Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Посев H5N1-специфичных Т-клеток уток и выявление иммунных реакций методом внутриклеточного окрашивания цитокинов

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68291

⸱

30 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описывает метод культивирования птичьих Т-клеток in vitro путем выделения Т-клеток памяти от инфицированных уток, что позволяет получать высокоочищенные специфические Т-клетки уток. Кроме того, был разработан метод внутриклеточного окрашивания цитокинов (ИКС) для точного измерения секреции ИФН-γ в Т-клетках уток.

Аннотация

Культура Т-клеток in vitro является критически важным методом для изучения иммунных реакций, вирусных инфекций и потенциальных терапевтических стратегий. Тем не менее, до настоящего времени не сообщалось об установленных протоколах культивирования птичьих Т-клеток in vitro . В этом исследовании мы впервые представляем протокол, используя в качестве модели высокопатогенный вирус птичьего гриппа (HPAIV) H5N1. Здесь 4-недельные утки были инфицированы вирусом, а Т-лимфоциты памяти были выделены через 28 дней после заражения для культивирования H5N1-специфичных Т-лимфоцитов уток, что позволило исследовать специфический иммунный ответ на вирус H5N1. Ключевыми этапами протокола являются выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) памяти от инфицированных уток, активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) с оптимальной кратностью инфекции (MOI = 5) в течение 6 ч, а также приготовление питательных сред Т-клеток с добавлением рекомбинантного IL-2 и других специфических добавок. Пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитотоксическая активность тщательно контролировались на протяжении всего процесса. Кроме того, мы разработали протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов для количественной оценки секреции ИФН-γ в Т-клетках уток. Это включало в себя создание гибридомной клеточной линии, экспрессирующей антитела IgG3κ, специфичные к утиному ИФН-γ, с последующей успешной очисткой антител. Очищенное антитело разбавляли в соотношении 1:10 и применяли в проточной цитометрии для точного измерения секреции ИФН-γ. Этот метод является надежным инструментом для оценки реакции Т-клеток уток и закладывает основу для будущих исследований в области вирусной иммунологии птиц.

Введение

Процесс активации, пролиферации, дифференцировки и превращения Т-клеток в Т-клетки памяти занимает центральное место в антиген-специфических иммунных реакциях1. Первоначально Т-клетки активируются, когда их Т-клеточные рецепторы (TCR) распознают антигенные пептиды, представленные на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC) молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) 2,3. Этот процесс активации требует не только связывания TCR с молекулами MHC, но и координации костимулирующих сигналов, которые имеют решающее значение для полнойактивации функций Т-клеток. После активации Т-клетки быстро вступают в фазу пролиферации, производя многочисленные клоны, которые имеют ту же антигенную специфичность, что и исходные Т-клетки. Во время этой фазы пролиферации Т-клетки далее дифференцируются в зависимости от своей функции, в первую очередь в CD8+ Т-клетки и CD4+ Т-клетки5. Эти дифференцированные клетки опосредуют цитотоксическое убийство и помогают иммунным реакциям, соответственно. После первичной инфекции часть активированных Т-клеток трансформируется в долгоживущие Т-клетки памяти6. Эти Т-клетки памяти могут сохраняться в иммунной системе в течение длительного времени, быстро реагируя на тот же патоген при повторном воздействии. В результате они генерируют более сильный и эффективный иммунный ответ, обеспечивая долгосрочную иммунную защиту хозяина7. Весь этот процесс имеет решающее значение для разработки Т-клеточных вакцин, поскольку он помогает повысить эффективность и долговечность вакцины8.

В этом контексте выращивание антиген-специфических Т-клеток in vitro становится необходимым. Этот протокол был разработан на основе установленных методов культивирования in vitro Т-клеток человека с необходимыми адаптациями для иммунной системы птиц9. Выращивая эти клетки вне организма, исследователи могут изучать реакцию Т-клеток при различных иммунных состояниях, таких как активация, пролиферация, дифференцировкаи формирование памяти. Этот подход in vitro бесценен для понимания роли, которую Т-клетки играют в иммунных реакциях. Кроме того, в условиях культивирования in vitro можно контролировать секрецию цитокинов (таких как ИФН-γ) Т-клетками11,12. Этот мониторинг имеет решающее значение для оценки качества, интенсивности и стойкости иммунных реакций, а также для изучения взаимодействий между Т-клетками и другими иммунными клетками. Кроме того, экстракорпоральная экспансия антиген-специфичных Т-клеток in vitro обеспечивает крупномасштабное обогащение, повышает чувствительность обнаружения и улучшает оценку уровней ответа Т-клеток13. Таким образом, культура антиген-специфических Т-клеток in vitro служит мощным инструментом для лучшего понимания роли Т-клеток птицы в иммунных реакциях, что повышает чувствительность обнаружения и усиливает оценку уровней Т-клеточного ответа. В то время как подобные методы in vitro хорошо зарекомендовали себя в системах млекопитающих, применение таких методов у видов птиц остается ограниченным. Особенно это актуально в иммунологии птицы, где инструменты для анализа Т-клеточных ответов недостаточно развиты. Утки, в частности, служат естественными резервуарами для нескольких вирусов птичьего гриппа, но мало что известно об их антиген-специфическом Т-клеточном иммунитете. Таким образом, разработка стандартизированного протокола культивирования Т-клеток in vitro, адаптированного к птичьим системам, имеет важное значение для продвижения как фундаментальных исследований, так и прикладной иммунологии у домашней птицы.

Ключевым цитокином, участвующим в этих процессах, является ИФН-γ, интерферон II типа, продуцируемый в основном CD8+ Т-клетками, CD4+ Т-клетками 1 типа и NK-клетками14. ИФН-γ играет решающую роль в подавлении репликации вируса и регуляции иммунных реакций15. Уровень экспрессии ИФН-γ отражает иммунный статус и служит маркером активации Т-клеток, что позволяет исследователям оценивать уровни ответа Т-клеток через его экспрессию 16,17. Одним из распространенных методов определения экспрессии цитокинов в иммунных клетках является внутриклеточное окрашивание цитокинов (ИКС)18,19. Однако из-за ограничений в экспериментальных материалах и методах исследования уток отстают от исследований млекопитающих. В настоящее время многие исследователи полагаются на кПЦР для измерения уровня экспрессии ИФН-γ, хотя этот метод имеет определенныеограничения11. В нашей лаборатории мы успешно разработали антитело к ИФН-γ у уток, совместимое с проточной цитометрией. Основываясь на этом успехе, в этом исследовании мы разработали метод ICS для обнаружения экспрессии белка ИФН-γ в Т-клетках уток, обеспечив надежный инструмент для дальнейшего изучения реакций Т-клеток уток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты со всеми имеющимися вирусами птичьего гриппа A (H5N1) проводились в лаборатории биобезопасности животных уровня 3 и в помещении для животных в соответствии с протоколами Южно-Китайского сельскохозяйственного университета (CNAS BL0011). Все исследовательские проекты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (идентификационный код 2021f154, 29 июля 2021 г.) Южно-Китайского сельскохозяйственного университета. Все процедуры с животными выполнялись в соответствии с правилами и руководящими принципами, установленными этим комитетом, и международными стандартами благополучия животных. В этом исследовании использовались 4-недельные домашние кряквы (Anas platyrhynchos domestica), включая как самцов, так и самок, с массой тела от 500 до 600 г.

1. Выделение утиных ПБМК и приготовление одноклеточной суспензии

  1. Соберите 2 мл гепаринизированной крови из яремной вены каждой утки и перенесите в пробирки, содержащие ЭДТА, чтобы предотвратить свертывание крови у каждой отдельной утки
  2. Разбавьте кровь с помощью предоставленного образца разбавителя из набора для выделения лимфоцитов или PBS. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки с помощью пастеровской пипетки. Обычное соотношение разведения крови к разбавлению составляет 1:1.
  3. Переведите в центрифужную пробирку такой же объем раствора для разделения лимфоцитов, как и разбавленную кровь. Тщательно налейте кровяную суспензию поверх раствора для разделения лимфоцитов. Центрифугируйте смесь при температуре 400 x g, 25 °C в течение 15 минут, установив ускорение падения на 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раствора для разделения лимфоцитов должно быть не менее 4 мл. С компонентами набора раствора для разделения лимфоцитов можно ознакомиться в Таблице материалов.
  4. После центрифугирования наблюдайте за четырьмя отдельными слоями в центрифужной пробирке сверху донизу. Верхний слой представляет собой разбавитель образца, за ним следует кольцевой молочно-белый слой лимфоцитов, затем разделительный раствор, а нижний слой состоит из эритроцитов.
  5. Осторожно с помощью пипетки соберите второй слой, кольцевой молочно-белый слой лимфоцитов, и перенесите его в новую центрифужную пробирку. Добавьте 10 мл чистящего раствора для смешивания с клетками.
  6. Центрифугируйте образец при давлении 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл среды RPMI 1640 для подсчета клеток.
  7. Необязательно) Для дальнейшей очистки образца после центрифугирования при 440 x g в течение 5 минут используйте буфер для лизиса эритроцитов для удаления любых оставшихся смешанных клеток крови.

2. Культура Т-клеток in vitro H5N1 AIV-специфичная для Вас культура

  1. Купите 2-недельных здоровых крякв (Шелдрейк) на утиной ферме и разместите их в изоляторах с отрицательным давлением. Подтвердите отрицательный результат теста на AIV у уток с помощью тестов на ингибирование гемагглютинации (HI) до начала эксперимента. Инфицировать 4-недельных уток H5N1 AIV 1 x 106 интраназально 50% инфекцией яиц [EID50]/0,2 мл интраназально.
  2. Изолируйте PBMC памяти от инфицированных H5N1 уток через 28 дней после заражения, следуя методу, описанному в шаге 1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию в соотношении 1:1 0,08% трипанового синего и подсчитайте жизнеспособные (неокрашенные) клетки вручную под световым микроскопом.
    Примечание: Как подтверждается нашим ранее опубликованным исследованием20, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные через 28 дней после заражения, считаются обогащенными Т-клетками памяти. На этой стадии эффекторная фаза ослабевает, и популяции клеток памяти преобладают.
  3. Установите концентрацию на 3 x 106 клеток/мл, обеспечивая добавление 1 мл среды в каждую лунку 48-луночного планшета.
  4. Коинфицировать выделенные PBMC вирусом птичьего гриппа H5N1 (AIV) в качестве APC. Доза вируса составляет MOI = 5. Совместное культивирование PBMC с вирусом в течение 1 ч при 37 °C. Осторожно встряхивайте рукой каждые 15 минут.
  5. Через 1 час после заражения промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить несвязанные вирусные частицы. Ресуспендируйте промытые PBMC в 1 мл питательной среды для Т-клеток и далее инкубируйте взвешенные клетки при 37 °C в течение 5 ч.
  6. Центрифугируйте клетки при давлении 440 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого ресуспендируют инкубированные антигенпрезентирующие клетки (АПК) в 100 мкл питательной среды для Т-клеток и добавляют их к эффекторным клеткам. Соотношение антигенпрезентирующих клеток к эффекторным клеткам должно составлять 1:5.
  7. Инкубируйте клетки в атмосфере с содержаниемCO2 5% при 37 °C в течение 14 дней. Каждые 2 дня заменяйте половину надосадочной жидкости клеточной культуры свежей Т-клеточной средой путем тщательного пипетирования для обеспечения равномерного распределения. Выбросьте половину среды, содержащей клетки, затем добавьте такой же объем новой среды.
  8. На 7-й день наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении.
  9. Используйте PBMC памяти, обработанные PBS, в качестве нестимулированной контрольной группы.

3. Карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFSE) для мониторинга пролиферации Т-клеток

  1. Отрегулируйте плотность клеток до 0,5-1 x 107 клеток/мл и повторно суспендируйте клетки 5 мл PBS после центрифугирования при 440 x g в течение 5 минут.
  2. Разбавьте 10 мМ исходных данных до 1 мкМ CFSE с 5 мл предварительно охлажденного PBS; Работа в темное время суток.
  3. Наклоните две центрифужные пробирки под углом 45°, добавьте раствор CFSE в клеточную суспензию с помощью пипетки Пастера, хорошо перемешайте и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут в темноте.
  4. Промойте ячейки, разбавив их в 10 объемах предварительно охлажденного PBS, содержащего 5% FBS, осадите центрифугированием при 440 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите стирку 2 раза.
  5. Стимулируйте клетки, меченные CFSE in vitro , в соответствии с шагом 2. По завершении пролиферационного анализа проводят забор клеток и анализ с помощью проточной цитометрии.

4. Проточный цитометрический анализ на пролиферацию CD8+ Т и CD4+ Т-клеток

  1. После 7 дней культивирования соберите все клетки из каждой лунки и разделите их на две проточные трубки для анализа.
  2. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Добавьте 100 мкл коктейля антител (мышиный антиутиный CD8, 1:50 или мышиный антиутиный CD4, 1:50) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 °C.
  4. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 100 мкл коктейля антител (FITC-конъюгированный козий антимышиный IgG2b, 1:50) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 °C.
  6. Один раз промойте ячейки 1 мл PBS центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия стробирования показана на дополнительном рисунке 1.

5. Ответ Т-клеток с помощью анализов экспрессии сигнатурных генов с использованием количественной ПЦР

  1. Подсчитайте клетки в конце культивирования Т-клеток, соберите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 400 х г в течение 5 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Экстракция РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция может быть выполнена в вытяжном шкафу или ультрачистом стенде для предотвращения загрязнения РНК.
    1. Лизируйте клетки с помощью буфера для лизиса, входящего в комплект, в соответствии с инструкциями производителя. Перенесите лизированный образец в колонки с фильтром gDNA (предварительно помещенные в пробирки для сбора), центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с, выбросьте колонки и соберите фильтрат. Добавьте в фильтрат 0,5 объема абсолютного этанола. Тщательно перемешиваем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мутный раствор или осадок после добавления этанола являются нормальным явлением. Встряхните и переходите к следующему шагу.
    2. Перенесите смесь в колонки с РНК, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с. Выбросьте фильтрат, добавьте 700 мкл буфера RW1 и снова центрифугируйте.
    3. Выбросьте фильтрат, добавьте 700 мкл буфера RW2 (с абсолютным этанолом) и центрифугуйте. Выбросьте фильтрат, добавьте 500 μл буфера RW2 (с абсолютным этанолом) и центрифугируйте в течение 2 минут. Осторожно снимите колонку с трубки, чтобы избежать загрязнения фильтратом. Убедитесь, что все растворы для промывки удалены, чтобы предотвратить вмешательство в последующие реакции.
    4. Переложите колонку в новую пробирку для сбора, не содержащую РНКазы, добавьте 50-200 мкл ddH2O, не содержащую РНКазы, дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 1 минуты, затем центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 минуты для элюирования РНК. Измерьте чистоту и концентрацию РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разогрейте ddH без РНКазы2O до 65 °C для увеличения выхода и при необходимости выполните повторное элюирование.
  3. Синтезируйте кДНК, следуя инструкциям набора. Синтезируйте цепь кДНК в соответствии с инструкциями производителя, добавив в 5 раз больше обратной транскриптазы. Выполните обратную транскрибацию при 37 °C в течение 15 минут, затем при 85 °C в течение 5 секунд и охладите до 4 °C.
  4. Настройте реакцию ПЦР в соответствии с протоколом производителя.
    1. В пробирке для количественной ПЦР смешайте 10 мкл 2x смеси ферментов для ПЦР-реакции, 0,4 мкл праймера 1, 0,4 мкл праймера 2, 1 мкл матрицы кДНК и 8,2 мкл ddH2O для получения смеси объемом 20 мкл.
    2. Запустите ПЦР в приборе для количественной ПЦР в реальном времени с помощью следующей программы:
      Ступень 1: 95 °C в течение 30 с, Rep x 1
      Ступень 2: 95 °C в течение 3 с, 60 °C в течение 30 с, Rep x 35
      Ступень 3: 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 60 с, 95 °C в течение 15 с, Rep x 1

6. Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ИКС)

Примечание: Этот протокол был разработан для оценки эффекторного ответа H5N1-специфичных CD8+ Т-клеток путем обнаружения внутриклеточной секреции ИФН-γ у уток.

  1. Культивируйте H5N1-специфичные Т-клетки in vitro в соответствии с процедурой, описанной на шаге 2. Соберите все клетки (из каждой лунки) через 7 дней после начала культивирования.
  2. Инкубируйте антигенпрезентирующие клетки (APC), как описано в шаге 2. Добавьте инкубированные APC и Brefeldin A (1:1000) к эффекторным клеткам и соинкубируйте в течение 6 ч в инкубаторе при температуре 39 °C.
  3. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Добавьте в клетки 100 μL коктейля антител (мышиный анти-утиный CD8, 1:50) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при 4 °C.
  5. Промойте клетки центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C и повторно суспендируйте их в 1 мл PBS. Добавьте коктейль антител (FITC-конъюгированный козий антимышиный IgG2b, 1:50) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при температуре 4 °C.
  6. Снова промойте ячейки центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл фиксирующего буфера и инкубируйте в течение 20-25 мин в темноте при 4 °C.
  7. Промойте ячейки еще раз, центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера и промойте клетки 2 раза центрифугированием при 440 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  8. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера для пермеабилизации и добавьте антитело (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) к клеткам. После фиксации и мембранной пермеабилизации смесь клеток-антител инкубировать в течение 30 мин в темноте, периодически встряхивая во время инкубации при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для пермеабилизации/промывки представляет собой 10-кратный исходный раствор и должен быть разбавлен PBS перед использованием.
  9. Еще раз промойте ячейки 1 мл PBS, центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Добавьте 100 μл коктейля антител (PE-конъюгированный козий антимышиный IgG3, 1:250) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при 4°C.
  10. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия стробирования показана на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол был разработан на основе более раннего исследования по выявлению антиген-специфических эффекторных ответов Т-клеток ууток20. Первый этап эксперимента включает в себя культивирование in vitro вирус-специфических Т-клеток, которые служат основой для последующих исследований эффекторного ответа. Первоначально АПК инкубировали и совместно культивировали с эффекторными клетками. Морфологические наблюдения показали, что после пролиферации клетки демонстрировали кластерный рост (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает эффективный метод культивирования in vitro антиген-специфических Т-клеток уток, а также устанавливает протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов для уток, который может быть использован для оценки эффекторных ответов Т-клеток. В настоящее время нет опубликованных отчетов о протоколах культивирования in vitro для Т-клеток уток. В первую очередь мы ссылались на протоколы для антиген-специфических Т-клеток человека, но стремимся оптимизирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32473060 и 32461120064) (MD и ML); Проект фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований в Гуанчжоу (2025A04J5445) (до MD); Молодые ученые Программы ученых реки Янцзы (2024, Манман Дай); и молодой стипендиат реки Пил из «Специального плана поддержки провинции Гуандун» (2024, Манман Дай). Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл МИКРОЦЕНТРИФУЖНЫЕ пробиркиBiosharpCat#BS-15-M
15 мл Центрифужные пробиркиLabselectCat#CT-002-15A
2-меркаптоэтанол (55 мМ)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48-луночный планшет для культуры тканей (без обработки, плоское дно)BiofilCat#TCP000048
50 мл Центрифужные пробиркиLabselectCat#CT-002-50A
96-луночные кПЦР-планшеты без юбкиLabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm kitBDBioscience Cat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
Клеточная культура CO2 инкубаторThermo FisherHeracell 150i GP
CentrifugeНабор для маркировки Eppendorf5810R
CFSEAbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazymeCat#Q341-02
Набор для выделения лимфоцитов периферической кровиутки TbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixAccurate BiotechnologyCat#AG11706
FastPure Выделение РНК клеток/тканей Набор V2VazymeCat#RC112-01
Фетальная бычья сывороткаGibcoCat#10437-028
Проточный цитометрBeckman CoulterBA43347
проточная трубкаBeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488, 1:50 разведениеAbbkineCat#A23210
Козий антимышиный IgG2b, FITC, разведение 1:50Southern BiotechCat#1091-31
Козий антимышиный IgG3, PE, разведение 1:250Southern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad prism 8.0.2GraphPad Программное обеспечениеhttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV штамм DK383Национальная и региональная совместная инженерная лаборатория по медицине профилактики и контроля зоонозовA/Duck/Guangdong/383/2008
L-глутамин (200 мМ)GibcoCat#25030081
МикроскопMoticAE2000
Мышь против утки CD4, 1:50 разведениеBio-RadCat#MCA2478
Мышь против утки CD8α, 1:50 разведениеGeneTex Cat#GTX41834
Mouse Anti-Duck IFN-γ mAb, разведение 1:10Приготовлено в нашей лаборатории NA
NanoDrop One СпектрофотометрThermo FisherAZY1603209
NEAA (второстепенныйGibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR Thermal CyclerBiometra BiometraTone 96G
Пенициллин-стрептомицин растворGibcoCat#15070063
Система ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемыABI7500
рекомбинантным человеческим IL-2 (10 мкм; g)USCNKCat#RPA111Ga01
Буфер для лизиса эритроцитовTbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
Пируват натрия (100 mM)GibcoCat#11360-070
Trypan BlueSigma-AldrichCat#93595
Двухнедельные утки кряквы (Шелдрейк)утиная ферма в ГуанчжоуNA

Ссылки

  1. Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation. Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).
  2. Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents. Cancer Genom Proteom. 11 (6), 267-277 (2014).
  3. Mazza, C., Malissen, B. What guides MHC-restricted TCR recognition. Semin Immunol. 19 (4), 225-235 (2007).
  4. Nel, A. E. T-cell activation through the antigen receptor. Part 1: signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse. J Allergy Clin Immunol. 109 (5), 758-770 (2002).
  5. Dai, M., Xu, C., Chen, W., Liao, M. Progress on chicken T cell immunity to viruses. Cell Mol Life Sci. 76 (14), 2779-2788 (2019).
  6. Deng, G., et al. The role and therapeutic strategies for tissue-resident memory T cells, central memory T cells, and effector memory T cells in psoriasis. Immunology. 173 (3), 470-480 (2024).
  7. Corrado, M., Pearce, E. L. Targeting memory T cell metabolism to improve immunity. J Clin Invest. 132 (1), 148546(2022).
  8. Liu, X., Li, H., Li, S., Yuan, J., Pang, Y. Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design. Front Immunol. 14, 1100741(2023).
  9. Zanker, D., et al. An optimized method for establishing high purity murine CD8+ T cell cultures. J Immunol Methods. 387 (1-2), 173-180 (2013).
  10. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-Cell Differentiation In Vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  11. Jiao, W., et al. Revealing novel CD8(+) T-cell epitopes from the H5N1 avian influenza virus in HBW/B1 haplotype ducks. Vet Res. 55 (1), 169(2024).
  12. Faulkner, L., et al. The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs. Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).
  13. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  14. Masuda, Y., et al. Biological effects of chicken type III interferon on expression of interferon-stimulated genes in chickens: comparison with type I and type II interferons. J Vet Med Sci. 74 (11), 1381-1386 (2012).
  15. Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway. Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).
  16. Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation. Front Immunol. 13, 759188(2022).
  17. Yu, E. D., et al. Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors. Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).
  18. Grant, E. J., et al. Broad CD8(+) T cell cross-recognition of distinct influenza A strains in humans. Nat Commun. 9 (1), 5427(2018).
  19. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  20. Dai, M., et al. Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro. J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).
  21. Jabbari, A., Harty, J. T. The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses. J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).
  22. Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)). Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).
  23. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  24. Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications. J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).
  25. Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).
  26. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).
  27. Chen, L., et al. A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans. Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

вирус H5N1мононуклеарные клетки периферической кровиантигенпрезентирующие клеткисекреция цитокиновпроточная цитометрияопределение IFN-гаммапролиферация Т-клеток
В пробирке Посев H5N1-специфичных Т-клеток уток и выявление иммунных реакций методом внутриклеточного окрашивания цитокинов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.