Методическая статья

Динамические изменения функции легких и кровотока при прогрессировании аденокарциномы легкого у мышей с помощью плетизмографии всего тела и ультразвуковой допплерографии

DOI:

10.3791/68306

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Clinical Medicine, Chengdu University of TCM, 2Chengdu Xinjin District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3China Civil Affairs University, 4Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует функцию легких мышей и ультразвуковую допплерографию в качестве исследовательских методов, предлагая неинвазивный, простой и эффективный метод изучения аденокарциномы легкого.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденокарцинома легкого (ЛУАД) является распространенной злокачественной опухолью легких, и ее прогрессирование приводит к изменениям вентиляции и кровотока, что подчеркивает различные функциональные характеристики легкого в патологических условиях. Система неинвазивной плетизмографии всего тела (WBP) позволяет в режиме реального времени контролировать функцию легких и реакцию дыхательных путей у бодрствующих мышей, избегая помех от трахеотомии и анестезии. Ультразвуковая допплерография мелких животных (DU) с использованием технологии высокочастотной визуализации неинвазивно фиксирует микрососудистые структуры и изменения скорости легочного кровотока, обеспечивая решающую поддержку в исследовании нарушений вентиляции и перфузии, связанных с LUAD. В этом исследовании была создана модель LUAD на мышах типа А/Дж с использованием 100 мг/кг 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанона (ННК). WBP в сочетании с DU использовали для мониторинга функции легких и гемодинамических параметров у мышей. Результаты показали достоверное снижение (p < 0,05) ключевых показателей, включая 50% выдоха (EF50), минутную вентиляцию (MV), пиковую скорость выдоха (PEF), пиковую скорость вдоха (PIF), усиленную паузу (Penh) и дыхательный объем (TV), а также заметное снижение скорости легочного артериального кровотока (p < 0,05) в модельной группе во время прогрессирования опухоли. Этот комбинированный подход эффективно фиксирует функциональные нарушения, происходящие во время патологического развития LUAD у мышей, обеспечивая неинвазивный и эффективный метод для продвижения исследований респираторных заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденокарцинома легкого (ЛУАД) является наиболее распространенным подтипом немелкоклеточного рака легкого1. В связи с растущим загрязнением окружающей среды, употреблением табака и старением населения, глобальная распространенность LUAD ежегодно растет 2,3,4. Современные исследования показывают, что у пациентов наблюдается прогрессирующее снижение легочной функции и гемодинамические нарушения по мере того, как LUAD прогрессирует 5,6,7,8. Разработка неинвазивных, эффективных и экономичных методов отслеживания и оценки функции легких и колебаний кровотока в легочной артерии может предоставить критически важные доказательства для клинического лечения LUAD.

Существующие исследования показывают, что рост опухоли LUAD постепенно блокирует дыхательные пути, снижает емкость легких и вентиляцию9, а также запускает воспалительную секрецию цитокинов, которая усугубляет стеноз дыхательных путей через локализованное хроническое воспаление10. Следовательно, снижение функции легких приводит к усугублению гипоксии и нарушениям кровотока 11,12. Эти патологические изменения часто проявляются клинически в виде прогрессирующей одышки и стеснения в груди. В то время как компьютерная томография не позволяет зафиксировать аномалии легочной функции или гемодинамические изменения, вызванные прогрессированием LUAD, повторные краткосрочные компьютерные томографии также увеличиваютлучевую нагрузку. В отличие от этого, плетизмография всего тела (WBP) и допплеровская ультразвуковая флоуметрия служат неинвазивными, удобными для оператора и воспроизводимыми дополнительными подходами к динамическому мониторингу. Интеграция этих методов для мониторинга функции легких и гемодинамики может улучшить оценку прогрессирования заболевания и принятие терапевтических решений.

В этом исследовании мы использовали 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) у мышей A/J для моделирования инициации и прогрессирования LUAD. Легочная функция и гемодинамические изменения контролировались в течение длительного времени с помощью WBP и ультразвуковой допплерографии (DU) на 4, 10 и 20 неделях. Этот подход направлен на то, чтобы обеспечить новое понимание патофизиологии и терапевтических стратегий LUAD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были одобрены Этическим комитетом по благополучию животных Университета традиционной китайской медицины в Чэнду и проводились в соответствии с соответствующими законами и стандартами этики исследований на животных (20240616IV). Самки инбредных мышей A/JGpt (в возрасте 7-8 недель) содержались при температуре 20-24 °C и относительной влажности 40%-70%. На протяжении 12-часового цикла «свет-темнота» мышей кормили стандартным кормом для животных и очищенной водой. Животные были акклиматизированы к этой среде за 7 дней до начала экспериментов.

1. Создание и подготовка модели животного

  1. Растворите ННК в обычном физрастворе для приготовления исходного раствора с концентрацией 10 мг/мл.
  2. Измерьте легочную функцию с помощью WBP на 4-й неделе (28-й день после моделирования), 10-м (на 70-й день после моделирования) и на 20-й неделе (на 140-й день после моделирования). Скорость легочного артериального кровотока измеряли с помощью DU на 20-й неделе (140-й день после моделирования). Перед каждым измерением помещайте мышей в подходящую среду, чтобы свести к минимуму стресс.

2. Неинвазивное исследование функции легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Система WBP измеряет дыхательную функцию бодрствующих, свободно передвигающихся животных с помощью специально разработанной измерительной камеры. Камера оснащена сетками пневмотача, которые позволяют воздуху входить и выходить из камеры. Сопротивление воздуха, создаваемое ситами пневмотача, вызывает небольшие изменения давления в камере относительно окружающего воздуха. Для измерения этих изменений давления внутри камеры подключается чувствительный преобразователь давления, из которого можно получить поток (называемый коробчатым потоком). Программное обеспечение предоставляет такие параметры дыхания, как поток и объем, а также отчеты в режиме реального времени.

  1. Приобретите следующие основные компоненты: контроллер WBP, контроллер силового трансформатора, консольная планка, длинный консольный кабель и короткий консольный кабель, калибраторная колонна, плетизмограф WBP, преобразователь потока, датчик температуры и влажности, головка небулайзера (фиолетовая), фильтр смещения потока и трубка, ПК.
  2. Соберите оборудование, как описано ниже.
    1. Выполните подключение задней панели, как описано ниже.
      1. Подключите блок контроллера к компьютеру с помощью кабеля USB 2.0 и убедитесь в стабильности соединения.
      2. Заполните колонку водопроводной водой до линии заливки воды, подключите к порту на задней панели контроллера и убедитесь, что линия сухая.
      3. Вставьте силовой трансформатор в заднюю часть контроллера, убедившись, что он надежно подключен.
      4. В зависимости от того, где размещена полоса консоли, выберите длинный или короткий кабель для подключения к задней части геймпада.
      5. Вставьте блок контроллера на место и установите калибровочную колонку и силовой трансформатор.
    2. Выполните подключение передней панели, как описано ниже.
      1. Вставьте каждый датчик расхода в порт с маркировкой Sensor. Вставьте фильтр и трубки смещения в порт контроллера с маркировкой Bias Flow на передней панели. Подсоедините изолирующий резистор смещенного потока к открытому концу трубки смещенного потока.
    3. Выполните подключение камеры, как описано ниже
      1. Поместите камеру перед блоком контроллера, убедившись, что она расположена на твердой, устойчивой поверхности, свободной от вибрации.
      2. Подключите датчик расхода к камере и расположите датчик так, чтобы знак DSI был обращен вверх.
      3. Подсоедините трубку смещения (с изолирующим резистором) к нижнему порту плетизмографа.
      4. Снимите заглушку в верхней части плетизмографа и установите на место головку небулайзера (фиолетового цвета).
  3. Настройте программное обеспечение, как описано ниже.
    1. Запустите управляющее программное обеспечение и авторизуйтесь. На главной странице контроллера нажмите кнопку Конфигурация оборудования. Запустите мастер настройки, нажав « Новая конфигурация», затем выберите WBP (серийный номер: DEMO-061) и нажмите «Далее».
    2. В раскрывающемся меню Вид выберите Мышь. Установите расход на значения по умолчанию. Выберите 4 площадки (каждой площадке соответствует одна камера, максимум 4 камеры за сеанс). Убедитесь, что скорость потока смещения для всех активных сайтов одинакова. Сопоставьте сайты в программном обеспечении с фактическими портами на контроллере WBP. Наконец, нажмите Finish , чтобы завершить настройку.
  4. Сбор данных
    1. Откройте основную программу и откалибруйте камеры, так как этот шаг имеет решающее значение. Наведите указатель мыши на аппаратное обеспечение, чтобы отобразился желтый значок инструмента. Нажмите значок, чтобы перейти к интерфейсу калибровки, затем нажмите « Все », чтобы откалибровать камеры для всех четырех животных одновременно.
    2. Создайте необходимый протокол исследования, выбрав «Исследование реакции на дозу » в разделе «Создать параметры исследования». Установите конфигурацию GLP так, чтобы она не следовала GLP.
    3. Чтобы настроить параметры измерения и последовательности задач, нажмите кнопку Новый параметр , чтобы открыть Конструктор параметров и добавить измеряемые параметры. Используйте настройки по умолчанию для последовательности задач.
    4. Чтобы начать сбор данных, перейдите на страницу «Моя лаборатория » на рабочей станции, затем перетащите подготовленный протокол исследования в WBP для мыши.
    5. Нажмите кнопку в виде красного треугольника для каждого сайта, чтобы начать сбор данных. Чтобы запустить все четыре сайта одновременно, нажмите «Сеанс» > «Подтвердить все сайты». После запуска приобретения рабочая станция откроет страницу Настройка приобретения и будет использовать ее для редактирования информации для каждой мыши на сайтах приобретения.
    6. Последовательно нажмите «Сеанс» > «Подтвердить все сайты», чтобы начать сбор данных. Чтобы убедиться в том, что результаты эксперимента верны и надежны, предварительно стабилизируйте подопытных мышей в тихом помещении на 30 минут.
    7. Поместите тихих мышей в полностью закрытую тестовую банку. Нажмите на опцию « Старт » в системе, чтобы собрать данные. Система собирает данные каждые 2 секунды, поэтому собирайте не менее 10 минут. Перехват 4 мин данных в середине. Здесь было протестировано по пять животных в каждой группе, и тест был повторен 3 раза.
    8. Нажмите кнопку Создать отчет на странице Исследование и выберите тип отчета. Сохраните экспериментальные данные в формате таблицы. В этом эксперименте для оценки функции легких у мышей использовались пиковая скорость выдоха (ПСВ), пиковая скорость потока на вдохе (ФПИ), усиленная пауза (Пень) и дыхательный объем (ТВ).

3. Измерение скорости кровотока в легочной артерии

  1. Подготовка животных
    1. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии и обезболите ее 5% изофлураном (скорость потока: 1 л/мин). Закрепите мышь на платформе для попечения животных, поддерживая температуру платформы на уровне 35-37 °C для сохранения температуры тела.
    2. Поместите рот и нос мыши в маску для анестезии. Поддерживайте анестезию с помощью 1%-2% изофлурана (скорость потока: 0,6-1 л/мин). Когда мышь сохраняет устойчивое положение лежа на спине со стабильной частотой сердечных сокращений и регулярным ритмом дыхания, полным расслаблением мышц, отсутствием движения конечностей, отсутствием реакции вибрисс, исчезновением рефлекса отмены педали, розовыми слизистыми оболочками и отсутствием расширения зрачков, считается, что она достигла соответствующей глубины анестезии.
    3. На этом этапе нанесите 2-3 мг ветеринарной мази на нижний конъюнктивальный мешок с помощью стерильного ватного тампона. Аккуратно поглаживайте верхние и нижние веки, чтобы способствовать закрытию, не сдавливая глазное яблоко, обеспечивая равномерное распределение мази по поверхности роговицы.
  2. Подготовка области визуализации
    1. Удалите волосы на груди с помощью крема для депиляции и устройства для депиляции. Очистите обработанный участок влажной марлей или влажной салфеткой, затем равномерно нанесите предварительно подогретый до 37°C соединитель ватным тампоном до равномерной толщины 0,3 мм, обеспечивая отсутствие видимых пузырьков воздуха.
  3. Ультразвуковая допплерография
    1. Используйте ультразвуковой допплеровский зонд с частотой 40 МГц для измерения скорости кровотока в легочной артерии с точки зрения длинной оси парастерна. Наклоните зонд на 45° влево, а операционный стол на 15° вправо. Опустите зонд с правой стороны грудной клетки и точно настройте оси X и Y, чтобы определить местоположение правого желудочка и легочной артерии, руководствуясь их анатомическими пространственными отношениями, морфологическими особенностями и направлением гемодинамического потока.
    2. Нажмите кнопку CF , чтобы переключиться в режим Доплера. Визуализируйте сигнал кровотока в синей легочной артерии. Расположите линию отбора проб на легочной артерии и нажмите кнопку PW, чтобы отобразить спектр кровотока в легочной артерии.
    3. Нажмите кнопку «Заморозить », чтобы заморозить изображение, затем нажмите кнопку «Измерить » и выберите параметр « Скорость » на сенсорном экране. Поместите измерительную линию на пике спектра, чтобы получить максимальную скорость легочного артериального кровотока.
  4. Сбор данных
    1. Используйте программное обеспечение для автономного анализа для выбора данных импульсной допплерографии легочной артерии. Получите доступ к пакету измерений Cardiac Package, выберите функцию RV и PV, а также выведите скорость кровотока в легочную артерию и сохраненные изображения.

4. Анализ данных

  1. Используйте R4.4.2 и GraphPad Prism 9.5.1 для анализа данных и построения графиков. Межгрупповые сравнения данных о функции легких проводились с использованием t-критерия независимых выборок, в то время как внутригрупповые сравнения проводились с использованием повторных измерений ANOVA. Сравнение скорости кровотока в легочных артериях между группами анализировали с помощью независимых выборок t-критерия, статистическая значимость которых была установлена на уровне p < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проверить осуществимость, точность и воспроизводимость методологии оценки функции легких и артериального кровотока в легких, мы построили поминутные средние кривые PIF, PEF и потока выдоха при 50% жизненной емкости легких (EF50, увеличение в 10 раз) в течение 4-недельного периода мониторинга в пустой группе (рисунок 1A). Как показано на этой панели, три соответствующие кривые демонстрируют высокую степень соответствия формы. Несмотря на минимальные абсолютные изменения, особенно в EF50...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании NNK в сочетании с мышами A/J был выбран для создания модели аденокарциномы легкого в соответствии с предыдущими отчетами. Соответствующие исследования показали, что NNK в сочетании с мышами A/J может начать иметь минимальное образование опухоли на10-й неделе, а стабильное образование опухоли на16-й — на20-й неделе18,19. Поэтому мы выбрали тест на4-й неделе после инъе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим профессора Школы фундаментальных медицинских наук Чэндуского университета традиционной китайской медицины Цун Хуана за поддержку. Это исследование было поддержано Сычуаньской научно-технической программой (номер утверждения проекта: 2024YFFK0173)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A/J мышиGemPharmatech LLC.
0,5 мл ЭДТА тубыLabshark 
1-бутанон,4-(метилнитрозоамино)-1-(3-пиридинил)Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.
75% этанолChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd2023052901
Индукционная камера для анестезииShanghai Tawans Intelligent Technology Co., Ltd.MZ-MR
Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
Устройство для депиляцииShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.3180
ИзофлуранШанхайская Дума Биотехнологии Ко., Лтд.DM-M9462
Медицинская лентаBeijing Lanbokangs Technology Co., Ltd.19-5023
медицинский трикодерMedChemexpress69652
PBS буферный растворShanghai Fusheng Co., Ltd.A-RY5256
Солевой раствор (медицина)Beijing Biolabs Technology Co.GL1736‌
Ультразвуковой связующий агентQisheng (Shanghai) Medical Equipment Co., Ltd.
N000018130201070Gu N589770Крем для депиляции 2023062320212060273

