Методическая статья

Индуцируемый синим светом полуслучайный мутагенез на специфической экзогенной ДНК в штамме Escherichia coli BL21

692 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68283

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

В этой статье

Краткое содержание

Изложенный протокол описывает оптимизированные методы распознавания любой экзогенной ДНК при генерации мутаций только на тех экзогенных ДНК в Escherichia coli.

Аннотация

Технологии мутагенеза широко используются в вариационной селекции, направленной эволюции и белковой инженерии. Тем не менее, большинство методов могут вызвать только случайные геномные мутации ДНК, которые не поддаются контролю, что приводит к деформациям или даже летальным эффектам. В данном случае, используя слияние трех систем: редактора цитозиновых оснований (CBE), индуцируемых синим светом элементов p-Mag/n-Mag и расщепленной РНК-полимеразы T7, этот метод включает в себя управляемую синим светом, специфичную для региона ДНК, полуслучайную систему мутагенеза.

Эта система может мутировать цитозин в тимин на ДНК, начиная от промотора Т7 и заканчивая терминатором Т7. Любой экзогенный ген, расположенный ниже промотора Т7, может быть потенциально мутирован. Эти инструменты также были разработаны в двух частях, чтобы сделать систему управляемой синим светом. Первая часть была создана путем слияния CBE с n-Mag и геном N-концевой РНК-полимеразы T7. Вторая часть включала в себя слияние p-Mag с C-концевой РНК-полимеразой T7. Под действием синего света эти две части были собраны таким образом, чтобы функционировать в качестве генератора мутаций на ДНК между промотором Т7 и терминатором Т7. Без синего света p-Mag отделяется от n-Mag, освобождая CBE от редактирования ДНК.

Целью этого протокола является генерация регион-специфичных случайных мутаций в Escherichia coli с контролем синего света и дальнейшая валидация мутировавших плазмид. Система может быть адаптирована к эволюционной системе in vivo , в которой может быть выбрана функция интересующего гена и собраны желаемые мутации для дальнейшего изучения.

Введение

Случайные мутации и естественный отбор являются ключевыми силами, движущими эволюцией, которая породила большие генетические вариации между видами. Эволюционный процесс был использован в качестве мощного инструмента для создания белков с оптимизированными или новыми функциями1. Частота естественных мутаций в результате репликации ДНК была оценена примерно в 1 к 109 основаниям на деление клетки у множественных прокариот и эукариот2. Низкая частота естественных мутаций делает нецелесообразным создание большого генетического разнообразия в лабораториях. Исследования были сосредоточены на разработке методов, которые увеличивают частоту мутаций, чтобы охватить как можно больше участков в данном гене в течение разумного периода времени.

Множественные системы были разработаны для достижения более высоких частот мутаций в лабораторных исследованиях эволюции 3,4,5,6,7,8,9,10. Эволюционные системы in vitro используют подверженную ошибкам ПЦР, сайт-направленный мутагенез сатурации или дизайн вычислительной библиотеки для введения мутаций в гены, представляющие интерес1. Библиотеки ДНК преобразуются в клетки-хозяева, где белковые продукты проходят скрининг или отбор. Этапы мутагенеза и отбора в эволюции in vitro не связаны друг с другом, что ограничивает эффективность и масштаб популяций, которые могутбыть созданы. Эволюционные системы in vivo преодолели ограничения, внедрив системы мутаций в клетки и соединив этапы мутагенеза и отбора, чтобы обеспечить непрерывную эволюцию. Ранее в методах мутагенеза in vivo использовались химические мутагены 3,4 и штаммы-мутаторы 5,6. Тем не менее, эти методы страдают от низкой частоты мутаций, отсутствия контроля и узкого или неравномерного мутационного спектра12. В ходе недавних исследований были разработаны новые и усовершенствованные системы эволюции in vivo, представленные OrthoRep, ортогональной системой репликации ДНК, подверженной ошибкам 7,8; MutaT7, слияние цитидиндезаминазы с Т7 РНК-полимеразой9; и EvolvR, слияние никазы Cas9 с подверженной ошибкам ДНК-полимеразой10. Эти методы имеют разные клетки-хозяева, целевой контекст и простоту реализации.

РНК-полимераза Т7 (РНК Т7), ключевой компонент системы MutaT7, была широко изучена и разработана в области синтетической биологии. Фрагменты T7 RNAP были совместно экспрессированы на разных уровнях в разные моменты времени для создания распределителя ресурсов13. Для создания логического вентита14 И был сконструирован расщепленный Т7 РНКП с С-концевыми фрагментами различной промоторной специфичности. Способность фрагментов Т7 РНКП собираться для восстановления функциональной полимеразы привела к разработке биосенсоров, активируемых светом и малыми молекулами, в которых димеризация партнеров по взаимодействию, слитых с каждым из N- и С-концев Т7 РНКП, генерирует транскрипционный выход15. Расщепленная РНК T7 также была слита с доменами n-Mag и p-Mag для создания индуцируемого светом контроля экспрессии генов в Escherichia coli16. При активации синим светом магнитные домены димеризуются, приближая два домена расщепленной РНК Т7 пространственно к выполнению полимеразной функции. Эта система обеспечивает точный пространственно-временной контроль экспрессии генов с низкой базальной экспрессией и большим динамическим диапазоном.

В данной статье представлен протокол построения управляемой синим светом полуслучайной системы мутагенеза in vivo (рис. 1). Он построен на дезаминазе rAPOBEC1, слитой с n-Mag-N-T7 RNAP. Коэкспрессия p-Mag-C-T7 RNAP из той же плазмиды позволяет контролировать активность полимеразы и редактирования оснований в синем свете. Система сочетает в себе базовую производительность редактирования rAPOBEC1 с управляемым световым разделением T7 RNAP. Он был валидирован на E. coli с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве гена-мишени, где его интенсивность выбирается с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). По сравнению с оригинальной системой MutaT7, наша система, управляемая синим светом, вводит полуслучайные мутации в ген-мишень путем модуляции светового интервала. Вместо того, чтобы превращать весь цитозин в урациловые основания в гене-мишени, он генерирует более широкий профиль мутаций, редактируя подмножество нуклеотидов с помощью светового контроля. Система может быть легко адаптирована к системе эволюции in vivo , где GFP может быть заменен другими генами, представляющими интерес, а функция может быть выбрана в зависимости от приспособленности или выживания клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В следующем протоколе описано, как выполнить дизайн экзогенного мутагенеза ДНК с использованием системы мутагенеза полимеразы CBE-Mag-T7 (шаг 1). После того, как экзогенная ДНК-плазмида сконструирована, описываются этапы трансформации двух плазмид для экспрессии мутагенеза полимеразы CBE-Mag-T7 в штамме E. coli BL21 путем добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранизида (IPTG) с последующим облучением синим светом, инициирующим мутагенез (этапы 2-9.2). Этапы контроля качества для оценки того, сколько мутаций было сгенерировано в GFP или экзогенной ДНК, были выполнены с использованием секвенирования по Сэнгеру (шаги 9.3-11.2).

1. Спроектировать экзогенную ДНК и построить систему мутагенеза полимеразы CBE-Mag-T7

  1. Найдите экзогенную ДНК или секвенирование кДНК с помощью онлайн-инструментов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene или https://www.uniprot.org/).
    Примечание: Здесь мы использовали последовательность GFP в качестве экзогенной ДНК для мутагенеза цитозина.
  2. Замените ДНК gfp на интересующую вас ДНК с помощью соответствующего набора для клонирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем NheI для удаления ДНК gfp из исходной плазмиды в наборе для сборки колонии ДНК. Альтернативой является работа с компаниями по синтезу ДНК. Последовательность плазмид приведена в Дополнительном файле 1 .
  3. Синтезировать все гены вместе с системой мутагенеза полимеразы CBE-Mag-T7 и включить их в остов pET-11a с устойчивостью к ампициллину.
    Примечание: Мы работали с компанией по синтезу ДНК для создания этой плазмиды, и мы получили глицериновые бактерии, содержащие нашу целевую плазмиду.

2. Активация бактериального штамма

  1. Нанесите пипеткой 10 мкл глицериновых бактерий на край агаровой пластины LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Распределите бактерии из этого места по пластине с помощью стерильной петли.
  2. Инкубируйте планшет вверх дном при температуре 37 °C в течение ночи в бактериальном инкубаторе.

3. Плазмидное усиление

  1. Выберите одну колонию из планшета и внесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл 15 мл среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
  2. Поместите культуру в встряхивающий инкубатор при температуре 37 °C, 180 об/мин в течение 14-16 часов.

4. Экстракция плазмид

  1. Возьмите 5-15 мл бактериальной культуры на ночь и переложите ее в центрифужную пробирку. Центрифугировать при 18 894 × г в течение 1 мин.
  2. Соберите бактериальную гранулу и тщательно удалите всю надосадочную жидкость. Ресуспендируйте бактериальную гранулу в 500 мкл буфера для ресуспензии путем вортексирования или пипетирования.
  3. Добавьте в пробирку 500 мкл буфера для лизиса, аккуратно перемешайте, перевернув пробирку в 8-10 раз, и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы лизировать клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите полный лизис, убедившись, что не осталось видимого белого флокулянта.
  4. Добавьте 200 мкл уравновешивающего буфера в спиновую колонку, помещенную в сборную трубку. Центрифугируйте при 18 894 × г в течение 2 мин и выбросьте проточный. Поместите колонку обратно в пробирку для сбора.
  5. Добавьте 500 μL нейтрализационного буфера к бактериальному лизату, аккуратно перемешайте, перевернув пробирку в 8-10 раз, пока не появится белый осадок, и оставьте при комнатной температуре на 5 минут.
  6. Центрифугируйте при 18 894 × г в течение 5 мин и перенесите надосадочную жидкость в фильтрующую колонну. Центрифугируйте при 18 894 × г в течение 1 мин для фильтрации раствора.
  7. Добавьте в отфильтрованный раствор в 0,3 раза больше объема изопропанола, перемешайте путем инвертирования. Переложите смесь на уравновешенную спиновую колонну.
  8. Центрифугируйте при 18 894 × г в течение 1 мин, выбросьте проточный поток и поместите колонку обратно в сборную трубку.
  9. Промойте колонку 750 μл промывочного буфера, центрифугируйте при 18 894 × г в течение 1 минуты и выбросьте проточный поток.
  10. Снова центрифугируйте колонку при 18 894 × г в течение 1 минуты, чтобы удалить остатки буфера для промывки.
  11. Поместите спиновую колонку в новую центрифужную пробирку. Добавьте 100-200 мкл элюирующего буфера в центр мембраны колонки. Дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 2-5 минут и центрифугируйте при 18 894 × г в течение 2 минут. Храните плазмидную ДНК при температуре -20 °C.

5. Плазмидная трансформация (химически компетентные клетки E. coli BL21)

  1. Возьмите 50 мкл размороженных BL21 химически компетентных клеток на льду. Добавьте 2 мкл плазмидной ДНК из шага 4.11 и аккуратно перемешайте. Выдерживать на льду в течение 30 минут.
  2. Тепловой шок при 42 °C в течение 45 с, затем немедленно перенесите трубку обратно в лед на 2 минуты.
  3. Добавьте 500 мкл стерильной среды LB в каждую пробирку. Инкубируйте при 37 °C, 180 об/мин в течение 1 ч для восстановления.
  4. Центрифугируйте при 1000 × г в течение 5 мин, отбросьте избыток надосадочной жидкости, оставив примерно 100 мкл. Ресуспендируйте клетки и планшет на LB агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Выдерживать вверх ногами при температуре 37 °C в течение ночи.

6. Экспрессирующий генератор мутации полимеразы CBE-Mag-T7 (неактивная форма)

  1. Выполните шаги 5.1-5.4. Перед распределением клеток равномерно нанесите 1 мМ ИПТГ на поверхность ЛБ-агара с ампициллином. Используйте деионизированную воду в качестве контроля для сравнения с группами, обработанными IPTG.
  2. После того, как все колонии будут выращены, отберите 10-20 колоний для культивирования в 5 мл LB среды, содержащей 1 мл IPTG в стеклянных пробирках с круглым дном по 100 мл с фенольным завинчивающимся колпачком и резиновым вкладышем при 16 °С, 180 об/мин в течение 8 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все колонии можно хранить при температуре 4 °C для кратковременного хранения, прежде чем переходить к шагу 7.

7. Активируйте генератор мутаций полимеразы CBE-Mag-T7

  1. Соберите бактерии в стеклянные пробирки объемом 100 мл с круглым дном и фенольным завинчивающимся колпачком и резиновым вкладышем и центрифугируйте в дозе 18 894 × г в течение 2 минут.
  2. Измените среду на среду LB без IPTG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для того, чтобы убедиться, что генератор мутаций полимеразы CBE-Mag-T7 не может редактировать сам себя. Мы разработали систему lacI/O для защиты кластеров генов полимеразы CBE-Mag-T7.
  3. Облучайте пластину одним облучателем синего света (470 нм, 4 мВт/см2) во время культивирования при 37 °C в течение заданного времени. Выполните секвенирование по Сэнгеру, чтобы проверить мутации и проверить, увеличивает ли более длительное воздействие частоту мутаций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы устанавливаем экспозицию синего света на 0, 8, 16 и 24 часа.

