смешивания: первоначальные испытания выявили агрегацию клеток при добавлении CPA; Переход на капельное перемешивание с вихревым движением при 500 об/мин исключил комкообразование. (ii) Протокол окрашивания: предварительная промывка клеток PBS, содержащей 0,05% Tween-20, улучшила эффективность проникновения антител на 18%. (iii) Постоянство размораживания: внедрение стандартизированного 120-секундного окна размораживания предотвратило вариабельность показателей восстановления (± 2% против ± 7% в пилотных исследованиях). Для таких распространенных проблем, как низкое количество колоний, увеличение объема среды MethoCult до 2 мл на чашку и контроль влажности (>95%) решили эту проблему, приведя ее в соответствие со стандартами культуры гемопоэтических предшественников50. Следует обратить внимание на два ограничения: (i) Систематическая ошибка субпопуляции: в то время как CPA эффективно сохраняет подгруппы CLP и MEP, редкие популяции, такие как CD34+CD38-CD90+ долгосрочные ГСК, демонстрируют на 12% более низкое восстановление по сравнению с новым контролем (p = 0,03). (ii) Для оценки целостности цитоскелета, основанной на качественных изображениях, некоторые количественные метрики (например, интенсивность флуоресценции, структурные баллы) должны быть включены в более надежные анализы. Наш метод CPA совершенствует существующие методы за счет: (i) повышения безопасности: скорость гемолиза снизилась с 8,2% (TCPA) до 1,5% (CPA) через 24 часа после размораживания (p < 0,001). (ii) Функциональное превосходство: клетки, сохраненные CPA, показали на 23% более высокое образование колоний CFU-GEMM по сравнению с TCPA, что имеет решающее значение для многолинейного приживления51. (iii) Клиническая эффективность: Успешность трансплантации с помощью 2,4 x 106 CD34+ клеток/кг (по сравнению со стандартным литературным ≥ 4 x 106) свидетельствует об усилении потенции. Эта технология перспективна для: (i) Генно-модифицированного хранения ГСК: митохондриальная защита CPA может стабилизировать клетки, отредактированные с помощью CRISPR, во времякриоконсервации. (ii) Банкирование органоидов: предварительные данные показывают 89% жизнеспособности кишечных органоидов, сохраненных CPA, по сравнению с 54% в TCPA (n=3). (iii) Глобальные распределительные сети: более низкое содержание ДМСО позволяет проводить испытания при температуре окружающей среды с использованием материалов с фазовым переходом53.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было поддержано Проектом финансовой поддержки строительства ключевых медицинских дисциплин района Наньшань, Крупным проектом науки и техники системы здравоохранения района Шэньчжэнь Наньшань (No. NSZD2023018) и Ключевой лабораторией медицинской трансформации ядерных технологий NHC (Центральная больница Мяньяна; Грант No.2023HYX033).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка для клеточных культур 35 ммLABSELECT12111
Acridine Orange/PROPIDIUM IODIDECountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Настольный автоматический цитометр с изображениемCountstarRigel-S2
Решение для сохранения клеток XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
КолхицинBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM880
Цитохалазин BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI Набор для окрашиванияBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Проточный цитометрBDFACSLFortessa
Glycerol   AMRESCO854
Альбумин человекаSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Перекись водородаSigma-AldrichH1009
Иммуноокрашивающий буфер для промывкиBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Инвертированный микроскопNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Физиологический растворBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Йодид пропидиумаBDBDB556463
Родамин 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-cycle CO2-инкубаторThermo Fisher Scientific371
Vortex MixerNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.ДМТ-201ЗТ
YB020050 YB020100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи