Это первая часть комплексного протокола отбора проб Xenopus . Образцы тканей включают желудочек сердца, артериальный ствол, левую долю печени, желчный пузырь, легкие, поджелудочную железу, селезенку, гортань, пищевод, желудок, кишечник, яички, жировые тела, яйцевод, парные почки, седалищное сплетение, кожу, тимус и весь глаз.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективные методы комплексного отбора проб доступных тканей у взрослых Xenopus
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Xenopus долгое время был ключевым модельным организмом для изучения развития и болезней позвоночных, предлагая глубокое понимание клеточных процессов и функций генов. Несмотря на обилие информации об эмбриональном Xenopus, остается значительный пробел в стандартизированных методах забора образцов тканей взрослого человека, особенно в современных подходах, таких как количественная протеомика. В этом исследовании представлен комплексный протокол для быстрого, точного и эффективного отбора проб нескольких тканей у взрослого Xenopus. Протокол решает проблемы, связанные с тонкими анатомическими различиями по сравнению с другими бесхвостыми, обеспечивая воспроизводимость даже для тех, кто имеет ограниченный опыт вскрытия лягушек. Этот протокол оптимизирован для высококачественного биохимического анализа с приоритетом свежести образца. Мы обеспечиваем быстрый сбор до 18 тканей в течение часа. Кроме того, методы применимы к перфузированным и неперфузированным условиям, обеспечивая гибкость для ряда экспериментальных потребностей. Эта работа не только заполняет критический методологический пробел для Xenopus laevis и tropicalis , но и служит ценным ресурсом для исследователей, адаптирующих методы к аналогичным моделям амфибий, тем самым расширяя масштабы и надежность сравнительных биологических и эволюционных исследований.
Введение
Xenopus обладает уникальными преимуществами по сравнению с мышами, рыбками данио и другими модельными организмами для изучения болезней человека, особенно в контексте развития и эволюции. Его внешнее эмбриональное развитие и большие, легко манипулируемые эмбрионы позволяют наблюдать в режиме реального времени и проводить экспериментальные вмешательства (например, пересадку тканей, редактирование генов), которые сложны у мышей, развиваются внутри и требуют инвазивных процедур. Кроме того, трехкамерное сердце Xenopus и конечности четвероногих обеспечивают более прямой эволюционный мост для изучения врожденных дефектов1, регенерации конечностей2 и развития сердца3. В отличие от мышей, головастики Xenopus могут регенерировать конечности и органы, моделируя регенеративные процессы, отсутствующие у млекопитающих, в то время как их водная стадия жизни позволяет неинвазивно изучать воздействие окружающей среды или токсинов. В сочетании с более быстрым разведением, более низкими затратами и меньшим количеством этических ограничений, Xenopus превосходен для высокопроизводительных, механистических исследований органогенеза и стрессовых реакций, которые трудно воспроизвести в системах млекопитающих.
Цель данной статьи – дать четкое руководство по точному и воспроизводимому отбору проб органов тканей взрослых особей Xenopus, как это доступно для головастиков Xenopus 4. Несмотря на то, что «цифровая диссекция»5 и «микрокомпьютерная томография»6 взрослого Xenopus доступны, достижение согласованного отбора образцов органов и тканей у взрослых Xenopus остается затруднительным без подробных инструкций, предоставленных для других взрослых моделей, таких как мыши 7,8,9.
Несмотря на то, что руководство по выборке образцов для шести важнейших тканей доступно10, в настоящее время не доступно специального и подробного руководства по препарированию и отбору образцов для Xenopus . Существует всеобъемлющее руководство по вскрытию для Rana sp.11 и различные руководства по вскрытию в классе для других бесхвостых12, однако для людей, которые не имеют опыта в методах отбора проб или анатомии амфибий, тонкие различия между Xenopus и другими бесхвостыми делают существующие ресурсы недостаточными для последовательного и воспроизводимого забора образцов тканей.
Это руководство было разработано с учетом приоритета свежести тканей для протеомики и иммунохимии. Опытный пользователь считает, что все ткани могут быть собраны у одного человека менее чем за час. Если пользователю не хватает опыта, рекомендуется попробовать применить этот протокол на экземплярах, которые были усыплены по другим причинам, прежде чем приносить в жертву любое животное, которое сложнее заменить.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты были одобрены и проведены в соответствии с правилами и нормами Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3). Если перед отбором проб соблюдается протоколперфузии 13 , перейдите к шагу 2.3.
1. Подготовка (без перфузии)
- Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило методику эвтаназии, описанную в этом протоколе.
- Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаина метансульфоната) и 5 г/л гидрокарбоната натрия (см. Таблицу материалов). Проверьте pH, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем должен быть больше, чем объем, необходимый для полного покрытия усыпляемых животных. - Проведите первичную эвтаназию, поместив Xenopus в раствор MS-222 (начиная с шага 1.2), удерживая животное под водой в общей сложности 1 час14 минут.
- Поместите поверхность для вскрытия (лоток или лист пенопласта) под наклоном внутри вторичного контейнера или расположите ее иным образом, чтобы облегчить отток крови.
- После того, как лягушка пробыла в растворе 1 ч, первичная эвтаназия была завершена. Удалите лягушку и проверьте потерю болевой реакции, выполнив щиплет ногой.
- Запишите возраст (если известны), пол и состояние здоровья животного, для которого отбирается проба, а также то, было ли оно перфузировано. Взвесьте Xenopus и проведите необходимые дополнительные измерения перед отбором проб.
- Положите лягушку на спину и прижмите передние конечности проксимальнее тела (рисунок 1A).
- С помощью ножниц для рассечения разрежьте кожу вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута.
- Определите белую линию (рисунок 1B). С помощью щипцов захватите белую линию и оттяните ее от целомической полости. Осторожно с помощью ножниц разрежьте по направлению к голове, через мускулатуру. Сделайте две заслонки из стенки полости и вырежьте или приколите все заслонки.
- Определите сердце, которое еще должно биться. Если сердце недоступно, используйте ножницы для препарирования, чтобы уменьшить коракоидные кости (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердце перестало биться до отбора пробы, это означает, что свежесть образца нарушена. - При желании пройдите протокол быстрой перфузии9.
2. Отбор проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное было перфузировано, перейдите к шагу 2.3. Все поля должны составлять примерно 25 мм. Щипцы и ножницы следует протирать или заменять между образцами. Все ткани должны быть отобраны в течение 1 ч после эвтаназии для обеспечения максимальной свежести.
- С помощью пипетки для переноса промойте целомическую полость охлажденным PBS или 0,7x PBS15 , чтобы очистить кровь и сохранить видимость.
- Определите тонкий перикард (рисунок 2A) и подтяните его с помощью тканевых щипцов. С помощью кончика ножниц для иридэктомии аккуратно проделайте его перфорацию, стараясь не порезать подлежащие ткани. Отшлифуйте перикард вверх от трех камер сердца (рисунок 2B).
- Обрежьте ушные раковины, разрезав их там, где они встречаются с желудочком и артериальным стволом.
- С помощью щипцов захватите желудочек за верхушку и разрежьте его ниже того места, где он встречается с артериальным стволом, оставив край (рисунок 2C).
- Визуально осмотрите желудочек под увеличением, чтобы убедиться в отсутствии прикрепления нежелательных тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центр желудочка может включать светлую спиральную ткань клапана; Это можно сохранить. У животных без перфузии удаление желудочка может быть квалифицировано как вторичная эвтаназия (также называемая терминальной анестезией). - Сразу после отбора проб промойте образцы тканей в охлажденном PBS или 0,7x PBS, в зависимости от экспериментальных потребностей15.
ПРИМЕЧАНИЕ: У животных, подвергшихся перфузии, ожидается, что все ткани, за исключением печени, будут промываться чисто. Если это не так, то следует сделать пометку. В неперфузированных тканях все промывающие среды будут пропитаны кровью. Шаги 2.5–2.6 должны быть выполнены после взятия образца каждой ткани. - Обратите внимание, что артериальный ствол разветвляется на два аортальных ствола (также называемых латеральными аортами) и что каждый из них разделяется на три артериальные дуги (рисунок 2D). Натяните артериальный ствол и разрежьте стволы аорты сразу после того места, где эти дуги разделяются.
- Понаблюдайте за тремя долями печени (рисунок 3А). Возьмитесь за губу левой доли (справа от зрителя) и аккуратно приподнимите ее так, чтобы были видны печеночные и пузырные протоки. Возьмите образец из нижних 2/3 лопасти, расположенной ниже этих насадок (рис. 3B).
- Определите желчный пузырь, цвет которого может сильно различаться. Возьмитесь за желчный пузырь, оттяните его от правой доли печени и разорвите прикрепление (рисунок 3C). Если он не лопнул, то разорвите его ножницами для иридэктомии.
- Возьмитесь за верхушку легкого и натяните ее. Обратите внимание на текстуру альвеол и определите, где заканчивается эта текстура и начинается бронх. Разрежьте по этому полю (Рисунок 3D). Если легкое срастается с брюшиной, осторожно отсоедините его.
- Определите яичник, который покрыт слоем висцеральной брюшины, называемой зародышевым эпителием. Аккуратно сдвиньте лепестки, пока они не окажутся на своих сторонах, чтобы сделать видимой область крепления (Рисунок 4A); Эти прикрепления находятся непосредственно вентрально по отношению к парной почке. С помощью ножниц удалите яичники как можно ближе к почкам, не повреждая их (рисунок 4В). Во время этого процесса, если ооциты вытекают, возьмите их образцы, а затем промойте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление яичника полезно для получения лучшего доступа к тканям самки лягушки. - Осмотрите переднюю долю печени (также называемую срединной долей) и обратите внимание, как она соединяется с желудком и двенадцатиперстной кишкой через брыжейку (рис. 3А и рис. 4В). Разорвите брыжейку и гепатодуоденальную связку с помощью иридэктомических ножниц. Оставшаяся мясистая масса – это поджелудочная железа и общий желчный проток.
- Перерезать соединение поджелудочной железы и общего желчного протока с передней долей печени, оставив край. Обхватите живот зубчатыми щипцами и один конец поджелудочной железы тканевыми щипцами. Под увеличением осторожно дразните поджелудочную железу от живота (рисунок 4D).
- Если поджелудочная железа не отделяется чисто, удалите оставшуюся ткань поджелудочной железы. В качестве альтернативы можно методично отделить поджелудочную железу с помощью иридэктомических ножниц и тканевых щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к общему желчному протоку, ожидается, что в этот образец будут включены некоторые брыжейки и проток поджелудочной железы.
- Если поджелудочная железа не отделяется чисто, удалите оставшуюся ткань поджелудочной железы. В качестве альтернативы можно методично отделить поджелудочную железу с помощью иридэктомических ножниц и тканевых щипцов.
- Определите селезенку и возьмите ее образец, разрезав прикрепление к брюшине (рисунок 4E).
- Удалите и утилизируйте оставшиеся ткани печени.
- Удалите другое легкое и оставшийся бронх в том месте, где они прикрепляются к гортани. Взявшись за гортань за ее нижний конец, начинайте поднимать ее из полости, разрывая прозрачные прикрепления по мере их становления очевидными.
- По мере поднятия гортани станет заметным ее прикрепление к пищеводу. Осторожно очистите и разрежьте ткань пищевода в сторону от гортани с помощью изогнутых ножниц для иридэктомии (рисунок 5А). Затем потяните гортань вниз и обрежьте ее подальше от ротовой полости. Отрежьте все прозрачные вложения, которые становятся очевидными.
- Обратите внимание на искривление желудка, которое отличает его от пищевода, а также на пилорическое сужение, которое отличает желудок от кишечника (рисунок 5B). Разрежьте пищеварительный канал непосредственно перед искривлением желудка, отделив его от пищевода.
- Откройте рот и определите общее отверстие евстахиевых труб на его крыше16. Открыв рот, потяните за пищевод, чтобы отметить его прикрепление (рисунок 5C). Поднимите пищевод из полости, попутно отрезая прозрачные прикрепления. Отделите пищевод от щечной полости сразу после евстахиева отверстия.
- Возьмитесь за живот и разрежьте его там, где он встречается с двенадцатиперстной кишкой, в месте сужения привратника (рис. 5А, В).
- Натяните толстую кишку и разрежьте ее как можно ближе к клоаке (Рисунок 5D). Вытащите кишечник, отрезав все явные брюшинные прикрепления.
- Если лягушка самец, определите семенники и удалите одно из них с помощью ножниц для иридэктомии, стараясь не повредить подлежащую почку (рисунок 6A).
- Раздразните толстые тела так, чтобы они оказались на своих боках; Область над почкой, где жировое тело соединяется с брюшиной, будет видна. Возьмитесь за основание любого из толстых тел и ножницами отрежьте его от брюшины, оставив поле (Рисунок 6B).
- Определите и удалите мочевой пузырь, разрезав его как можно ближе к клоаке (рисунок 6C).
- Если лягушка является самкой или имеет отчетливый рудиментарный яйцевод, возьмитесь за нижний конец яйцевода, оттяните его от клоаки и разрежьте как можно ближе к клоаке (рисунок 6D). Вытяните яйцевод из целомической полости, разрывая любые перитонеальные прикрепления по мере их появления (Рисунок 6E).
- Удалите и утилизируйте оставшиеся жировые тельца и семенники или яйцевод.
- С помощью щипцов обхватите почки у их нижнего основания и обратите внимание, что они закрыты прозрачной брюшиной (забрюшинной)17. Разрежьте брюшину у основания почки (Рисунок 7A), а затем поднимите почки из целомической полости (Рисунок 7B), при необходимости разрезая брюшину ножницами.
- Под увеличением отрежьте излишки брюшины и остатки жировой ткани, яичников или яичек.
- Наблюдайте за пучком периферических нервов, прикрепляющих окончание позвоночного столба к каждой ноге; Это седалищное сплетение. Захватите пучок нервов щипцами и разрежьте их в том месте, где они выходят из целомической полости (рисунок 7C). Поднимите пучок из полости и разрежьте его в том месте, где нервы отходят от позвоночного столба (рисунок 7D).
- Извлеките булавки из животного, наденьте его на вентиляционное отверстие и снова приколите конечности животного. Выберите любую заднюю конечность для образца и приколите ногу этой конечности.
- Удалите миндалевидный лоскут кожи над икроножной мышцей/большеберцовой кости (рис. 8A, B).
- Возьмитесь за кожу тыльной стороны и разрежьте сбоку так, чтобы вокруг живота получился непрерывный разрез (Рисунок 8C).
- Снимите штифты, закрепите ноги в одной руке и обхватите переднюю спинную кожу зубчатыми щипцами. Снимите шкуру с животного, натянув спинную кожу вверх над головой и руками с усилием (рисунок 8D).
- Определите жировую массу, покрывающую челюстной сустав, отрежьте задний край массы от места, где она срастается с розовыми мышечными тканями, а затем с помощью ножниц для иридэктомии отрежьте ее от подлежащей кости (рисунок 9A). В зависимости от возраста и зрелости животного станет очевидным скопление меланофоров (рисунок 9B). Обрежьте массу так, чтобы не было прикрепленных мышечных прикреплений или хрящей.
- Репите животное и выберите глаз. Вставьте изогнутые иридэктомические ножницы в глазницу вокруг искривления глаза (рисунок 9C). Аккуратно разрежьте вокруг глаза, отрезая мышечные прикрепления.
- Сдвиньте ножницы вглубь глазницы и отсоедините зрительный нерв за глазом. Используйте эти ножницы, чтобы вытеснить глаз из орбиты, а затем еще больше уменьшить любые мышечные прикрепления.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя всем шагам этого протокола, желудочек сердца, артериальный ствол, левая доля печени, желчный пузырь, легкое, поджелудочная железа, селезенка, гортань, пищевод, желудок, кишечник, яички, жировые тела, яйцевод, парные почки, седалищное сплетение, кожа, тимус и весь глаз были аккуратно удалены в течение часа после эвтаназии (см. рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный здесь протокол разработан для обеспечения гибкости для пользователей с разным уровнем опыта, обеспечивая при этом своевременный и эффективный сбор необходимых тканей. Новым пользователям рекомендуется следовать каждому шагу в протоколе, как описано, чтобы обеспечить систематический сбор тканей. Однако более опытные пользователи могут пропустить определенные шаги и взять образцы только тех тканей, которые им необходимы. Например, доступ к селезенке, которая находится за бры...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом NIH OD R24 ODO31956. Мы также хотели бы поблагодарить Саманту Джалберт и Джилл Ралстон за их помощь и поддержку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 5x Увеличительное стекло со светодиодной подсветкой и подставкой | amazon.com | B08QJ6J8P1 | свет не должен выделять тепло |
| Одноразовые переводные пипетки | VWR | 414004-036 | |
| Препарирующие тонкозаостренные щипцы | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Ножницы для препарирования острый пионт, прямой 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Диссекционный лоток | Fisher Scientific | 14-370-284 | листы из пенополистирола являются приемлемой альтернативой |
| контейнеру для эвтаназии | US Plastic | Предмет 2860 | альтернативных непрозрачных контейнеров приемлемая |
| крышка контейнера для эвтаназии | US Plastic | Предмет 3047 | |
| Ножницы для иридэктомии 6" | VWR | 470018-938 | Ножницы для радужной оболочки являются приемлемой альтернативой |
| MS-222: Синкаин (ранее трикаин) | Pentair AES | TRS1 | |
| Щипцы для зубной ткани крысы 5,5 дюйма, нержавеющая сталь | Fisher Scientific | S08100 | |
| Бикарбонат натрия, порошок, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Образец щипцов, зубчатый | VWR | 82027-442 | |
| Т-образные штифты для препарирования | Fisher Scinetific | S99385 |
Ссылки
- Duncan, A. R., Khokha, M. K. Xenopus as a model organism for birth defects—Congenital heart disease and heterotaxy. Semin Cell Biol. 51, 73(2016).
- Kawasumi-Kita, A., et al. hoxc12/c13 as key regulators for rebooting the developmental program in Xenopus limb regeneration. Nat Commun. 15, 3340(2024).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), (2017).
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Laznovsky, J., et al. Unveiling vertebrate development dynamics in frog Xenopus laevis using micro-CT imaging. Gigascience. 13, giae037(2024).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult Xenopus. J Vis Exp. (204), (2024).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a frog (Rana sp.). Atlas of animal anatomy and histology. , Springer. Cham. 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. J Vis Exp. (195), e65287(2023).
- AVMA guidelines for the euthanasia of animals. 37, 2020 edition, AVMA Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cell line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Mason, M., Wang, M., Narins, P. Structure and function of the middle ear apparatus of the aquatic frog, Xenopus laevis. Proc Inst Acoust. 31, 13-21 (2009).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Adamson, R. H. Permeability of frog mesenteric capillaries after partial pronase digestion of the endothelial glycocalyx. J Physiol. 428, 1-13 (1990).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio Protoc. 6 (4), e1733(2016).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetology: An Introductory Biology of Amphibians and Reptiles. , Academic Press. 35-81 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