8. Отбор мутаций для повышения функции белка и продолжения мутагенеза

Примечание: Здесь мы используем ген gfp в качестве экзогенной ДНК для мутагенеза и ищем мутации, которые могут увеличить интенсивность флуоресценции белка GFP.

  1. Выберите колонии, обозначьте их положение на пластине и введите собранные колонии в 100 μл ddH2O.
  2. Перенесите 100 мкл бактериальной суспензии в 96-луночный планшет и считайте интенсивность GFP при Ex/Em = 488/510 нм.
  3. Повторяйте шаги с 6.3 по 9.2 до тех пор, пока не будут выявлены некоторые очевидные колонии.

9. Остановите мутагенез и проверьте мутации

  1. После проведения нескольких часов облучения синим светом переместите все бактерии обратно в темное место при температуре 4 °C еще на 15 минут.
  2. Выполните те же шаги по извлечению плазмиды, что описаны в шаге 4.
  3. Спроектируйте прямые и обратные капсюли для секвенирования по Сэнгеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT в качестве прямого праймера и TTACTTGTGTACAGCTCGTCCATGCCG в качестве обратного праймера для секвенирования по Сэнгеру.

10. Анализ данных и расчет частоты мутаций

  1. Просмотрите мутацию, открыв файл .ab1, и проверьте пики вручную.
  2. Анализируйте частоту мутаций с помощью онлайн-инструментов (например, инструмента Mutation Surveyor).
  3. Загрузите файл данных Сэнгера в онлайн-инструмент и начните анализ частоты мутаций.

11. Бактериальный глицериновый бульон

  1. Инокулируйте одну колонию в пробирку, содержащую 5 мл среды LB с 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать при 37 °C, 180 об/мин в течение 12-16 часов.
  2. Смешайте бактериальную культуру с 50% глицерином в соотношении 1:1. Аликвоту в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Хранить при температуре -80 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Методы, изложенные в этом протоколе, предназначены для создания мутаций на экзогенной ДНК с использованием расщепленного генератора мутаций РНК-полимеразы CBE-Mag-T7. Гены для построения мутационной системы РНК-полимеразы CBE-Mag-T7 и ген-мишень для мутагенеза включены в плазмидный остов pET-11a. Успешная трансформация и облучение синим светом были выполнены без какого-либо повреждения бактериальной геномной ДНК, о чем свидетельствует нормальная и сопоставимая численность колоний на LB-агаре (рис. 2<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инструмент редактирования оснований, управляемый полимеразой, был впервые создан Cravens et al. в 2021 году с использованием стратегии слияния белков17. Мутации на четырех нуклеотидах ДНК были успешно внедрены со скоростью более 10-4 мутаций на.н. Однако, поскольку мутации постоянно вносились между промотором Т7 и терминатором без дополнительногоконтроля со стороны исследователей, «хорошие» мутации не могли быть сохранены от прод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конические центрифужные пробирки 50 млСоколCLS352070
АмпициллинТермонаучные химикатыДж60977.14
Облучатель синего светаТорлабсLIU470A
Набор для клонирования сборок ДНК КЛЮВЭ5520С
Синтез ДНК/PrmersГеномика BGI
Набор EndoFree Plasmid Midi CWBIOCW2106SБуфер P1: буфер для ресуспензии, Буфер P2: буфер для лизиса, Буфер E3: буфер для балансировки, Буфер PS: буфер для нейтрализации, Буфер PW: буфер для промывки, Endo-Free Buffer EB: буфер для очистки ДНК, РНКаза A Endo-Remover FM: буфер для удаления эндотоксинов, Спин-колонки DM со сборными пробирками
ГлицеринФишер КемикалГ33-4
Инкубационный шейкерТермо СайентиалSK2001CPKG
ИПТГ (изопропилтио-&бета;-галактозид)Инвитроген15529019
Считыватель микропланшетовТермо СайентиалВариоскан ЛЮКС
Микроскоп ЛейкаDMI 4000B
ФК «Мультискан»Термонаучные химикаты
One Shot BL21(DE3) Химически компетентная E. coliИнвитрогенC600003
Набор для очистки миди-плазмид PureLink Fast с низким содержанием эндотоксиновИнвитрогенА36227
Пирекс  Сверхпрочные центрифужные пробирки с круглым дном, с фенольной винтовой крышкой и резиновым вкладышемCorning  8422CLS8422100

Ссылки

  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T7in vivo
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи