Мультимодальная оценка протективного эффекта гентиопикрозида при индуцированном CDCA повреждении клеток HepG2

Краткое содержание

Это исследование показало, что гентиопикрозид может лечить холестатическое повреждение печени, контролируя выработку и метаболизм желчных кислот и липидов и предотвращая окислительный стресс и воспалительные реакции.

Аннотация

Было показано, что основной активный компонент Swertia chirayita, гентиопикрозид (GPS), защищает печень в случаях холестаза. С целью выяснения защитного механизма GPS при холестатическом повреждении печени клетки HepG2 обрабатывали хенодезоксихолевой кислотой (CDCA) для моделирования среды холестаза in vitro, а для определения защитного действия GPS на клетки HepG2 использовали метод CCK-8. С помощью биологического набора определяли содержание внутриклеточных ТБА, Т-ЧО, ТГ, ЩФ, АЛТ, АСТ, ГШ, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α, СОД, МДА. Для подтверждения уровня АФК использовалась конфокальная лазерная микроскопия. Экспрессию клеток HepG2 SHP-2, Tgr5, CYP7A1 и NTCP оценивали с помощью иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга. Затем программное обеспечение Autodock было использовано для проверки молекулярного докинга его основных активных ингредиентов. Полученные данные показали, что GPS в значительной степени предотвращает повреждение, которое CDCA наносит клеткам HepG2. Этот защитный эффект может быть достигнут за счет контроля производства и метаболизма желчных кислот и липидов в клетке и предотвращения окислительного стресса и воспалительных реакций.

Введение

Метаболическим участком пищеварительной системы организма является печень. Секреция желчи является ключевым механизмом в процессе катаболизма жира в гепатобилиарной системе. Основные составляющие желчи, желчные кислоты, высвобождаются клетками печени и имеют решающее значение для сохранения равновесия жирового обмена. Как у здоровых особей, так и у больных случаев физиологические и патологические процессы в печени зависят от баланса свободных и конъюгированных желчных кислот в печени. Если это равновесие нарушено, циркуляция желчных кислот не будет функционировать нормально, что может привести к внутрипеченочному холестазу и последующему поражению печени¹. Согласно уже проведенным исследованиям, холестатическое повреждение печени (КИК) — это состояние, связанное с метаболическими нарушениями, дисбалансом кишечной микробиоты и некрозом клеток печени². Это вызвано препятствием для оттока желчи и накоплением желчных кислот в клетках печени для ХЛИ. Тяжелые случаи КИК могут прогрессировать до цирроза печени, фиброза печени и печеночной недостаточности³. В настоящее время механизм, лежащий в основе КИК, все еще несколько неясен и сложен, и большинство пациентов получают низкую эффективность медикаментозной^{терапии4} наряду со значительными побочными^{эффектами5}. В связи с этим одним из наиболее актуальных вопросов, стоящих сегодня перед медицинским сообществом, является поиск эффективных препаратов для лечения КИК.

Современные исследования продемонстрировали важность нескольких ядерных рецепторов в метаболизме желчных кислот⁶. Среди них рецептор желчных кислот является важнейшим регуляторным рецептором желчных кислот, который может связываться с БА и активировать протеинтирозинфосфатазу (СХП)⁷. С другой стороны, чрезмерное накопление БА в гепатоцитах, приводящее к холестазу, будет негативно ингибировать рецептор SHP и активировать рецептор CYP7A1 (цитохром P450 7A1), что приведет к выработке желчной кислоты⁸. Кроме того, он блокировал рецептор желчных кислот TGR5, связанный с G-белком, от секреции БА и стимулировал рецептор таурохолата натрия, котранспортирующий полипептид (NTCP), к транспортировке БА. Он вызывает накопление желчных кислот в клетках печени, что повреждает печень⁹. Следовательно, дополнительные исследования этого механизма могут пролить свет на более жизнеспособные варианты лечения КИК.

Сверция чирайита с долгой историей использования в медицине является традиционной китайской тибетской медициной. Он считается лучшим Тидой и часто используется местными жителями для лечения заболеваний желчного пузыря и печени¹⁰. Он часто используется для лечения камней в желчном пузыре, холецистита, цирроза печени, гепатита и других заболеваний печени¹¹. Недавние исследования показали, что некоторые иридоидные химические компоненты свертии, а также ее активные ингредиенты оказывают хорошее терапевтическое воздействие при заболеваниях печени, таких как фиброз печени и острое повреждение печени. Активные ингредиенты Swertia chirayita облегчают заболевание печени, снижая воспаление¹⁵ и его антиоксидантные свойства¹⁶. Наши предварительные исследования показали, что комбинированная формула тибетской медицины с Swertia chirayita в качестве основного ингредиента оказывает благоприятное терапевтическое воздействие на КИК, что позволяет предположить, что Swertia chirayita обладает потенциалом для лечения КИК¹⁷. Основным активным ингредиентом, который извлекается и очищается из Swertia chirayita, является GPS (Gentiopicroside)¹⁸, который обладает рядом фармакологических действий, таких как защита печени¹⁹, регуляция метаболизма глюкозы²⁰, улучшение микробиома кишечника²¹ и противоопухолевые свойства²². Предыдущие исследования показали, что GPS улучшает повреждение печени при холестатических состояниях и уменьшает внутрипеченочный холестаз за счет повышения экспрессии транспортеров желчных кислот^23,24. Аналогичным образом, исследования, проведенные как in vivo, так и in vitro, показали, что GPS может уменьшить повреждение печени за счет улучшения липидного обмена, уменьшения воспаления и снижения окислительного^{стресса.}

Клетки HepG2 часто используются в исследованиях заболеваний печени in vitro, поскольку они проявляют активность метаболических ферментов гепатоцитов^. В то же время, гепатоциты могут выделять больше желчи при воздействии одной из четырех форм свободных желчных кислот, к которым относится CDCA²⁸. В результате, CDCA может быть использован для создания клеточной модели холестатического повреждения печени и имитации холестатической среды in vitro. Учитывая, что индуцированное CDCA повреждение гепатоцитов в значительной степени опосредовано окислительным стрессом и воспалительными путями, а также учитывая документально подтвержденные антиоксидантные и противовоспалительные эффекты GPS в других печеночных контекстах²⁶, мы предполагаем, что GPS может обеспечить защиту от холестатического повреждения печени за счет смягчения цитотоксичности, вызванной CDCA, в клетках HepG2. В данной работе изучалось защитное действие GPS на КИК и его молекулярный механизм с использованием модели индуцированного CDCA повреждения клеток HepG2.

Протокол

Культивирование и лечение клеток
Элементы HepG2 и МЭМ-среды были приобретены у коммерческого поставщика. Клетки HepG2 выращивали в среде MEM с добавлением 10% FBS, 1% 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина при 37 °C и 5%_CO2 атмосферы. После адгезии клеток питательные среды были изменены. Клетки культивировали в соотношении 1:3 через 2-3 дня, и они были использованы в эксперименте, как только клеточная культура достигла 80% конфлюенции.

Анализ жизнеспособности клеток
В 1-й день клетки засеивали в 2 x 10⁴ клеток HepG2 (2 x 10⁵ клеток/мл, 100 мкл на лунку) в 96-луночный планшет в шести повторах²⁹. На 2-й день, через 24 ч после инокуляции, клетки обрабатывали CDCA в различных концентрациях CDCA (0, 20, 40, 60, 80, 100 мкМ) в течение 12 ч. Жизнеспособность клеток определяли методом CCK-8. Через 24 ч после первоначального посева клеток клетки обрабатывали CDCA в различных концентрациях GPS (0, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 мкМ) в течение 24 ч. На 3-е сутки жизнеспособность клеток определяли методом CCK-8. На 4-й день 2 x 10⁴ клетки HepG2 (2 x 10⁵ клеток/мл, 100 мкл на лунку) засеивали в 96-луночный планшет в шести повторениях в течение 24 ч. На 5-е сутки клетки разделяют на шесть групп: контрольную, модельную, урсодезоксихолевую кислоту (УДХК) и GPS: 25 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ. Исключая контрольную группу, всем группам в течение 12 ч добавляли 60 мкМ раствор CDCA. Затем в течение 24 ч добавляли раствор УДХК (60 мкМ) и раствор GPS (25 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ) в течение 24 ч к УДХК и 3 группам GPS соответственно. На 6-е сутки жизнеспособность клеток определяли методом CCK-8.

Анализ на цитокины
Согласно представленной литературе, наборы TNF-α, IL-6 и IL-1β использовались для определения уровней воспалительных факторов в клетках HepG2 после различных процедур³⁰. Через 24 ч после вмешательства CDCA или CDCA+GPS выбросьте питательную среду и промойте ее PBS. Центрифугируйте клеточную суспензию при 69 х г в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и выведите клетки в осадок. Добавьте раствор PBS и гомогенизируйте в условиях ледяной водяной бани для получения гомогенатов клеток. После 10-минутного центрифугирования при 10 005 x g и 4 °C надосадочную жидкость удаляли, и для измерения общего белка в содержимом клеток использовали метод BCA. Согласно инструкции производителя, уровни TNF-α, IL-6 и IL-1β в надосадочной жидкости клетки определяли методом иммуноферментного анализа. Поглощение измеряли на длине волны 450 нм с помощью многофункционального микропланшетного ридера.

Обнаружение TBA, TG и T-CHO
Тесты TBA, TG и T-CHO были использованы в соответствии с инструкциями набора для определения метаболизма желчных кислот и липидов в клетках HepG2³¹. TBA, TG и T-CHO были приобретены на коммерческой основе. После того, как клеточные осадки были разбиты ультразвуком в ледяной водяной бане, гомогенат клеток получали путем добавления лизата RIPA в течение 30 минут. Поглощение измеряли на длине волны 450 нм с помощью многофункционального микропланшетного ридера. После добавления рабочих растворов BCA в каждую лунку и гомогенизации клеток абсорбционную способность измеряли при 562 нм с помощью фермента, а инкубационный период составлял 30 мин. Для построения стандартной кривой использовали поглощение стандартного продукта, а для получения значения абсорбции использовали следующую формулу:
Содержание TBA (моль/гпрот) = (_{Образец-A бланк}) / (_{Стандарт} -_{A бланк} A)×C_{калибровка}/CPR
Содержание Т-ЧО, ТГ (ММОЛЬ/ГПРОТ) = (_{образец-заготовка} А)/₍стандарт-заготовка А)×С_{стандарт}/СЛР

Оценка функции печени
Функцию печени оценивали с помощью АЛТ, АСТ и ЩФ. ALT, AST и ALP были приобретены на коммерческой основе. После двух раундов очистки буфера PBS на собранных ячейках клетки центрифугировали в течение 10 мин при 69 x g, удаляли надосадочную жидкость, осаждали клетки, добавляли буфер PBS и создавали гомогенат путем ультразвукового дробления в ледяной водяной бане. Затем были установлены испытательное и контрольное отверстия. За операционным столом следили, добавляя реагент, осторожно встряхивая и перемешивая лунку, а затем оставляя ее при комнатной температуре в течение 15 минут. Значение OD каждой дырки определяли с помощью фермента с длиной волны 505 нм. Затем абсолютное значение OD вносили в стандартную кривую и проводили дополнительный количественный анализ с использованием формулы.

Определение активности SOD, MDA, GSH
Активность СОД, содержание МДА и содержание ГСГ оценивали в соответствии с инструкциями производителя соответственно. SOD, MDA и GSH были приобретены на коммерческой основе. Если вкратце, то для инокуляции клеток использовалась шестилуночная пластина. После обработки клетки подвергались предварительной обработке (сбору и разрушению) в соответствии с экспериментальными инструкциями набора. Затем соответствующие рабочие растворы заливались на пластину для обнаружения клеток после того, как были установлены пустые отверстия, стандартные отверстия и измерительные отверстия в соответствии с инструкциями по эксплуатации. Затем клетки культивируют при температуре и продолжительности, указанных в инструкции к набору. Затем для количественной оценки содержания белка был использован набор для обнаружения BCA. В конечном счете, поглощение было определено на соответствующей длине волны, и был проведен более тщательный количественный анализ индекса окислительного стресса.

Обнаружение изменений АФК в клетках HepG2 с помощью зонда DCFH-DA
Был проведен рутинный посев для подсчета клеток. Клетки HepG2 с плотностью 1 x 10⁵ клеток/мл инокулировали в чашки со стеклянным дном по 1,5 мл каждая и культивировали в соответствии с вышеуказанным методом. После культивирования среду отбраковывали, а клетки промывали PBS. DCFH-DA разбавляли до концентрации 1:1000, добавляли в дозе 1,5 мл разбавителя на лунку и инкубировали в течение 20 минут. После инкубации клетки 3 раза промывали раствором основной культуры МЭМ. Затем в каждую чашку добавляли 100 μл монтажной среды, препятствующей выцветанию, с помощью DAPI. Флуоресцентный конфокальный микроскоп использовался для просмотра и получения изображений с длиной волны 488 нм для возбуждения и 525 нм для излучения³².

Иммунофлуоресцентная визуализация
После инкубации клетки промывали 3 раза буфером PBS. После фиксации в течение 30 минут 4% параформальдегидом клетки очищали с помощью буфера PBS на встряхивающем столе. Разбавитель добавляли, затем ставили в холодильник при температуре 4 °C от света на ночь. После этого клетки покрывали флуоресцентным разбавителем и инкубировали вдали от света в течение 1 ч при 37 °C. После инкубации клетки трижды промывали буфером PBS. После фиксации 4% параформальдегидом в течение 30 мин клетки промывали буфером PBS на ротационном шейкере. Затем добавляли 150 мкл первичного разбавителя антител и инкубировали в течение ночи при 4 °C в условиях защищенного света. Первичный разбавитель антител восстанавливали с последующим добавлением достаточного объема буфера PBS и встряхиванием в течение 5 минут; Эту процедуру стирки повторяли три раза. Затем в каждую чашку вводили 150 мкл флуоресцентного разбавителя вторичных антител и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч в защищенном от света инкубаторе. В каждую посуду добавляли соответствующий объем буфера PBS и промывали на ротационном шейкере в течение 8 минут, повторяя в течение трех циклов. Наконец, клетки покрывали достаточным раствором для окрашивания DAPI в течение 10 минут, устанавливали с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание, и визуализировали с помощью системы визуализации³³ со сверхвысоким разрешением.

Вестерн-блоттинг
После различных методов лечения весь белок клеток HepG2 экстрагировали с использованием лизата RIPA, а концентрацию белка определяли с помощью метода BCA. После выделения целевого белка с помощью 10% SDS-PAGE его переносили на мембрану PVDF размером 0,45 мкм. После этого мембрану герметизировали в течение 1,5 ч при температуре 25 °C с использованием 5% BSA. Первичные антитела против SHP-2 (1:1000), CYP7A1 (1:1000), Tgr5 (1:1000), NTCP (1:1000) и β-актина (1:1000) инкубировали в течение ночи при 4 °C. Затем мембрану инкубировали с козьим антителом против иммуноглобулина G (1:10000), конъюгированным с пероксидазой хрена в течение 2 ч при 25 °С. Полосы, покрытые пероксидазой, затем видели с помощью хемилюминесцентного раствора ЭКЛ со сверхвысокой чувствительностью, а снимки делали с помощью системы визуализации³⁴.

Молекулярный докинг
Как сообщалось, процесс молекулярного докинга осуществлялся по следующим^{процедурам35}. Структура препарата small molecule.mol2 была загружена с платформы ChemicalBook, а структура белка лиганда .sdf была загружена с платформ Uniprot и RCSBPDB. Молекулы лиганда и воды были удалены с помощью программного обеспечения Pymol, а белок лиганда был импортирован в программное обеспечение AutoDock для гидрирования и обнаружения. Окончательный вывод представлен в формате .pdbqt. Анализ стыковочного блока, RunAutoGrid, RunAutoDock и AutoDock Tools был выполнен в программном обеспечении AutoDock, и была сохранена минимальная энергия привязки каждой группы результатов стыковки. Была выбрана конформация с наименьшей энергией свободного связывания из каждой группы, а ее конформация лиганд-рецептор была визуализирована с помощью программного обеспечения Pymol.

Статистический анализ
Вышеупомянутые данные были статистически отсортированы с помощью GraphPad Prism 9.2, и все экспериментальные результаты были представлены как среднее значение ± SD. Для статистического сравнения данных между группами была использована односторонняя ANOVA. Разница между двумя группами была признана значимой приp < 0,05.

Результаты

Для экспериментов концентрацию CDCA устанавливали на уровне 0 μМ, 20 μМ, 40 μМ, 60 μМ, 80 μМ и 100 μМ. Когда концентрация CDCA составляла 60 мкМ, активность клеток значительно отличалась от таковой в контрольной группе, и, наконец, в качестве концентрации CDCA использовали 60 мкМ (рис. 1А). Результаты показали, что после инкубации в течение 24 ч после введения препарата не было существенной разницы в активности клеток между каждой группой и контрольной группой (рис. 1В

Обсуждение

КИК — это заболевание печени, вызванное затруднением образования, секреции или выведения желчи. Клинически он проявляется в виде зуда, остеопороза и даже перерастает в фиброз печени, цирроз печени и другие заболевания, которые серьезно угрожают жизни и здоровью 36,37,38. УДХК признана наиболее часто используемым препаратом при лечении КИК³⁹. Однако в связи с большим число...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
	ALP Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A059-2-2
ALT	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C009-2-1
AST	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C010-2-1
BCA	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR0146
CDCA	Chengdu Medesheng Technology Co., Ltd	474-25-9
Набор для подсчета клеток-8	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1160-500
Цитохром P450 7A1 Антитело	Abmart Shanghai Co., Ltd.
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1005
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Goat Anti-Rabbit IgG (H& L)	Chengdu Zen-Bioscience Co., Ltd.
Козий антикролик IgG AF488	Abmart Shanghai Co., Ltd.
GPS	Chengdu Medesheng Technology Co., Ltd	RP210717
GSH	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1
HepG2 клетки	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0103
HRP Козий антикролик IgG	Wuhan  ABclonal  Биотехнологическая компания, ООО	AS014
ИЛ-1&бета;	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H0149c
IL-6	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H6156
MDA	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-1-2
MEM базовая среда	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	PM150410
PBS	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Rapid Transfer Buffer (20×)	NCM Biotech	WB4600
RIPA	Boster Biological Technology Co., Ltd	BL651A
ROS	Beyotime Biotechnology	S0033S
SHP2 Rabbit pAb	Wuhan  ABclonal  Биотехнологическая компания, ООО	A12486
SLC10A1 антитела	Abmart Shanghai Co., Ltd.
SOD	Нанкинский институт биоинженерии	A001-3-1
TBA	Нанкинский институт биоинженерии	E003-2-1
T-CHO	Нанкинский институт биоинженерии	A111-1-1
TG	Нанкинский институт биоинженерии	A110-1-1
TGR5 Поликлональное антитело	Биотехнологическая компания	ImmunoWay YT4636
TNF-α	Elabscience Biotechnology Co., Ltd	E-EL-H0109c
Раствор трипсина (0,25%)	Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	40126ES60
UDCA	Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd	DSTDX007601
β-Actin Rabbit mAb	Wuhan  ABclonal  Биотехнологическая компания, ООО	АС026