Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Конвейер смесей для генерации молекулярных оперативных таксономических единиц (MOTU) среди прибрежных и водных жуков

914 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68323

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

В этой статье

Краткое содержание

Представленный здесь протокол призван помочь пользователям в компьютерной обработке последовательностей генов субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI), полученных от жуков, таким образом, чтобы гипотеза кластеризации видов, называемая молекулярными операционными таксономическими единицами (MOTU), могла быть сгенерирована из ДНК.

Аннотация

Сокращение биоразнообразия происходит с невообразимыми темпами, однако мониторинг биоразнообразия затрудняется множеством факторов, включая неполную инвентаризацию исходного разнообразия и сокращение числа квалифицированных таксономистов. Преодоление этого препятствия в инвентаризации видов «темных таксонов», или гиперразнообразных групп, часто недостаточно изученных в таксономии, особенно важно в тропиках, сталкивающихся с непреодолимым давлением окружающей среды. В то время как альфа-таксономия, основанная на морфологии, остается золотым стандартом в идентификации видов, методы, основанные на ДНК, демонстрируют огромный потенциал в ускорении разграничения и открытия видов. В данной статье мы описываем процесс создания молекулярных оперативных таксономических единиц (MOTU), включающий шесть подходов к разграничению молекулярных видов, реализованных на двух весьма неприметных родах жуков, а именно Byrrhinus Motschulsky, 1858 из семейства Limnichidae и Anacaena Thomson, 1859 из семейства Hydrophilidae, из Филиппин. Поскольку этот протокол ориентирован на обработку штрих-кодов ДНК и учитывая, что эти генетические данные могут быть получены либо путем секвенирования, либо путем загрузки из онлайн-баз данных, отправной точкой для описанного здесь протокола являются последовательности ДНК. Учитывая штрих-коды COI, конвейер использует комбинацию трех подходов к разграничению молекулярных видов на основе пороговых значений, а именно TaxonDNA, K2P и ASAP, которые используют выравнивание последовательностей в качестве входных данных. Кроме того, конвейер использует три подхода, основанных на коалесценции, а именно PTP-ML, PTP-BI и mPTP, для которых в качестве входных данных требуется файл дерева. Некоторые подходы предполагают использование веб-серверов, в то время как другие используют локальное программное обеспечение. С помощью представленного выбора алгоритмических методов MOTU могут быть идентифицированы как консенсусом, так и большинством. Примечательно, что этот трубопровод выявил почти заметные виды жуков с Филиппин, даже те, которые были задокументированы из тех же или соседних местностей.

Введение

В связи с беспрецедентными темпами глобального сокращения численности видов среди различных таксонов 1,2,3,4, стимулом к созданию всеобъемлющей инвентаризации биоразнообразия, включающей ранее неоткрытые и неописанные виды, становится гонка со временем 2,5. Во-первых, сохранение биоразнообразия имеет смысл только в свете надлежащих таксономических знаний 6,7. Таким образом, идентификация биоразнообразия на уровне видов является необходимой, учитывая, что близкородственные, но разные виды могут иметь уникальные фундаментальные ниши8.

В систематике жуков альфа-таксономия или традиционная таксономия является золотым стандартом в идентификации видов, подобно большинству, если не всем, группам животных9. Этот подход опирается на морфологические признаки для классификации организмов на более высоком уровне таксономии и обеспечения идентификации на уровне вида10,11. Во многих случаях идентификация по семейству12 или даже на уровне рода13 может быть проведена только с использованием внешних морфологических признаков, таких как форма тела и специализированные адаптации. Между тем, видовая идентификация у жуков обычно проводится путем сравнения структурных деталей эдеагуса или мужских гениталий 14,15,16.

Несмотря на широкое признание этой альфа-таксономии, основанной на морфологии, такой подход к открытию видов затруднен многочисленными «таксономическими препятствиями»6,17,18, особенно среди беспозвоночных19. В систематике жуков идентификация видов и/или открытие с помощью альфа-таксономии сталкивается с проблемами, связанными с ограниченным числом квалифицированных таксономистов20,21, кратких и малоинформативных более ранних описаний22, а также с логистическими проблемами, связанными с доступом к литературе и типовым образцам23.

Это еще больше усугубляется, когда таксон, о котором идет речь, является загадочным или очень незаметным. Криптические виды относятся к множеству видов одного и того же рода или даже разных родов, которые не могут быть легко разграничены с помощью сравнительной морфологии, учитывая тонкие межвидовые фенетическиеразличия. Некоторые загадочные таксоны, рассматриваемые как «темные таксоны»25,26,27, также страдают от гиперразнообразия, но в значительной степени недоизучены. К сожалению, это не редкость у прибрежных и водных жуков 8,28. Неспособность решить проблему разграничения видов среди загадочных темных таксонов угрожает биоразнообразию, поскольку для организмов с потенциально различными нишами и экологическимитребованиями предоставляется универсальная мера по сохранению 8,29.

Учитывая эти проблемы, «интегративная таксономия»23, или подход, сочетающий альфа-таксономию с другой линией доказательств, набрала обороты в качестве средства для создания новых видов в последние два десятилетия 30,31,32. Одним из таких доказательств, используемых в интегративных таксономических исследованиях жуков 33,34,35,36,37,38,39 и других отрядов насекомых 40,41,42,43,44,45, является последовательность ДНК. В частности, ген митохондриальной субъединицы I цитохром с-оксидазы (COI) используется для штрих-кодирования разнообразных животных из-за его умеренно консервативной природы 46,47,48. В то время как его 5'-конец длиной 658.н. (COI-5'), также известный как «фрагмент штрих-кодирования» или «фрагмент Фольмера», был предложен в качестве «диагностической» последовательности49, COI-3' длиной 723.о. также используется благодаря надежному набору праймеров для 3'-конца 50,51,52.

В то время как штрихкодирование ДНК с использованием COI было задумано для идентификации на уровне видов, оно ограничено априорным репозиториемпоследовательностей 53, таким как GenBank54 и BOLD55, подходы к разграничению молекулярных видов устанавливают видовые ограничения с использованием только предоставленных последовательностей ДНК без предварительного репозитория56. Существует два класса подходов к разграничению молекулярных видов на основе входного файла. Во-первых, используя выравнивание последовательностей в качестве входных данных, подходы, основанные на пороговых значениях, используют пороговые значения для определения дивергенции между видами и внутри них 48,57,58. В качестве методов, основанных на расстоянии, эти подходы опираются на наблюдаемое максимальное внутривидовое расстояние в 3% для насекомых, которое называется «пробелом в штрихкодировании»51,59. Некоторые из подходов, основанных на пороговых значениях: SpeciesIdentifier, реализованный в TaxonDNA60, генетическое расстояние через Kimura 2-parameter (K2P)61 и Assemble Species путем автоматического разбиения (ASAP)62.

Во-вторых, используя дерево в качестве входного файла, подходы, основанные на коалесценции, определяют границы видов и сортируют независимые линии, определяя изменение в скорости ветвления линий 63,64,66. Часто опираясь на филогенетическую концепцию вида67, подходы, основанные на коалесцентном процессе, включают процессы дерева Пуассона (PTP)68 и их вариации, многоскоростные PTP69. В любом случае, кластеры, образованные подходами к разграничению молекулярных видов, в совокупности называются молекулярными операциональными таксономическими единицами (MOTU).

Здесь мы представляем методы конвейера смесей для создания MOTU, включающие три подхода, основанных на пороговых значениях, и три подхода, основанных на коалесценции (рис. 1). Конвейер протестирован на двух наборах данных, а именно: (1) последовательностях COI-3' прибрежных жуков Byrrhinus Motschulsky, 1858, которые состоят из двух опубликованных видов35 , ранее построенных с использованием интегративной таксономии и дополнительных последовательностей от неописанных видов, и (2) последовательностях COI-5' жуков Anacaena Thomson, 1859, которые состоят из последовательностей двух опубликованных видов70 Ранее были построены с использованием альфа-таксономии и дополнительных последовательностей из неописанных видов.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Блок-схема конвейера смесления для генерации MOTU. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исходным материалом для этого конвейера являются последовательности ДНК, которые могут быть либо загружены из онлайновых репозиториев (например, BOLD, GenBank), либо сгенерированы с помощью секвенирования по Сэнгеру71. В таблицах 1 и 2 перечислены номера присоединений для наборов данных, репрезентативные результаты которых представлены в этом документе.

1. Подготовительный этап к подходам, основанным на пороговых значениях: выравнивание последовательностей

  1. Последовательности загрузки в MEGA X72.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MEGA X можно скачать с https://www.megasoftware.net/
    1. Нажмите « Выровнять », чтобы открыть выпадающее меню. Нажмите « Редактировать/Построить выравнивание» и выберите «Создать новое выравнивание». Нажмите OK, чтобы подтвердить этот выбор. Выберите DNA в качестве типа данных для выравнивания.
    2. Наведите указатель мыши на вкладку «Правка » и выберите «Вставить последовательность » из файла «Файл». Перейдите в директорию с последовательностями и выберите их для загрузки в MEGA.
  2. Выровняйте последовательности, нажав на Выравнивание, а затем Выровнять по ClustalW73. Продолжайте с настройками по умолчанию и нажмите OK.
  3. Вручную отредактируйте последовательности, обрезав оба конца и очистив все вставки или удаления.
    1. Чтобы удалить вставки, щелкните по вставленным основаниям и/или позициям и нажмите клавишу Delete на клавиатуре.
    2. Чтобы исправить удаление, нажмите на позицию, которая должна была быть удалена, обозначенную знаком "-". Удалите символ «-» и введите предполагаемое основание.
    3. Найдите самую раннюю позицию, где все последовательности имеют символ. Нажмите на пустое поле в заголовке строки позиции слева от определенной позиции и перетаскивайте до тех пор, пока не будут выбраны лишние позиции для всех последовательностей до начального конца. Нажмите Delete для обрезки.
    4. Повторите шаг 1.3.3, найдя последнюю позицию, где все последовательности имеют символ. Нажмите на пустое поле в строке заголовка позиции справа от определенной позиции, перетаскивайте до тех пор, пока не будут выбраны лишние позиции для всех последовательностей до конца терминала. Нажмите Delete.
      Примечание: На рисунке 2А показано хорошее выравнивание последовательностей ДНК. Итоговый набор данных представляет собой матрицу последовательностей одинаковой длины; Таким образом, длина последовательности не является фактором, влияющим на результаты исследования. Опорные последовательности служат основой для окончательной длины матрицы выравнивания.
  4. Перенесите последовательность для проверки на наличие стоп-кодонов, учитывая, что COI является последовательностью, кодирующей белок.
    1. Выберите все последовательности, затем перейдите на вкладку «Транслируемые последовательности белков».
    2. При появлении запроса проверьте генетический код как митохондриальный код беспозвоночных. Если генетический код отличается, нажмите «Нет», и появится меню, позволяющее поставить галочку в поле « Митохондриальный генетический код беспозвоночных ».
    3. Если стоп-кодоны, обозначенные звездочками в теле выравнивания, присутствуют для всего столбца, нажмите на DNA Sequences и удалите первую позицию для всех последовательностей.
    4. Повторите предыдущий шаг, если стоп-кодоны все еще присутствуют в какой-либо последовательности.
    5. Если стоп-кодоны все еще присутствуют, восстановите ранее удаленные позиции. Выделите все последовательности, затем наведите курсор мыши на вкладку « Данные » и нажмите « Реверс».
    6. Повторите шаг 1.4.1. Если стоп-кодоны все еще присутствуют, повторите шаги 1.4.3 и 1.4.4.
      Примечание: На рисунке 2B показано хорошее выравнивание кодонов.
  5. Нажмите на DNA Sequences и сохраните выравнивание последовательности в .mas/x. Экспортируйте последовательность в файлы других соответствующих типов, такие как файлы .meg и .fasta.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые подходы к разграничению молекулярных видов лучше работают без внешней группы. Таким образом, возможным соображением является создание копии файла выравнивания без внешней группы.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Выравнивание последовательностей в MEGA X. (A) Вручную очищенное окончательное выравнивание последовательности ДНК и (B) трансляционное выравнивание белковых последовательностей набора данных Byrrhinus без вставок, делеций и пробелов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Разграничение по модулю ДНК таксона в идентификаторе вида 1.8

ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор вида можно загрузить с https://taxondna.sourceforge.net/

  1. Открытая таксонДНК. Нажмите « Импорт», затем нажмите «FASTA». Загрузите выравнивание в формате .fasta.
  2. Нажмите на «Модули» и нажмите на «Кластер». Установите порог на 3%. Затем отметьте галочкой пункт Создать информацию об отдельном кластере (рисунок 3).
  3. Нажмите на Создать кластеры сейчас!. Сохраните результаты, сделав скриншот.

figure-protocol-2
Рисунок 3: ТаксонДНК в окне идентификатора вида 1.8, показывающем 3% порог для разграничения, установленный пользователем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Разграничение по 2-параметру Кимуры (K2P) в MEGA X

  1. В MEGA откройте файл .meg, нажав « Файл», затем «Открыть файл/сессию». Нажмите на Distance, затем нажмите на Compute Pairwise Distances. Подтвердите файл .meg для разграничения.
  2. Наведите курсор мыши на желтое поле рядом с Модель/Метод, затем щелкните стрелку, которая появляется справа от поля.
  3. Выберите 2-параметрическую модель Kimura в раскрывающемся меню. Нажмите « ОК», чтобы запустить программу. Откройте окно вывода данных (рисунок 4).
  4. Нажмите « Файл», затем «Экспорт/печать расстояний».
  5. Откройте раскрывающееся меню рядом с параметром «Формат вывода» и выберите XL: книга Microsoft Excel. Для Десятичных знаков выберите 4.
  6. Сохраните полученную таблицу в Microsoft Excel. Используйте Условное форматирование, чтобы выделить те, расстояние до которых меньше 0,03 (или 3%).
    Примечание: В отличие от других подходов, рассмотренных в этой статье, K2P не обеспечивает кластеризацию немедленно, поскольку она зависит от порогового значения, определенного пользователем. Этот конвейер работает на основе предположения, что порог составляет 3%, что означает, что любая пара последовательностей, генетическое расстояние от которых составляет менее 3%, принадлежит к одному и тому же молекулярному кластеру.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Результирующее окно в MEGA X, показывающее результаты параметра Kimura-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Разграничение по сборке видов с помощью автоматического разделения (ASAP)

  1. Перейдите на веб-сервер ASAP: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Загрузите выравнивание, нажав на оранжевое поле с надписью « Выбрать файл...» и выбрав файл .fasta. Либо перетащите файл .fasta в оранжевое поле. Прокрутите вниз и нажмите « Перейти».
  3. Чтобы скачать кластеризацию, нажмите на список строки с самым низким ASAP-показателем и самым высоким рангом p-val (Рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результатом является файл .txt, в котором представлены подмножества молекулярных кластеров.

figure-protocol-4
Рисунок 5: Результирующее окно в ASAP, показывающее возможные разграничения. Первый исход (синий прямоугольник) принимается из-за самого низкого ASAP-балла (красное поле) и самого высокого ранга P-val (желтое поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Подготовительный этап к коалесцентным подходам: оценка деревьев

  1. Откройте файл .meg, нажав « Данные», затем «Открыть файл/сессию». Протестируйте наиболее подходящую модель замещения.
    1. Нажмите на «Модели», затем найдите «Лучшие модели ДНК/белка (ML)». Подтвердите файл .meg для анализа.
    2. Нажмите Ok в меню Analysis Preferences (рисунок 6A). Обратите внимание на наилучшую модель, использующую наименьшее значение BIC и AICc (рис. 6B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это первая модель в списке моделей в появившемся окне. Обратитесь к полным названиям сокращенных названий моделей в нижней части появившегося окна.
  2. Сгенерируйте дерево.
    1. Нажмите на Филогенез, а затем Построить/Проверить дерево максимального правдоподобия.
    2. Используйте наиболее подходящую модель нуклеотидной замены. Для этого нажмите на желтое поле рядом с Модель/Метод. Выберите модель из выпадающего меню.
    3. Если модель замещения нуклеотидов наилучшим образом имеет значения «+G» или «+I» или и то, и другое, нажмите на поле рядом с «Коэффициентами среди сайтов» и выберите параметры (G, I, G + I) из выпадающего меню (рис. 6C).
    4. В разделе «Тест филогенеза» нажмите на поле рядом с «Тестом филогенеза» и выберите «Метод Bootstrap » в выпадающем меню. Нажмите на поле рядом с надписью «Нет. Bootstrap Replications» и тип 1000 (рис. 6C). Нажмите Ok , чтобы запустить анализ.
  3. Как только откроется окно, содержащее результирующее дерево (рисунок 6D), сохраните сеанс дерева как .mts/x. Сохраните вывод в виде файла .nwk. Сохраните также дерево .png виде файла с изображением.

figure-protocol-5
Рисунок 6: Оценка дерева в MEGA X в качестве подготовительного шага к подходам, основанным на коалесцентности. (A) Настройка для определения наиболее подходящей модели нуклеотидного замещения. (B) Для набора данных Byrrhinus наиболее подходящей моделью является GTR + I из-за самых низких значений BIC и AICc (красная рамка). (C) При запуске дерева максимального правдоподобия в качестве параметров были установлены GTR (желтый прямоугольник) + I (синий прямоугольник). (D) Полученное необработанное ML-дерево для использования в последующих анализах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Разграничение по древовидным процессам Пуассона (PTP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги приведут к получению результатов от PTP-ML и PTP-BI.

  1. Перейдите на веб-сервер PTP: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Загрузите файл newick, нажав на кнопку «Выбрать файл». В разделе Мое дерево есть выберите Rooted (рисунок 7A).
  3. Введите параметры для анализа. Под No MCMC generations, вход 100000. В разделе Прореживание введите 100. В разделе Burn-in введите 0.1. В разделе Семена, вход 123.
  4. Введите внешнюю группу, введя название кончиков в поле Названия таксонов внешней группы (если есть). Инструкции по форматированию ввода находятся справа от поля ввода.
  5. Введите адрес электронной почты в соответствующее поле и нажмите кнопку Отправить. В окне результатов определения границ видов PTP нажмите здесь , чтобы открыть окно результатов.
  6. В решении Maximum likelihood загрузите результаты PTP-ML, нажав на кнопку Скачать результаты разграничения (рис. 7B).
  7. В решении, поддерживаемом Bayesian, загрузите результаты PTP-BI, нажав на кнопку «Загрузить результаты разграничения».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты будут указывать на группы последовательностей в разделах. Они будут помечены как пронумерованные виды, за которыми следует значение поддержки, где 1,000 является идеальным.

figure-protocol-6
Рисунок 7: Разграничение молекулярных видов с помощью процессов дерева Пуассона. (A) Окна с входными параметрами. (B) Результирующее окно на веб-сервере PTP со ссылкой, содержащей результаты разграничения (красное поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. Разграничение с помощью многоскоростных процессов дерева Пуассона (mPTP)

  1. Перейдите на веб-сервер mPTP: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Загрузите файл newick, перетащив его на серый прямоугольник или щелкнув по прямоугольнику. Как только данные будут загружены на той же странице, нажмите « Перейти к выбору аутгруппы » (Рисунок 8A).
  3. На странице Спецификация внешней группы выберите внешнюю группу , щелкнув по окошку рядом с метками таксонов экземпляров внешней группы. Нажмите на опцию «Обрезать аутгруппу » в нижней части последовательности. Нажмите на Выбор модели.
  4. Нажмите на MPTP, затем нажмите на Параметры визуализации. На странице Параметры визуализации примите настройки по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, общий размер изображения можно скорректировать, введя значение (в пикселях) в поле Ширина SVG. Шрифт и интервалы между текстом можно настроить, введя желаемые размеры (в пикселях) в разделы Размер шрифта SVG, Расстояние между кончиками, Левое поле, Правое поле, Верхнее поле и Нижнее поле.
  5. Нажмите на Контактные данные. Введите адрес электронной почты для дальнейшего ознакомления с результатами (необязательно).
  6. Нажмите на «Обзор». Обязательно проверьте количество входных таксонов и выбранных внешних групп.
  7. Нажмите « Отправить». Щелкните правой кнопкой мыши файлы в разделе Загружаемые файлы (рисунок 8B) и выберите Сохранить как..., чтобы сохранить результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В выходном текстовом файле будет указано общее количество разделенных видов в начале результатов. Затем он покажет, какие последовательности попадают в каждый из кластеров. Эти кластеры и соответствующие им последовательности расположены аналогично сгенерированному дереву в файле .svg. В файле mPTP SVG будет отображаться кластеризация последовательностей. Кластеры представлены группами последовательностей, соединенных красными ветвями вдоль дерева. Каждый изолированный набор красных ветвей указывает на уникальный MOTU.

figure-protocol-7
Рисунок 8: Разграничение молекулярных видов с помощью многоскоростных процессов дерева Пуассона. (A) Окна, показывающие прочитанную mPTP информацию о загруженном дереве. (B) Результирующее окно на веб-сервере mPTP со ссылкой, содержащей результаты разграничения (красное поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. Генерация MOTU

  1. Откройте дерево с помощью фоторедактора или с помощью PowerPoint.
  2. Создайте полосу для представления результатов каждого подхода к разграничению молекулярных видов (образцы см. на рисунках 9 и 10 ). Убедитесь, что любой отдельный стержень соответствует последовательностям, которые он включает в свой молекулярный кластер.
  3. Определение MOTU по одному из этих двух подходов74
    1. Если все подходы дают идентичные результаты для данного молекулярного кластера, возводите молекулярный кластер как MOTU на основе консенсуса.
    2. Если большинство подходов дают идентичные результаты для данного молекулярного кластера, большинством голосов возводите молекулярный кластер как MOTU.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой статье был реализован конвейер разграничения молекулярных видов, который включает в себя TaxonDNA, K2P, ASAP, две вариации PTP и mPTP, для водных и прибрежных жуков. Результаты каждого из шести подходов называются «молекулярными кластерами», в то время как резюме называется «молекулярными операциональными таксономическими единицами» или MOTU75.

Конвейер смесей был протестирован на двух наборах данных. Первый набор данных (Таблица 1,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В то время как последовательности ДНК, особенно COI49, могут быть сравнены с референсными последовательностями 22,53,78 в общедоступных онлайн-репозиториях 54,55,79,80 для системы биоидентификации46, такой подход ограничен имеющимися депонирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Бюро рыболовства и водных ресурсов (BFAR) и соответствующие органы местного самоуправления за предоставление нам предварительного обоснованного согласия на проведение отбора проб биоразнообразия. Мы благодарим д-ра Хендрика Фрайтага за руководство по таксономической работе. Мы также благодарим рецензентов и редакторов за их полезные, конструктивные комментарии. Наконец, мы выражаем нашу глубочайшую благодарность гранту Большого проекта Исследовательского совета университета (URC 2022-09) и гранту на публикацию в открытом доступе Университета Атенео де Манила, Студенческому фонду исследований и разработок SC Johnson за экологическое лидерство Исследовательского института науки и техники Атенео, а также Фонду исследований систематики LinnéSys Лондонского общества Линнея и Ассоциации систематики за финансирование этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КАК МОЖНО СКОРЕЕ;Исследователь Sparthttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
КомпьютерЛюбая единица обработки
МЕГА Х Программное обеспечение MEGAhttps://www.megasoftware.net/
Веб-сервер mPTPhttps://mptp.h-its.org/#/tree
Веб-сервер PTPГейдельбергский институт теоретических исследований (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Идентификатор вида   https://taxondna.sourceforge.net/

Ссылки

  1. Ceballos, G., Ehrlich, P. R. Mammal population losses and the extinction crisis. Science. 296 (5569), 904-907 (2002).
  2. Dirzo, R., et al. Defaunation in the Anthropocene. Science. 345 (6195), 401-406 (2014).
  3. Cardoso, P., et al. Scientists' warning to humanity on insect extinctions. Biol Conserv. 242, 108426(2020).
  4. Wagner, D. L., Grames, E. M., Forister, M. L., Berenbaum, M. R., Stopak, D. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (2), 1-10 (2021).
  5. Steffen, W., Crutzen, P. J., McNeill, J. R. Welcome to the Anthropocene. Ambio. 36 (8), 614-621 (2007).
  6. de Carvalho, M. R., et al. Taxonomic impediment or impediment to taxonomy? A commentary on systematics and the cybertaxonomic-automation paradigm. Evol Biol. 34 (3-4), 140-143 (2007).
  7. Satler, J. D., Carstens, B. C., Hedin, M. Multilocus species delimitation in a complex of morphologically conserved trapdoor spiders (Mygalomorphae, Antrodiaetidae, Aliatypus). Syst Biol. 62 (6), 805-823 (2013).
  8. Arribas, P., Andújar, C., Sánchez-Fernández, D., Abellán, P., Millán, A. Integrative taxonomy and conservation of cryptic beetles in the Mediterranean region (Hydrophilidae). Zool Scr. 42 (2), 182-200 (2013).
  9. Baker, K., et al. Carpooling with ecologists, geographers and taxonomists: Perceptions from conducting environmental research in tropical regions. Biodivers Conserv. 28 (4), 975-981 (2019).
  10. Tan, D. S. H., Ang, Y., Lim, G. S., Bin Ismail, M. R., Meier, R. From "cryptic species" to integrative taxonomy: An iterative process involving DNA sequences, morphology, and behaviour leads to the resurrection of Sepsis pyrrhosoma (Sepsidae: Diptera). Zool Scr. 39 (1), 51-61 (2010).
  11. Tan, M. K., Storozhenko, S. Y., Hwang, W. S., Meier, R. Integrative taxonomy reveals two sympatric species of the genus Eucriotettix Hebard, 1930 (Orthoptera: Tetrigidae). Zootaxa. 4268 (3), 377-394 (2017).
  12. Yule, C. M. Freshwater invertebrates. Freshwater Invertebrates of the Malaysian Region. , 23-31 (2004).
  13. Komarek, A., Jäch, M. A., Ji, L. Hydrophilidae: I. Check list and key to Palearctic and Oriental genera of aquatic Hydrophilidae (Coleoptera). Water Beetles of China. 3, 383-395 (2003).
  14. Rudoy, A., Ribera, I. The macroevolution of size and complexity in insect male genitalia. PeerJ. 4, e1882(2016).
  15. Rudoy, A., Beutel, R. G., Ribera, I. Evolution of the male genitalia in the genus Limnebius Leach, 1815 (Coleoptera, Hydraenidae). Zool J Linn Soc. 178, 97-127 (2016).
  16. Shapiro, A. The lock-and-key hypothesis: Evolutionary and biosystematic interpretation of insect genitalia. Annu Rev Entomol. 34 (1), 231-245 (1989).
  17. Scotland, R., Hughes, C., Bailey, D., Wortley, A. The big machine and the much-maligned taxonomist. Syst Biodivers. 1 (2), 139-143 (2003).
  18. Vinarski, M. V. Roots of the taxonomic impediment: Is the "integrativeness" a remedy. Integr Zool. 15 (1), 2-15 (2020).
  19. Cardoso, P., Erwin, T. L., Borges, P. A. V., New, T. R. The seven impediments in invertebrate conservation and how to overcome them. Biol Conserv. 144 (11), 2647-2655 (2011).
  20. Engel, M. S., et al. The taxonomic impediment: A shortage of taxonomists, not the lack of technical approaches. Zool J Linn Soc. XX, 1-7 (2021).
  21. Tancoigne, E., Dubois, A. Cladistics taxonomy: No decline, but inertia. Cladistics. , 1-4 (2013).
  22. Riedel, A., Sagata, K., Suhardjono, Y. R., Tänzler, R., Balke, M. Integrative taxonomy on the fast track: Towards more sustainability in biodiversity research. Front Zool. 10 (15), 1-9 (2013).
  23. Dayrat, B. Towards integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 85 (3), 407-415 (2005).
  24. Bickford, D., et al. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Trends Ecol Evol. 22 (3), 148-155 (2007).
  25. Page, R. D. M. DNA barcoding and taxonomy: Dark taxa and dark texts. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1702), 20150334(2016).
  26. Morinière, J., et al. A DNA barcode library for 5,200 German flies and midges (Insecta: Diptera) and its implications for metabarcoding-based biomonitoring. Mol Ecol Resour. 19 (4), 900-928 (2019).
  27. Hartop, E., Srivathsan, A., Ronquist, F., Meier, R. Towards large-scale integrative taxonomy (LIT): Resolving the data conundrum for dark taxa. Syst Biol. 71 (6), 1404-1422 (2022).
  28. Fossen, E. I., Ekrem, T., Nilsson, A. N., Bergsten, J. Species delimitation in northern European water scavenger beetles of the genus Hydrobius (Coleoptera, Hydrophilidae). ZooKeys. 564, 71-120 (2016).
  29. Bálint, M., et al. Cryptic biodiversity loss linked to global climate change. Nat Clim Change. 1 (6), 313-318 (2011).
  30. Padial, J. M., De La Riva, I. A response to recent proposals for integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 101 (3), 747-756 (2010).
  31. Andújar, C., Arribas, P., Ruiz, C., Serrano, J., Gómez-Zurita, J. Integration of conflict into integrative taxonomy: Fitting hybridization in species delimitation of Mesocarabus (Coleoptera: Carabidae). Mol Ecol. 23 (17), 4344-4361 (2014).
  32. Schlick-Steiner, B. C., et al. Integrative taxonomy: A multisource approach to exploring biodiversity. Annu Rev Entomol. 55 (1), 421-438 (2010).
  33. Stüben, P. E., Astrin, J. J. Integrative taxonomy, phylogeny, and new species of the weevil genus Onyxacalles Stüben (Coleoptera: Curculionidae: Cryptorhynchinae). Psyche (Lond). 2012, 1-22 (2012).
  34. Hawlitschek, O., et al. Pleistocene climate change promoted rapid diversification of aquatic invertebrates in Southeast Australia. BMC Evol Biol. 12 (142), 1-15 (2012).
  35. Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Byrrhinus Motschulsky, 1858 (Coleoptera, Limnichidae, Limnichinae) from Negros, Philippines. ZooKeys. 1070, 51-72 (2021).
  36. De Vera, G. C. M., Sia, J. I. L., Freitag, H., Delocado, E. D. The first new species of Leptelmis Sharp, 1888 (Coleoptera, Elmidae) from the Philippines in the last 50 years. Tijdschr Entomol. 166 (2-3), 175-186 (2023).
  37. Seno, C. B. N., Delocado, E. D., Freitag, H. Three new species of Ancyronyx Erichson, 1847 (Coleoptera, Elmidae) from Mindanao, Philippines. Tijdschr Entomol. 72, 61-80 (2022).
  38. López-López, A., Hudson, P., Galián, J. Islands in the desert: Species delimitation and evolutionary history of Pseudotetracha tiger beetles (Coleoptera: Cicindelidae: Megacephalini) from Australian salt lakes. Mol Phylogenet Evol. 101, 279-285 (2016).
  39. Ibarra, J. W. B., Bantiding, F. J. A., Delocado, E. D. First Georissidae (Coleoptera) from the Philippines with description of two new species of Georissus Latreille, 1809. Tijdschr Entomol. , 45-58 (2025).
  40. Boonsoong, B., Sartori, M. Review and integrative taxonomy of the genus Prosopistoma Latreille, 1833 (Ephemeroptera, Prosopistomatidae) in Thailand, with description of a new species. ZooKeys. 825, 123-144 (2019).
  41. Wang, Y., Nansen, C., Zhang, Y. Integrative insect taxonomy based on morphology, mitochondrial DNA, and hyperspectral reflectance profiling. Zool J Linn Soc. 177 (2), 378-394 (2016).
  42. Schutze, M. K., et al. One and the same: Integrative taxonomic evidence that Bactrocera invadens (Diptera: Tephritidae) is the same species as the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Syst Entomol. 40 (2), 472-486 (2015).
  43. Schär, S., et al. Integrative biodiversity inventory of ants from a Sicilian archipelago reveals high diversity on young volcanic islands (Hymenoptera: Formicidae). Org Divers Evol. 20, 405-416 (2020).
  44. Ševčík, J., et al. Integrative taxonomy of Central European Planetella (Diptera: Cecidomyiidae) indicates high species diversity, intraspecific variation and low host specificity. Acta Entomol Musei Natl Pragae. 63 (2), 413-450 (2023).
  45. Mengual, X., Ståhls, G., Vujić, A., Marcos-García, M. Á Integrative taxonomy of Iberian Merodon species (Diptera, Syrphidae). Zootaxa. 1377, 1-26 (2006).
  46. Hebert, P. D. N., et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc B Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  47. Hebert, P. D. N., et al. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14812-14817 (2004).
  48. Hebert, P. D. N., Gregory, T. R. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Syst Biol. 54 (5), 852-859 (2005).
  49. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., DeWaard, J. R. Barcoding animal life: Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc Lond B. 270 (Suppl), S96-S99 (2003).
  50. Simon, C., et al. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann Entomol Soc Am. 87 (6), 651-701 (1994).
  51. Hendrich, L., et al. Mitochondrial Cox1 sequence data reliably uncover patterns of insect diversity but suffer from high lineage-idiosyncratic error rates. PLoS ONE. 5 (12), e14448(2010).
  52. Balke, M., et al. Suggestions for a molecular biodiversity assessment of Southeast Asian freshwater invertebrates: Lessons from the megadiverse beetles (Coleoptera). J Limnol. 72 (Suppl 2), 61-68 (2013).
  53. Virgilio, M., et al. Comparative performances of DNA barcoding across insect orders. BMC Bioinformatics. 11, 206(2010).
  54. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Res. 41 (D1), 36-42 (2013).
  55. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. BOLD: The barcode of life data system. Mol Ecol Notes. 7, 355-364 (2007).
  56. Pons, J., et al. Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects. Syst Biol. 55 (4), 595-609 (2006).
  57. Puillandre, N., et al. automatic barcode gap discovery for primary species delimitation. Mol Ecol. 21 (8), 1864-1877 (2012).
  58. Fontaneto, D., Flot, J. F., Tang, C. Q. Guidelines for DNA taxonomy, with a focus on the meiofauna. Mar Biodivers. 45 (3), 433-451 (2015).
  59. Balke, M., et al. New Guinea highland origin of a widespread arthropod supertramp. Proc R Soc B Biol Sci. 276 (1666), 2359-2367 (2009).
  60. Meier, R., et al. DNA barcoding and taxonomy in Diptera: A tale of high intraspecific variability and low identification success. Syst Biol. 55 (5), 715-728 (2006).
  61. Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 16 (2), 111-120 (1980).
  62. Puillandre, N., Brouillet, S., Achaz, G. ASAP: Assemble species by automatic partitioning. Mol Ecol Resour. 21 (2), 609-620 (2021).
  63. Wiens, J. J., Penkrot, T. A. Delimiting species using DNA and morphological variation and discordant species limits in spiny lizards (Sceloporus). Syst Biol. 51 (1), 69-91 (2002).
  64. Fujisawa, T., Barraclough, T. G. Delimiting species using single-locus data and the generalized mixed Yule coalescent approach: A revised method and evaluation on simulated data sets. Syst Biol. 62 (5), 707-724 (2013).
  65. Yang, Z., Rannala, B. Unguided species delimitation using DNA sequence data from multiple loci. Mol Biol Evol. 31 (12), 3125-3135 (2014).
  66. Leaché, A. D., Fujita, M. K. Bayesian species delimitation in West African forest geckos (Hemidactylus fasciatus). Proc R Soc B Biol Sci. 277 (1697), 3071-3077 (2010).
  67. Luo, A., et al. Comparison of methods for molecular species delimitation across a range of speciation scenarios. Syst Biol. 67 (5), 830-846 (2018).
  68. Zhang, J., et al. A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics. 29 (22), 2869-2876 (2013).
  69. Kapli, P., et al. Multi-rate Poisson tree processes for single-locus species delimitation under maximum likelihood and Markov chain Monte Carlo. Bioinformatics. 33 (11), 1630-1638 (2017).
  70. Sanchez, E. G. S., Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Anacaena Thomson, 1859 (Coleoptera, Hydrophilidae) from the Philippines. ZooKeys. 1112, 11-25 (2022).
  71. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  72. Kumar, S., et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 35 (6), 1547-1549 (2018).
  73. Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994).
  74. Pentinsaari, M., Vos, R., Mutanen, M. Algorithmic single-locus species delimitation: Effects of sampling effort, variation and nonmonophyly in four methods and 1870 species of beetles. Mol Ecol Resour. 17 (3), 393-404 (2017).
  75. Galimberti, A., et al. Integrated operational taxonomic units (IOTUs) in echolocating bats: A bridge between molecular and traditional taxonomy. PLoS ONE. 7 (6), e40122(2012).
  76. Kundrata, R., Jäch, M. A., Bocak, L. Molecular phylogeny of the Byrrhoidea-Buprestoidea complex (Coleoptera, Elateriformia). Zool Scr. 46 (2), 150-164 (2017).
  77. Komarek, A., Freitag, H. Taxonomic revision of Agraphydrus Règimbart, 1903 V. Philippine species and their first DNA barcodes. Koleopt Rundsch. 90, 201-242 (2020).
  78. Tautz, D., et al. A plea for DNA taxonomy. Trends Ecol Evol. 18 (2), 70-74 (2003).
  79. Altschul, S. F., et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  80. Porter, T., Hajibabaei, M. Over 2.5 million COI sequences in GenBank and growing. bioRxiv. , 353904(2018).
  81. Gómez, R. A., Reddell, J., Will, K., Moore, W. Up high and down low: Molecular systematics and insight into the diversification of the ground beetle genus Rhadine LeConte. Mol Phylogenet Evol. 98, 161-175 (2016).
  82. Kodada, J., et al. Ancyronyx clisteri, a new spider riffle beetle species from Borneo, redescription of A. sarawacensis Jäch including a description of the larva and new distribution data for A. procerus Jäch using DNA barcodes (Coleoptera, Elmidae). ZooKeys. 912, 25-64 (2020).
  83. Hajibabaei, M., Janzen, D. H., Burns, J. M., Hallwachs, W., Hebert, P. D. N. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (4), 968-971 (2006).
  84. Yeo, D., Srivathsan, A., Meier, R. Longer is not always better: Optimizing barcode length for large-scale species discovery and identification. Syst Biol. 69 (5), 999-1015 (2020).
  85. Sabordo, M. R., Delocado, E., Freitag, H. Two new species of the genus Ancyronyx Erichson, 1847 from the island of Negros, Philippines (Insecta, Coleoptera, Elmidae). Tijdschr Entomol. 163 (1), 13-30 (2020).
  86. Astrin, J. J., et al. Exploring diversity in cryptorhynchine weevils (Coleoptera) using distance-, character- and tree-based species delineation. Mol Phylogenet Evol. 63 (1), 1-14 (2012).
  87. Pritchard, J. K., Stephens, M., Donnelly, P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics. 155, 945-959 (2000).
  88. Huelsenbeck, J. P., Andolfatto, P., Huelsenbeck, E. T. Structurama: Bayesian inference of population structure. Evol Bioinform. 7, 55-59 (2011).
  89. Hausdorf, B., Hennig, C. Species delimitation using dominant and codominant multilocus markers. Syst Biol. 59 (5), 491-503 (2010).
  90. Fujita, M. K., et al. Coalescent-based species delimitation in an integrative taxonomy. Trends Ecol Evol. 27 (9), 480-488 (2012).
  91. Monaghan, M. T., et al. Accelerated species inventory on Madagascar using coalescent-based models of species delineation. Syst Biol. 58 (3), 298-311 (2009).
  92. Yang, Z., Rannala, B. Bayesian species delimitation using multilocus sequence data. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (20), 9264-9269 (2010).
  93. Ence, D. D., Carstens, B. C. SpedeSTEM: A rapid and accurate method for species delimitation. Mol Ecol Resour. 11 (3), 473-480 (2011).
  94. de Queiroz, K. Species concepts and species delimitation. Syst Biol. 56 (6), 879-886 (2007).
  95. Blair, C., Bryson, R. W. Cryptic diversity and discordance in single-locus species delimitation methods within horned lizards (Phrynosomatidae: Phrynosoma). Mol Ecol Resour. 17 (6), 1168-1182 (2017).
  96. Dellicour, S., Flot, J. F. Delimiting species-poor data sets using single molecular markers: A study of barcode gaps, haplowebs and GMYC. Syst Biol. 64 (6), 900-908 (2015).
  97. Dellicour, S., Flot, J. F. The hitchhiker's guide to single-locus species delimitation. Mol Ecol Resour. 18 (6), 1234-1246 (2018).
  98. Liu, L., et al. Estimating phylogenetic trees from genome-scale data. Ann N Y Acad Sci. 1360 (1), 36-53 (2015).
  99. Lim, G. S., Balke, M., Meier, R. Determining species boundaries in a world full of rarity: Singletons, species delimitation methods. Syst Biol. 61 (1), 165-169 (2012).
  100. Zhou, Z., et al. molecular species delimitation based on COI-5P barcode sequences revealed high cryptic/undescribed diversity for Chinese katydids (Orthoptera: Tettigoniidae). BMC Evol Biol. 19 (1), (2019).
  101. Toussaint, E. F. A., et al. Comparative molecular species delimitation in the charismatic Nawab butterflies (Nymphalidae, Charaxinae, Polyura). Mol Phylogenet Evol. 91, 194-209 (2015).
  102. Carstens, B. C., Dewey, T. A. Species delimitation using a combined coalescent and information-theoretic approach: An example from North American Myotis bats. Syst Biol. 59 (4), 400-414 (2010).
  103. Esselstyn, J. A., et al. Single-locus species delimitation: A test of the mixed Yule-coalescent model, with an empirical application to Philippine round-leaf bats. Proc R Soc Lond B. 279 (1743), 3678-3686 (2012).
  104. Stech, M., et al. Molecular species delimitation in the Racomitrium canescens complex (Grimmiaceae) and implications for DNA barcoding of species complexes in mosses. PLoS One. 8 (1), e53134(2013).
  105. Kekkonen, M., Hebert, P. D. N. DNA barcode-based delineation of putative species: Efficient start for taxonomic workflows. Mol Ecol Resour. 14 (4), 706-715 (2014).
  106. Meier, R., et al. "Dark taxonomy": A new protocol for overcoming the taxonomic impediments for dark taxa and broadening the taxon base for biodiversity assessment. Cladistics. 41, 223-238 (2025).
  107. Ebach, M. C., Holdrege, C. DNA barcoding is no substitute for taxonomy. Nature. 434, 697(2005).
  108. Ebach, M. C., Holdrege, C. More taxonomy, not DNA barcoding. BioScience. 55 (10), 822-823 (2005).
  109. Mora, C., et al. How many species are there on Earth and in the ocean. PLoS Biol. 9 (8), e1001127(2011).
  110. Stork, N. E. How many species of insects and other terrestrial arthropods are there on Earth. Annu Rev Entomol. 63, 31-45 (2018).
  111. Scheffers, B. R., et al. What we know and don't know about Earth's missing biodiversity. Trends Ecol Evol. 27 (9), 501-510 (2012).
  112. Carbayo, F., Marques, A. C. The cost of describing the entire animal kingdom. Trends Ecol Evol. 26 (4), 153-154 (2011).
  113. Walsh, J. C., et al. Trends and biases in the listing and recovery planning for threatened species: An Australian case study. Oryx. 47 (1), 134-143 (2013).
  114. Carrizo, S. F., et al. Freshwater megafauna: Flagships for freshwater biodiversity under threat. BioScience. 67 (10), 919-927 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MOTUCOI2
Конвейер смесей для генерации молекулярных оперативных таксономических единиц (MOTU) среди прибрежных и водных жуков
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.