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melocchi, V., et al. Aggressive early-stage lung adenocarcinoma is characterized by epithelial cell plasticity with acquirement of stem-like traits and immune evasion phenotype. Oncogene. 40 (31), 4980-4991 (2021).
  2. Cardoso, D., Painho, M., Roquette, R. A. A geographically weighted regression approach to investigate air pollution effect on lung cancer: A case study in Portugal. Geospat Health. 14 (1), (2019).
  3. Cockburn, M. G., Wu, A. H., Bernstein, L. Etiologic clues from the similarity of histology-specific trends in esophageal and lung cancers. Cancer Causes Control. 16 (9), 1065-1074 (2005).
  4. Liu, B. D., et al. Expert consensus on image-guided radiofrequency ablation of pulmonary tumors: 2018 edition. Thoracic Cancer. 9 (9), 1194-1208 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Club cells employ regeneration mechanisms during lung tumorigenesis. Nat Comm. 13 (1), 4557(2022).
  6. Yang, M., et al. Alveolar type I cells can give rise to KRAS-induced lung adenocarcinoma. Cell Rep. 42 (12), 113286(2023).
  7. Roche, O., et al. Identification of non-coding genetic variants in samples from hypoxemic respiratory disease patients that affect the transcriptional response to hypoxia. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9315-9330 (2016).
  8. Zhai, R., Yu, X., Shafer, A., Wain, J. C., Christiani, D. C. The impact of coexisting COPD on survival of patients with early-stage non-small cell lung cancer undergoing surgical resection. Chest. 145 (2), 346-353 (2014).
  9. Chang, W. H. Complete spontaneous resolution of a giant bulla without rupture or infection: a case report and literature review. J Thoracic Dis. 9 (6), E551-E555 (2017).
  10. Wang, X., et al. SAA suppresses α-PD-1 induced anti-tumor immunity by driving TH2 polarization in lung adenocarcinoma. Cell Death Dis. 14 (11), 718(2023).
  11. Best, S. A., et al. Distinct initiating events underpin the immune and metabolic heterogeneity of KRAS-mutant lung adenocarcinoma. Nat Comm. 10 (1), 4190(2019).
  12. Fujimoto, J., et al. Development of Kras mutant lung adenocarcinoma in mice with knockout of the airway lineage-specific gene Gprc5a. Int J Cancer. 141 (8), 1589-1599 (2017).
  13. Zhang, D., et al. Reducing radiation dose to selected organs by selecting the tube start angle in MDCT helical scans: a Monte Carlo based study. Med Phys. 36 (12), 5654-5664 (2009).
  14. Yang, X. X., et al. Pharmacological effects of Bufei Jianpi granule on chronic obstructive pulmonary disease and its metabolism in rats. Front Pharmacol. 13, 1090345(2022).
  15. Hankinson, J. L., Odencrantz, J. R., Fedan, K. B. Spirometric Reference Values from a Sample of the General U.S. Population. Am J Resp Crit Care Med. 159 (1), 179-187 (1999).
  16. Quindry, J. C., Ballmann, C. G., Epstein, E. E., Selsby, J. T. Plethysmography measurements of respiratory function in conscious unrestrained mice. J Physiol Sci. 66 (2), 157-164 (2016).
  17. Rivera, D. A., Buglione, A. E., Ray, S. E., Schaffer, C. B. MousePZT: A simple, reliable, low-cost device for vital sign monitoring and respiratory gating in mice under anesthesia. PloS One. 19 (3), e0299047(2024).
  18. Song, M., et al. Dietary 5-demethylnobiletin inhibits cigarette carcinogen NNK-induced lung tumorigenesis in mice. Food Function. 8 (3), 954-963 (2017).
  19. Upadhyaya, P., Kenney, P. M., Hochalter, J. B., Wang, M., Hecht, S. S. Tumorigenicity and metabolism of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol enantiomers and metabolites in the A/J mouse. Carcinogenesis. 20 (8), 1577-1582 (1999).
  20. Hu, P., et al. Haemoptysis as a prognostic factor in lung adenocarcinoma after curative resection. British J Cancer. 109 (6), 1609-1617 (2013).
  21. Popper, H. Primary tumor and metastasis-sectioning the different steps of the metastatic cascade. Transl Lung Cancer Res. 9 (5), 2277-2300 (2020).
  22. Jin, C., et al. Commensal Microbiota Promote Lung Cancer Development via γδ T Cells. Cell. 176 (5), 998-1013.e16 (2019).
  23. Zhao, S., et al. Clinical manifestations of pulmonary mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma: single-center experience with 18 patients. OncoTargets Ther. 11, 555-561 (2018).
  24. Liu, C. H., et al. Lipopolysaccharide-Mediated Chronic Inflammation Promotes Tobacco Carcinogen-Induced Lung Cancer and Determines the Efficacy of Immunotherapy. Cancer Res. 81 (1), 144-157 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи