В протоколе описан метод создания модели органоида колоректального рака (КРР), полученной от пациента, совместно культивируемой с инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TILs) для изучения их взаимодействия и терапевтического потенциала. Эта модель обеспечивает доклиническую платформу для изучения иммунных реакций в микроокружении опухоли и прогнозирования эффективности терапии на основе TIL для персонализированного лечения КРР.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание системы совместного культивирования органоидов колоректальных опухолей и инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Колоректальный рак (КРР) является третьим по распространенности онкологическим заболеванием во всем мире. Инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs) были идентифицированы как важный прогностический маркер при КРР. Терапевтическое применение TILs уже показало многообещающие результаты при меланоме и раке шейки матки. Тем не менее, их использование в терапии КРР остается в исследовательской фазе. Подходящая модель in vitro для оценки эффективности TIL в настоящее время недоступна, что препятствует дальнейшему прогрессу в этой области. Модели органоидов, полученных от пациента (PDO), которые точно сохраняют характеристики исходной опухолевой ткани и отражают межпациентскую гетерогенность, обеспечивают отличную платформу для изучения взаимодействия между CRC и TILs. В данном исследовании описан метод создания модели органоида CRC, полученной от пациента, из свежерезецированной опухолевой ткани с последующей изоляцией и расширением TILs. Эта система позволяет совместно культивировать органоиды CRC и TILs, что позволяет оценить TIL-опосредованную цитотоксичность и иммунные реакции. Анализируя эффективность уничтожения TIL на органоидах, можно предсказать потенциальные результаты иммунотерапии на основе TIL для персонализированного лечения КРР. Кроме того, дальнейшая инженерия TILs может повысить их противоопухолевую эффективность, предлагая многообещающую стратегию для разработки более эффективных клеточных терапий. Эта модель совместного культивирования PDO-TIL предоставляет мощный инструмент для доклинической оценки терапии TIL и персонализированных стратегий лечения при КРР.
Введение
Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных и смертельных видов рака во всем мире, представляющим собой серьезную проблему общественного здравоохранения1. Несмотря на достижения в области методов лечения, включая хирургию, химиотерапию и иммунотерапию, прогноз для пациентов с КРР, особенно с метастатическим заболеванием, остается плохим. Опухолевое микроокружение (ТМЭ) играет жизненно важную роль в формировании прогрессирования рака и ответе на лечение, при этом инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs) становятся ключевым компонентом, влияющим на иммунный ответ против рака
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с использованием материалов человеческого происхождения проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и были заранее одобрены Комитетом по этике больницы Чжуншань, входящей в состав Даляньского университета (номер одобрения: KY2023-206-1). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, предоставивших клинические образцы для данного исследования. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
Критерии включения включали патологически подтвержденную первичную ткань колоректального рака, достаточны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Установление и определение характеристик CRC PDO
Образцы опухолей были получены от пациентов с КРР. Свежерезецированная опухолевая ткань КРР была использована для установления PDO и TILs, которые впоследствии были использованы в экспериментах по совместному культивированию PDO-TIL (Рисунок 1).
Рису.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании используется ткань CRC, полученная от пациента, для получения как опухолевых клеток, так и TILs, из которых устанавливаются PDO и расширяются TILs. Взаимодействие между этими двумя компонентами затем исследуется через систему сокультуры.
В предыдущих исследованиях TILs экстрагировали с использованием сложных инструментов19 или непосредственно из суспензий опухолевой ткани20. Однако эти методы .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая [82172822]; Программа поддержки инноваций высокого уровня Даляньского научно-технического бюро [2021RD02]; Совместный план научно-технической программы провинции Ляонин [2024JH2/102600067]; Проект международного научно-технического сотрудничества провинции Ляонин [2024JH2/101900006].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| 2-Меркаптоэтанол | сигма | 63689 | |
| 4% параформальдегида | ББИ | E672002-0100 | |
| 7-ААД | Биолегенда | 420403 | |
| А83-01 | Токрис | 2939 | |
| Доплата B27 | Gibco | 17504-44 | |
| КД107а-ПЭ-цианин7 | Биолегенда | 328618 | |
| КД279-ПЭ | Биолегенда | 329906 | |
| Моноклональное антитело к CD3 (OKT3) | Инвитроген | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Биолегенда | 300406 | |
| CD45 (внутриклеточный домен) (D9M8I) | САНТИСТОКС | 13917С | |
| CD4-APC/Cyanine7 | Биолегенда | 300518 | |
| CD8-APC | Биолегенда | 344722 | |
| КДХ-2 | MXB | РМА-0631 | |
| СК20 | MXB | Кит-0025 | |
| СК7 | MXB | Набор-0021 | |
| Dylight 488, Козий антикролик IgG | Аббкин | А23220 | |
| Dylight 549, Противомышиный IgG для коз | Аббкин | А23310 | |
| ЭФР | Пепротех | АФ-100-15 | |
| Система EpCAM | САНТИСТОКС | 36746Т | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Селлмакс | СА211.02 | |
| ФГФ 10 | Пепротех | 100-26 | |
| Гастрин (человек) | Токрис | 3006 | |
| ГлутаМакс 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Хепес | Сигма | Н4034 | |
| ХЕПЕС | Сигма | Н4034 | |
| Набор для разделения клеток CD3+ человека (RUO) | Задний привод | К1201-10 | |
| Рекомбинантный белок ИФН-гамма человека | ПепроТех | 300-02-20УГ | |
| Ки-67 | САНТИСТОКС | 9449с | |
| Матригель | CORNING | 354234 | |
| N-ацетилцистеин | Сигма | А9165 | |
| Никотинамид | Сигма | Н0636 | |
| Ниволумаб (анти-PD-1) | Селлерк | А2002 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Сигма | V900929 | |
| пенициллин-стрептомицин | НКМ Биотех | С100К5 | |
| Примоцин | Инвивоген | Ант-пм-1 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | термо-инвитроген | 00-4300-54 | |
| Рекомбинантный человеческий IL-2 (без носителей) | Биолегенда | 589104 | |
| РПМИ 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Селлерк | С1077 | |
| Морилка Трипан Синий 0.4% | термо-инвитроген | Т10282 | |
| Ultra-LEAF Очищенное античеловеческое антитело к CD28 | Биолегенда | 302934 | |
| Ultra-LEAF Очищенное антитело к человеческому CD3 | Биолегенда | 317325 | |
| У-27632 | Селлерк | С1049 |
Ссылки
- Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
- Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
- Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
