Методическая статья

Воспроизводимое производство SPOT в качестве высокопроизводительной платформы для культивирования на основе скаффолдов

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол документирует изготовление и сборку SPOT, высокопроизводительной платформы на основе скаффолдов, в форматах 96 и 384 лунок. В нем также подробно описан процесс посева для SPOT, как вручную, так и с использованием имеющегося в продаже обработчика жидкостей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды, полученные от пациента (PDO), все чаще используются в области исследований рака для моделирования опухолей. Они сочетают в себе преимущества моделей in vivo и традиционных моделей in vitro , повторяя сложность и гетерогенность тканей, но при этом по-прежнему состоят из клеток человека. Появление физиологически репрезентативных моделей PDO вызвало потребность в устройствах, которые позволяют проводить прямой анализ поведения органоидов. В этом протоколе объясняется, как собрать и использовать поддерживаемую Scaffold платформу для органоидных тканей (SPOT), высокопроизводительное трехмерное (3D) устройство для культивирования органоидов. Эта платформа устраняет мениск, обычно образованный затравленными гидрогелями, чтобы обеспечить точную и быструю визуализацию, аналогичную процессу визуализации для двумерных (2D) культур. В результате, органоиды и сокультуры, посеянные в SPOT, могут быть легко визуализированы с помощью высокопроизводительной микроскопии. Разработанный для использования в готовом виде, SPOT доступен для исследователей с базовым опытом культивирования тканей и совместим как с ручными, так и с автоматизированными рабочими процессами посева. В этом протоколе подробно описывается изготовление SPOT в форматах 96 и 384 лунок, включая пошаговые инструкции по сборке, посеву, контролю качества и устранению неполадок. В то время как изготовление занимает 3-4 часа, не считая времени простоя, несколько пластин могут быть изготовлены одновременно, что улучшает масштабируемость. Оптимизируя культуру и анализ PDO, SPOT предоставляет надежный инструмент для высокопроизводительного скрининга лекарств и трансляционных исследований рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на достижения в биомедицинских исследованиях, разработка физиологически значимых тестов in vitro остается сложной задачей. Идеальный анализ должен учитывать широкий спектр типов клеток, рецептур лечения, временных рамок, коммерческих приборов и аналитических показаний, чтобы удовлетворить потребности исследователей в различных дисциплинах. Тем не менее, из-за отсутствия подходящих инструментов, исследователи часто полагаются на упрощенные модели, такие как двумерные монослои иммортализованных клеточных линий, которые не в состоянии перечислить сложность и клиническую значимость, особеннов исследованиях рака. Чтобы решить эту проблему, крупномасштабное биобанковское управление опухолями и сотрудничество клиницистов привели к разработке высокоточных моделей in vitro, таких как органоиды опухолей (PDO), полученные от пациента, которые сохраняют более специфичные для пациента генетические и терапевтические профили по сравнению с клеточными линиями 3,4,5. Между тем, достижения в области автоматизации лабораторий и разработки лекарств требуют платформ, которые легко интегрируются в рабочие процессы с высокой пропускной способностью. В то время как существующие платформы решают проблемы биологической точности или масштабируемости, лишь немногие из них смогли решить обе проблемы одновременно 6,7,8. Разработка автоматизированных моделей с высокой пропускной способностью, которые воспроизводят ключевые особенности заболевания, имеет решающее значение для продвижения биомедицинских исследований и ускорения генерации данных для трансляционных приложений.

Многочисленные новые модели направлены на решение проблем, связанных с культивированием специализированных типов клеток, таких как PDO, с высокой пропускной способностью (рис. 1). Стандартные платформы, на которых органоиды смешиваются с гидрогелем в 96- или 384-луночных планшетах, имеют ряд ограничений: (i) большой объем клеточного геля приводит к непостоянному доступу питательных веществ, (ii) кривизна мениска хорошо создает артефакты визуализации и клеточные градиенты, (iii) затравливанию гидрогеля не хватает однородности между партиями и персоналом, (iv) несовместимость с автоматизированным производством и автоматизированной микроскопией, и (v) использование внеклеточного матрикса (ВКМ), который обычно является мягким и хрупким образцом риска разрушение при физиологической плотности тканей или включение сократительных типов клеток 1,9. В настоящее время большинство исследований PDO на основе планшетов проводятся либо путем ручного засеивания клеточного геля в планшет10,11, либо методом наложения геля, при котором гидрогель разбавляют менее вязкой средой, а клетки центрифугируют на дно лунки для размещения их в соответствующей оптической плоскости 12,13. Оба подхода не в состоянии обеспечить механическую поддержку для долгосрочного культивирования. Основываясь на наших предыдущих наблюдениях (неопубликованных данных), коммерческий гидрогель, смешанный с клетками в стандартных луночных пластинах, сокращается от поверхности лунки в 9 из 12 лунок в течение 12 дней, в то время как метод гелеобразного наложения не имеет физиологических клеточно-матричных взаимодействий. Кроме того, полученные культуры не могут поддерживаться в течение длительного времени из-за ограниченного пространства в лунке и несовместимы с анализами, требующими высокого соотношения реагентов к клеточной среде 14,15,16. Эти практические барьеры препятствуют внедрению 3D-моделей и ограничивают экспериментальную воспроизводимость в этой области.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Оценка моделей культур на основе масштабируемости и биологической релевантности. Относительное расположение различных культуральных систем in vitro и in vivo по масштабируемости (ось y), определяемой пропускной способностью планшета, и биологической релевантностью (ось x), подчеркивающее компромисс между потенциалом пропускной способности и физиологической точностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В связи с этими проблемами высокая пористость и механическое армирование тонкого целлюлозного каркаса были использованы для разработки платформы для тканей на основе органоидов (SPOT) с поддержкой скаффолда, доступной в 96- и 384-луночных форматах. SPOT включает в себя полимерный каркас с предварительно структурированным рисунком с использованием ранее разработанного методаинфильтрации 17, который соответствует расположению пластин, обеспечивая точное размещение капли ячеечного геля и обеспечивая структурную поддержку гидрогелевой фазы (рисунок 2A). Капиллярное впитывание в каркас направляет раствор клеточного геля, образуя механически усиленную биокомпозитную сеть (рис. 2B). Благодаря пористой структуре каркаса клеточный гель инфильтрируется и образует тонкий слой (толщиной около 70 мкм), требующий в десять раз меньшего количества клеточного геля для покрытия дна лунки14. Совместимость SPOT с посевом PDO протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) также была продемонстрирована путем оценки их роста с помощью метаболических анализов и измерений на основе изображений. С момента своего развития SPOT продемонстрировал значительную универсальность и удобство использования для исследователей, занимающихся выращиванием органоидов. Кроме того, конструкция SPOT обеспечивает удобную масштабируемость с уменьшением объемов реагентов и улучшенными возможностями визуализации благодаря плоской геометрии микрогеля без мениска, обеспечивающей равномерное проникновение света и точную визуализацию с высоким содержанием14 (рис. 2C, D). SPOT также поддерживает совместное культивирование с другими соответствующими типами клеток, такими как фибробласты, для лучшего повторения микроокружения опухоли18.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Обзор устройства 96-SPOT и рабочего процесса анализа изображений. (A) Схематическое изображение изготовления пластины SPOT: устройство собирается путем сопоставления коммерческой бездонной луночной пластины (вверху), каркаса с рисунком из ПММА (показано синим цветом) и поликарбонатной пленки (внизу) с использованием слоев двустороннего полиакрилового клея (показано желтым цветом). (B) Посев клеток в скважину каркаса: клетки суспензируются в неполимеризованном гидрогеле (показано розовым цветом) и пипетируются в каждую лунку, где он проникает в каркас. Затем гидрогелю дают образовать гель для инкапсуляции клеток внутри гидрогеля, поддерживаемого каркасом. (C) Микроскопия: полученная микроткань может быть визуализирована с помощью автоматизированной широкопольной микроскопии. (D) Анализ на основе изображений: полученные изображения флуоресцентных клеток (зеленого цвета), взвешенных в геле, могут быть проанализированы с использованием стандартных конвейеров анализа изображений. Репрезентативное эпифлуоресцентное микроскопическое изображение GFP-экспрессирующих клеток KP4 в одной лунке 96-SPOT. Масштабная линейка 500 мкм. Эта цифра была изменена с14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Еще одним преимуществом SPOT является то, что система может быть интегрирована с манипулятором жидкостей с открытым исходным кодом, что облегчает автоматизированное воспроизводимое производство культур PDO. Это усовершенствование снижает вариативность пользователей и поддерживает сложные экспериментальные разработки, включая высокопроизводительный скрининг лекарств и подходы к персонализированной медицине18. Ранее также было показано, что SPOT совместим с мультиплексной характеристикой клеточных фенотипов в гетерогенных опухолевых средах на основе одноклеточных клеток и извлечением клеток по требованию из SPOT путем переваривания18. Эти особенности позиционируют SPOT как универсальный инструмент для скрининговых приложений, где продольные данные с высоким разрешением необходимы для оценки эффективности препарата и клеточного поведения в физиологически значимых условиях14,18. Объединяя эти технические инновации, SPOT устраняет критические ограничения в традиционных системах 3D-культуры.

Этот протокол содержит исчерпывающее руководство по изготовлению компонентов SPOT, сборке пластин и методам засева для надежных и воспроизводимых 3D-органоидных культур. Он включает в себя подробные инструкции по ручному засеву в планшеты с помощью микропипетки и автоматизированным рабочим процессам высева с помощью обработчика жидкостей, который поддерживает форматы 96 и 384 лунок. Кроме того, в этом протоколе изложены основные меры контроля качества, такие как проверка равномерного распределения геля и целостности каркаса, для поддержания высоких экспериментальных стандартов. Стратегии устранения неполадок также предоставляются для решения распространенных проблем, таких как неполная инфильтрация геля, испарение во время посева и отслоение каркаса, что дает исследователям практические решения для оптимизации рабочих процессов и достижения надежных результатов.

SPOT предназначен для заполнения пробелов, с которыми сталкиваются традиционные анализы органоидов, включая проблемы, связанные с проведением анализов и изменением среды при сохранении целостности геля 10,11,12,13. Общая цель этого метода заключается в изготовлении платформы, поддерживаемой каркасом, которая поддерживает органоидную культуру в течение 12-дневного периода. Кроме того, этот метод также охватывает создание тканевых матриц в SPOT с помощью ручного посева или посева с помощью обработчика жидкости, что позволяет пользователям выполнять любые последующие возмущения, включая анализы IC50 лекарств и скрининг малых молекул.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе в качестве примера использовались органоиды протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC). Эти органоиды были получены от пациентов с PDAC, приобретены в биобанке UHN в Онкологическом центре принцессы Маргарет (идентификатор PMLB PPTO.46 от University Health Network, Канада) в соответствии с протоколом в соответствии с руководящими принципами Совета по этике исследований Университета Торонто (протокол #36107). Пожалуйста, ознакомьтесь со всеми необходимыми материалами, реактивами и оборудованием в Таблице материалов.

1. Приготовление раствора ПММА-ацетона (Время: 20 мин + ~8-16 ч холостого хода)

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор полиметилметакрилата (ПММА)-ацетона используется в SPOT для оконтуривания скважин и предотвращения межскважинных утечек. Общая процедура заключается в растворении твердого ПММА в ацетоне. Ранее раствор ПММА-ацетона использовался для моделирования аналогичного бумажного каркаса для блокирования среды и газообмена для достижения гипоксии в другой 3D-модели культуры17. В этом случае формула ПММА-ацетона адаптирована для создания инфильтрированных ПММА каркасов для производства SPOT.

  1. В коническую пробирку центрифуги объемом 50 мл с маркировкой добавьте 1,75 г порошка ПММА. Затем в вытяжной шкаф добавьте 7,84 мл ацетона и плотно закройте пробирку, чтобы избежать испарения растворителя.
  2. Если нужна визуализация полимерного рисунка, добавьте в раствор 5-10 капель лака для ногтей. Плотно закройте пробирку центрифуги. Вручную встряхните тюбик, чтобы начать смешивать полироль с раствором ПММА-ацетона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить согласованность при нескольких партиях графика, разведите известное количество лака для ногтей в ацетоне, а затем дозируйте этот раствор в виде 7,84 мл ацетона.
  3. Поместите раствор ПММА-ацетона на вихревой смеситель на ночь, чтобы убедиться, что раствор растворился. Храните раствор ПММА-ацетона при температуре 4 °C не более 2 недель, если его не открывать.

2. Изготовление каркасов, инфильтрированных ПММА

(Время: для шаблона 96-SPOT: 15 минут на настройку + 6 мин на скаффолд; для паттернинга 384-SPOT: 15 мин на настройку + 10 мин на скаффолд)

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление инфильтрированных из ПММА скаффолдов для 96-/384-SPOT выполняется исключительно на верстаке (в нестерильной среде). Для изготовления скаффолдов 96/384-SPOT убедитесь, что установлено соответствующее программное обеспечение для редактирования графики или библиотека управления векторным плоттером . Обратите внимание, что некоторые подразделы процедуры относятся как к 96-SPOT, так и к 384-SPOT, в то время как другие относятся к одному размеру пластины. В последнем случае будут представлены варианты А (для 96-SPOT) и В (для 384-SPOT). Для шаблона (A) 96-SPOT есть три слоя; во-первых, линии грунтовки обеспечивают постоянный поток раствора ПММА-ацетона; во-вторых, массив из 96 кругов; Наконец, модель коммивояжера (TSP) наносит на карту межскважинные пространства. Для шаблона (B) 384-SPOT первый модуль содержит линии грунтовки; во-вторых, граница, окружающая пластину колодца; Наконец, строится сетка таким образом, что остается 384 региона. Для обоих шаблонов размеры скважин можно контролировать, изменяя исходный код, как показано в Li et al.14.

  1. Подготовка к процессу инфильтрации скаффолда
    1. Дайте раствору ПММА-ацетона (хранящемуся при температуре 4 °C) встряхнуть в течение 10 минут при комнатной температуре. Оставьте держатель пробирки до начала построения графика.
    2. Подключите плоттер к источнику питания с помощью кабеля питания. Зеленый мигающий индикатор указывает на то, что устройство включено. Подключите USB-кабель плоттера к компьютеру, предназначенному для построения графика.
    3. Накройте скрепку мольберта листом пергаментной бумаги. Убедитесь, что вся поверхность мольберта закрыта.
      1. Чтобы руководить построением шаблонов 96-/384-SPOT, подготовьте шаблон 96-/384-SPOT на листе бумаги для принтера. Выполните шаги 2.2-2.3 с помощью ручки вместо шприца, а вместо пергаментной бумаги используйте бумагу для принтера и чайный фильтр. Как только шаблон будет готов, поместите его на мольберт Clip и накройте пергаментной бумагой. Перейдите к шагу 2.2 и следуйте протоколу для создания скаффолдов 96-/384-SPOT.
    4. Прижмите пергаментную бумагу к мольберту с помощью скрепк для скоросшивателя (рисунок 3А). Возьмите лист каркаса (т.е. фильтровальную бумагу для чая) и разрежьте по сторонам, где два слоя сплавлены друг с другом (рисунок 3B).
    5. Поместите разрезанный чайный фильтр - далее называемый бумажным каркасом - на зажимной мольберт гладкой стороной (внешней стороной чайного фильтра) вверх. Зажмите его с трех сторон. Убедитесь, что бумажный каркас полностью разровнен на скрепке-мольберте; На участке участка не должно быть складок.
  2. Построение паттерна 96/384-SPOT
    1. Чтобы настроить программное обеспечение плоттера и файл для 96-SPOT, следуйте опции 2.2.2; чтобы настроить программное обеспечение и файл для 384-SPOT, выберите вариант 2.2.3.
    2. Настройка программного обеспечения плоттера и файла плоттинга 96-SPOT
      1. В программном приложении откройте файл SVG для 96-SPOT (Дополнительный файл 1; Рисунок 4А). В строке меню перейдите к разделу Расширения > Управление плоттером (рис. 4B).
      2. Когда появится новое окно, отрегулируйте настройки в соответствии с дополнительным рисунком 1. Вернитесь на вкладку "Печать" окна "Модуль управления плоттером". Оставьте эту возможность на потом.
    3. Настройка API библиотеки управления векторным плоттером и файла графика 384-SPOT
      1. Откройте окно командной строки (Windows) или «Терминал» (Mac). Введите команду для запуска назначенной интерактивной записной книжки для вычислений. Убедитесь, что записная книжка открывается в браузере.
      2. Выберите файл с кодом 384-SPOT (Дополнительный файл 2) для открытия. С помощью наконечника 20G (или наконечника 16G для шаблона 384-SPOT) аспирируйте 1 мл раствора PMMA-ацетона с помощью шприца для плоттинга объемом 3 мл (рис. 3C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клапан регулирования потока между загрузочным шприцем объемом 10 мл и трубкой EVA должен быть открыт (параллельно бочке). Поскольку процесс инфильтрации осуществляется под действием силы тяжести, убедитесь, что шприц для прокладки 3 мл всегда заполнен между маркировкой 0,5–1,5 мл, чтобы поддерживать постоянный объем дозирования во время нанесения.
    4. Пока наконечник шприца для плоттинга объемом 3 мл все еще находится внутри раствора ПММА-ацетона, закройте клапан регулирования потока между загрузочным шприцем объемом 10 мл и трубкой EVA (поднесите его перпендикулярно бочке).
    5. Быстро закройте пробирку с раствором ПММА-ацетона. Загрузите шприц объемом 3 мл в держатель шприц-ручки. Отрегулируйте высоту шприца по отношению к держателю, чтобы добиться следующего выравнивания (рисунок 3D).
    6. Отрегулируйте положение мольберта с зажимом так, чтобы кончик шприца объемом 3 мл находился в начале построенного шаблона (т. е. темной точки в верхнем левом углу шаблонного шаблона). Поднимите держатель для плоттерной ручки с прикрепленным к нему шприцем, чтобы сдвинуть под него мольберт с зажимом.
    7. Быстро отсоедините шприц объемом 10 мл от трубки, чтобы атмосферное давление оказало давление на раствор ацетона из ПММА, хранящийся в шприце для плоттинга объемом 3 мл. Откройте клапан регулировки расхода.
    8. Чтобы начать построение паттерна 96-SPOT, выполните шаги 2.2.9; Чтобы начать построение графика 384-SPOT, выполните шаг 2.2.10.
    9. Начните построение графика 96-SPOT на указанном плоттере, как описано ниже.
      1. В программном обеспечении нажмите «Применить » на плоттере Control Extensions. Теперь плоттер начнет работать, строя график шаблона из ПММА. Никаких дальнейших действий не требуется до тех пор, пока печать не будет завершена и держатель пера плоттера не вернется в исходное положение.
      2. Чтобы приостановить работу плоттера во время построения графика, нажмите маленькую серебряную кнопку на левой стороне плоттера. Затем на вкладке «Расширения управления плоттером» > «Возобновление » в графическом программном обеспечении выберите возобновление печати с того места, где она была остановлена, или возврат держателя пера в исходное положение (дополнительный рисунок 1C(iii)).
    10. Инициируйте построение графика 384-SPOT в назначенном вычислительном интерфейсе, как описано ниже.
      1. В интерфейсе нажмите «Перезагрузить ядро» и запустите повторно (двойная стрелка на панели инструментов). Теперь код начнет выполняться, отображая шаблон из ПММА. Никаких дальнейших действий не требуется до тех пор, пока узор не будет построен и держатель пера не вернется в исходное положение.
      2. Чтобы приостановить работу плоттера во время построения графика, нажмите маленькую серебряную кнопку на левой стороне плоттера. Вручную переместите печатающую головку до упора назад и влево, чтобы она достигла исходного положения. Снова подключите плоттер к источнику питания. В отличие от построения графика 96-SPOT, нет возможности возобновить построение графика для 384-SPOT с того места, где она была приостановлена; Замените бумажный каркас и начните код с самого начала.
  3. Разгрузка шприца и уборка
    1. После завершения построения графика снова прикрепите шприц объемом 10 мл к трубке. Извлеките шприц объемом 3 мл из держателя плоттерной ручки и перелейте оставшийся раствор ацетона ПММА обратно во флакон со складом или выбросьте, если на предыдущих этапах произошло значительное испарение.
    2. Вымойте цилиндр шприца объемом 3 мл путем пипетирования в ацетоне. Дайте системе шприц-трубок высохнуть на воздухе, прежде чем вернуть ее в место хранения.
    3. Осторожно разжмите скаффолд SPOT от мольберта Clip.
    4. Осмотрите построенные на графике скаффолды SPOT, чтобы убедиться, что их можно использовать для экспериментов (рис. 3E, F). Рекомендации см. в таблице 1 по поиску и устранению неисправностей и в таблицах 2 и 3 по обеспечению качества и контролю.
    5. Храните все леса с рисунком ПММА в пакете с застежкой-молнией в прохладном, сухом месте.

3. 96/384-луночная резка ленты

(Время: для шаблона 96-SPOT: 15 минут на 5 кусков ленты; для шаблона 384-SPOT: 30 минут на 5 кусков ленты)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это один из самых эффективных способов точной и эффективной резки лент, особенно для 384-луночных лент. Этот метод также предлагает возможность лазерной гравировки одного слоя ленты (пластика верхней крышки) для повышения удобства использования в процессе сборки. В качестве альтернативы, ленты также можно резать с помощью резаков для бумаги с более медленным темпом без процесса гравировки.

  1. Откройте файл лазерной резки с 96-/384-луночной лентой (Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4) и загрузите печатный шаблон с тремя разными цветами в программное обеспечение для лазерной резки, нажав кнопку «График» со следующими настройками на дополнительном рисунке 2A.
  2. Наденьте кусок ленты на поверхность лазерного резака и убедитесь, что лента гладко расплющена на поверхности. Используйте бумажные ленты или тяжелые грузы для удержания лент во время резки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лента ровно прилегает к поверхности лазерного резака. Любой удар может повлиять на качество разрезанных лент, особенно 384-луночных.
  3. Отрегулируйте расположение шаблона для печати в соответствии с положением ленты в соответствии с инструкцией по лазерному резаку.
  4. Отрежьте обе 96-/384-луночные ленты, используя одну и ту же настройку лазерного резака, как показано на дополнительном рисунке 2B. Порядок линий с определенными цветами важен. Сначала разрежьте красную линию перед зеленой. В конце вырежьте синий.
    Красная линия: режим Rast/Vest с мощностью лазера 45%, скоростью 80%, 1000 PPI и осью Z 0,50 мм.
    Зеленая линия: режим Rast/Vest с мощностью лазера 7%, скоростью 100%, 1000 PPI и осью Z 0,50 мм.
    Синяя линия: режим Rast/Vest с 50% мощности лазера, 80% скорости, 1000 PPI и осью Z 0,50 мм.
  5. Правильно храните ленты с рисунком до сборки SPOT.

4. Сборка 96/384-SPOT (Время: 1 час)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описана процедура сборки устройств 96-/384-SPOT в стерильной среде, такой как шкаф биобезопасности (BSC). В качестве альтернативы устройства 96-/384-SPOT могут быть предварительно собраны в нестерильной среде, а затем стерилизованы с помощью процесса стерилизации этиленом.

  1. Подготовка лесов SPOT к сборке
    1. Возьмите леса с рисунком из ПММА для 96- или 384-SPOT. Обрежьте лишнюю бумагу вокруг синей области подмостков. Оставьте 5 мм белого пространства по периметру синей области. Полученный лист будет примерно 760 мм х 1300 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обрезайте линию грунтовки. Это полезно для определения того, какая сторона леса является шероховатой/гладкой (Рисунок 3E, F).
    2. Чтобы подготовить строительные леса 96-SPOT к сборке, выполните шаг 4.1.3. Чтобы подготовить каркас 384-SPOT, выполните шаг 4.1.4.
    3. Выполнить перфорацию межскважинных пространств на строительных лесах 96-SPOT.
      1. Уложите кусок полиэтиленовой пленки (1000 мм х 1500 мм) на жесткую акриловую опору (2700 мм х 2700 мм). Поместите опору, покрытую полиэтиленовой пленкой, на рабочую поверхность и положите подмостки поверх полиэтиленовой пленки (рисунок 5A).
      2. Выровняйте край линейки между первыми двумя рядами таким образом, чтобы трассировка вдоль этого края не переходила в углубление.
      3. Приложите копировочное колесо к линейке в нижней части подмостков. Покатите следящее колесо вверх к вершине строительных лесов, используя линейку, чтобы направлять траекторию лезвия. Повторите это для всех междурядий на лесах (т. е. 7x).
      4. Повторите шаги 4.1.3.2 и 4.1.3.3 для каждого второго пространства между столбцами, начиная с пространства между первыми двумя столбцами.
    4. Не выполняйте перфорацию межскважинных пространств на строительных лесах 384-SPOT, следуя приведенным ниже инструкциям.
      1. Не перфорируйте межскважинные пространства подмостков 384-SPOT. Перейдите непосредственно к шагу 4.2.
  2. Стерилизация материалов SPOT и монтажное оборудование
    1. Поместите напечатанный скаффолд, две 96-луночные ленты (или 384-луночные ленты), 96-луночную бездонную пластину (или 384-луночную бездонную пластину), 96-луночную крышку пластины (или 384-луночную пластину), поликарбонатную пленку, плиту полидиметилсилоксана (PDMS), закрывающийся пластиковый пакет, пинцет и прецизионный нож в БСК, ультрафиолетовое излучение на 20 минут с одной стороны (Рисунок 5B).
    2. Переверните все материалы и сборочное оборудование на другую сторону и проведите ультрафиолетовое излучение еще на 20 минут.
  3. Крепление каркаса к первой 96/384-луночной ленте
    1. Положите строительные леса шероховатой стороной вверх (Рисунок 3F) на плиту PDMS таким образом, чтобы ряды шли горизонтально. Используйте линию грунтовки, чтобы определить, какая сторона является шероховатой (выровненная по правому краю линия грунтовки указывает на шероховатую сторону вверх).
    2. Разгладьте строительные леса на плите PDMS таким образом, чтобы на подмостке (или под ней) не было складок или пузырей. Снимите защитный слой с негравированной стороны двустороннего скотча. Слегка застегните середину ленты и совместите два средних столбика ленты с лесами.
    3. После выравнивания нажмите на середину ленты вниз. Прикрепите ленту к лесам, начиная с середины и двигаясь наружу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильно выровненный каркас будет иметь очевидный рисунок из ПММА, перекрывающийся в области посева скважины.
    4. С помощью пинцета осторожно снимите строительные леса с плиты PDMS и сохраните плиту для будущих изготовлений.
  4. Крепление лесов ко второй 96/384-луночной ленте
    1. Установите строительные леса на верстак. Переверните леса так, чтобы гладкая сторона (непроклеенная сторона) была обращена вверх.
    2. Снимите средний защитный слой с гравированной стороны второй ленты. Убедитесь, что две средние колонны ленты открыты. Если используется конструкция с негравированной лентой, полностью снимите защитный слой с одной стороны.
    3. Слегка застегните середину ленты и совместите два средних столбика ленты с лесами.
    4. Как только лента будет выровнена по каркасу, прижмите середину ленты вниз. Если используется конструкция ленты с гравировкой, удалите два других защитных слоя, прилегающих к открытому среднему участку ленты. Разгладьте ленту на лесах, начиная с середины и двигаясь наружу.
  5. Крепление лесов к бездонной плите
    1. Снимите защитный слой ленты с шероховатой стороны строительных лесов. При использовании дизайна с гравировкой из ленты удалите только средний защитный слой.
    2. Совместите строительные леса с нижней стороной бездонной пластины (с крышкой). После выравнивания прижмите середину каркаса к нижней стороне пластины. При использовании гравированного рисунка удалите защитные слои, прилегающие к открытой середине. Разгладьте строительные леса на плите от середины к краям.
  6. Крепление подмостков к поликарбонатной пленке
    1. С помощью пинцета осторожно ослабьте защитный слой поликарбонатной пленки. После ослабления медленно снимите защитный слой с пленки. Не создавайте углублений в пленке, так как это повлияет на ее оптические свойства при микроскопической визуализации.
    2. Повторите шаг 4.6.1 с другой стороной поликарбонатной пленки. Как только оба защитных слоя будут удалены, отложите пленку в сторону на верстаке.
    3. Снимите защитный слой с ленты, прикрепленной к нижней части пластины. Прижмите поликарбонатную пленку к каркасу, начиная с середины наружу.
    4. Плотно прижмите поликарбонатную пленку к дну пластины так, чтобы все лунки получили хорошо выраженную границу.
    5. С помощью высокоточного ножа аккуратно срезайте лишний материал со дна пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно внимательны, чтобы не врезаться в пластину или любую из лунок. Если нож не так легко прорезать, проверьте, не режет ли он пластину.
  7. Хранение 96/384-SPOT после сборки
    1. После полной сборки 96-SPOT поместите его в прозрачный закрывающийся пластиковый пакет. Вынесите сумку за пределы BSC.
    2. Поместите жесткую акриловую опору на нижнюю сторону пластины. Прижмите акриловую опору к пластине на противоположных углах (Рисунок 5C). Держите зажатым не менее 30 минут на каждом углу перед использованием.
    3. Храните тарелку в чистом, сухом месте до использования.

5. Посев 96/384-SPOT (Время: 2 ч 45 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описана процедура засеивания устройств 96-/384-SPOT для создания однородных 3D-микротканей. Процесс посева включает в себя тщательное дозирование определенного объема клеточного геля (например, 5 мкл для 96-SPOT или 2 мкл для 384-SPOT) на предварительно собранный каркас SPOT. Для обеспечения равномерной инфильтрации и распределения геля капля клеточного геля направляется вдоль пористой структуры каркаса через капиллярное фитиль. Этот шаг может быть выполнен вручную с помощью микропипетки или автоматизирован с помощью работы с жидкостью. После посева планшеты инкубируются при температуре 37 °C для обеспечения полимеризации геля и инкапсуляции клеток.

  1. Подготовка пластины 96/384-SPOT
    1. Разжмите зажим 96-/384-SPOT и снимите акриловую опору снизу.
    2. В BSC извлеките SPOT из пластикового пакета. Включите УФ-излучение для стерилизации внутренней части тарелки и накройте крышкой на 20 минут, прежде чем закрыть крышку и перевернуть ее на дно еще на 20 минут УФ-обработки.
    3. Пипетка 70 мкл PBS в каждое межлуночное пространство планшета 96-SPOT. Не пипетируйте PBS в пластину 384-SPOT. Охладите пластину при температуре 4 °C не менее чем за 30 минут до посева.
  2. Подготовка клеток
    1. Отделите клетки от колб для культур или органоиды от гелевых куполов в соответствии с рекомендациями по обращению и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра в соответствии с инструкциями производителя. Обратите внимание на плотность клеток клеточной суспензии (т.е. количество клеток на мл) для расчета объема клеточной суспензии, необходимого для выполнения этапов 5.4.1-5.4.2, на основе желаемой плотности посева.
  3. Приготовление геля
    1. Следуя инструкциям по приготовлению гидрогеля, оптимизированным ранее 17,19,20,21, создайте гидрогель, диспенсировав 1 мл 3 мг/мл бычьего коллагена типа 1 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты и полученную смесь необходимо держать на льду в течение всего времени приготовления.
    2. Внесите 125 мкл 10-кратной концентрированной минимально незаменимой среды (MEM) в бычий коллаген. Медленно перемешивайте пипеткой вверх и вниз, пока смесь не превратится из розовой в желтую.
    3. Внесите 8 мкл 0,8 М бикарбоната натрия в смесь бычьего коллагена. Медленно пипеткой вверх и вниз перемешивайте, пока смесь не станет бледно-розовой. Используйте смешанный раствор в течение 30 минут после приготовления, чтобы обеспечить равномерное гелеобразование в нескольких экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если смесь остается желтой, титруйте раствор до pH 7, добавляя 0,8 М в 0,5 мкл аликвот до достижения бледно-розового цвета. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: После той же процедуры гель может быть приготовлен для культур, требующих более высокой концентрации коллагена. Для культивирования органоидов используйте гидрогелевую смесь, охарактеризованную Landon-Brace et al.17.
  4. Суспензия клеток в геле
    1. Дозируйте объем клеточной суспензии, необходимый для целевой плотности клеточного геля, в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 300 x g в течение 5 минут.
    2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в геле (объем варьируется в зависимости от целевой концентрации)
  5. Посев плиты 96-/384-SPOT вручную
    1. Поместите пластину 96-/384-SPOT на пакет со льдом. Чтобы засеять 96-SPOT, выполните шаги 5.5.2. Чтобы засеять 384-SPOT, выполните шаги 5.5.3.
    2. Ручной посев 96-SPOT
      1. Предварительно покройте наконечник пипетки объемом 10 мкл смесью клеток и геля. Отасуньте 5 мкл геля с помощью пипетки объемом 20 мкл и выталкивайте до первой точки до тех пор, пока на кончике не образуется капля. Прикоснитесь каплей к середине лунки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выброс геля путем нажатия на пипетку до второго упора может привести к образованию пузырьков воздуха. Все лунки должны быть засеяны в течение 5 минут для равномерного гелеобразования между лунками.
      2. После посева всех желаемых лунок накрыть пластину крышкой и выдерживать при температуре 37 °C в течение 45 мин согласно инструкции производителя по полимеризации геля. Дозируйте 200 мкл среды в каждую посевную лунку и инкубируйте не менее 1 часа без перерыва перед любой необходимой визуализацией или возмущением.
    3. Ручной посев 384-SPOT
      1. Предварительно покройте наконечник пипетки объемом 10 мкл смесью клеток и геля. Отасуньте 2 мкл геля с помощью пипетки объемом 10 мкл и выведите до первой точки до тех пор, пока на кончике не образуется капля.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать многоканальный пипетку объемом 10 мкл.
      2. Прикоснитесь каплей к середине лунки. После посева всех желаемых лунок накрыть пластину крышкой и выдерживать при температуре 37 °C в течение 45 мин согласно инструкции производителя по полимеризации геля.
      3. Дозируйте 60 мкл среды в каждую посевную лунку и инкубируйте не менее 1 часа без перерыва перед любой необходимой визуализацией или возмущением.
    4. Посев семян 96/384-SPOT с использованием жидкостного погрузчика
      1. Во время приготовления клеточно-гелевой смеси включите обработчик жидкости и его фильтрующий модуль HEPA на максимум. Осторожно распылите 70% этанол внутри обработчика жидкости и протрите его бумажными полотенцами, пропитанными этанолом.
      2. Перед калибровкой пипеточной головки загрузите протокол посева 96-SPOT или 384-SPOT (Дополнительный файл 5 или Дополнительный файл 6). Установите температурные модули в гнезда 1 и 4 (рис. 6A).
      3. Для калибровки используйте специальные коробки с фильтрующими наконечниками P20 и P200. Загрузите их в слоты 5 и 6 соответственно (рисунок 6B). Откалибруйте головку дозатора в соответствии с инструкциями, отображаемыми в программном обеспечении. После калибровки переключитесь на стерильную коробку с фильтрующими наконечниками P20 и P200 для посева на слоты 5 и 6. Повторно посыпьте поверхность 70% этанолом и закройте дверцу до посева.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно точно откалибровать наконечники по верхней части пластины 96-/384-SPOT. Рекомендуется использовать уплотнительную ленту для пластины, чтобы визуализировать ось z наконечников относительно верхней части пластины. Идеальное положение — когда все кончики многоканальной головки соприкасаются с уплотнительной лентой пластины и создают крошечную вмятину.
    5. Включите оба температурных модуля и установите их на 4 °C, пока ячейки находятся на последней ступени вращения во время приготовления клеточно-гелевой смеси. После завершения шага 5.4 загрузите желаемое количество клеточно-гелевой смеси в каждую пробирку 8-полосных ПЦР-пробирок объемом 0,2 мл внутри БСК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем клеточно-гелевой смеси, который должен быть загружен в каждую пробирку, составляет: 96-SPOT: 5 μL умноженный на количество колонок, которые необходимо засеять, плюс мертвый объем; 384-SPOT: 2 умножить на 2 мкл на количество столбцов, которые необходимо засеять, а затем плюс мертвый объем. Мертвый объем рекомендуется составлять около 10 - 20 μл на пробирку, чтобы избежать образования пузырей и неполных колонок в конце.
    6. Закройте 8-полосные ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл с помощью 8-полосных плоских колпачков, прежде чем переносить клеточно-гелевую смесь из БСК на лед.
    7. Загрузите предварительно охлажденную пластину SPOT в температурный модуль в слоте 4 с помощью блока форматирования пластины с плоским дном (рис. 6B).
    8. Загрузите 8-полосные ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл с клеточно-гелевой смесью в температурный модуль в слоте 3 с блоком формата 96 лунок.
    9. Откройте плоские колпачки и крышку пластины SPOT и храните их внутри манипулятора для обработки жидкостей, но вдали от используемых слотов. Откройте крышку коробки с фильтрующими наконечниками P20 и P200.
    10. Запустите протокол. После посева всех желаемых лунок накрыть пластину крышкой и выдерживать при температуре 37 °C в течение 45 мин согласно инструкции производителя по полимеризации геля.
    11. Диспенсируйте 200 μL или 60 μL (96-/384-SPOT) среды в каждую посевную лунку и инкубируйте не менее 1 часа без перерыва перед любой необходимой визуализацией или возмущением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нанесение ПММА на бумажный каркас служит физическим барьером, препятствующим обмену содержимым между скважинами. Такая конструкция имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы соседние скважины оставались химически и биологически изолированными, предотвращая непреднамеренную диффузию сред, лекарств, секретируемых факторов илидаже клеток. Включение ПММА позволяет проводить точную компартментализацию, что делает SPOT надежной платформой для высокопроизводительного скрининга и кокультуральных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлено подробное руководство по изготовлению и использованию 96- и 384-луночных SPOT, охватывающее сборку, ручное засевывание клеток гелем с помощью обработчика жидкости. В отличие от традиционных гидрогелевых пробоковых систем, SPOT устраняет артефакты, связанные с мениском, способствуя неразрушающей визуализации органоидов in situ, как описано ранее 14,16,22. Кр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Дженнифер Лам за помощь в приобретении изображений. Рисунок 1, Рисунок 2 и Рисунок 7А были созданы с помощью BioRender.com. Эта работа была поддержана грантом Discovery Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (грант #RGPIN-2021-03488) для A.P.M.; программа Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions to A.P.M.; стипендии NSERC Canada Graduate Scholarships - докторская программа в Р.К.; премия Благотворительного фонда Питерборо имени К.М. Хантера Р.К.; стипендия CRAFT Национального исследовательского совета (NRC) для N.T.L.; NSERC CREATE TOeP to N.T.L.; премия NSERC за студенческие исследования для студентов З. К.; и премия Университета Торонто за выдающиеся достижения C.M.T.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПЦР-пробирки 0,2 мл (стрипы по 8 шт.)Сарштедт72.985.002
Центрифужная пробирка объемом 1,5 млФроггаБиоLMCT1.7B
1000-μ Наконечники для пипеток LЗатмение4-1019-260-000
Серологические пипетки объемом 10 млФроггаБио394010
Шприц объемом 10 млBD, Канада302995
10x Минимальная необходимая среда (MEM 10x)Gibco11430030
150-мм тарелкаКорнинг430599
Дозирующие наконечники 16-го калибра с замковым соединением ЛюэраМакмастер-Карр, штат Иллинойс, США6699А2
20&микро; L штативы для фильтровальных наконечниковОпентроны999-00099
200&микро; L штативы для фильтровальных наконечниковОпентроны999-00081
200-μ Наконечники для пипеток LЗатмение4-1030-260-000
Дозирующие наконечники 20-го калибра с замковым соединением ЛюэраМакмастер-Карр, штат Иллинойс, США6699А4
384-луночный колодец без забоя (черный)Грейнер82051-544
Шприц объемом 3 мл BD, Канада309657
Полипропиленовая коническая центрифужная пробирка объемом 50 млВВРCA21008-940
Полипропиленовая коническая центрифужная пробирка объемом 50 млВВРCA21008-940
96-луночный колодец без дна (черный)Грейнер82050-714
АцетонНаучный центр ФишераА18-1
Аналитические весыН/ДН/Д
Расширение AxiDraw для Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)Н/ДН/Д
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) Н/ДН/Д
AxiDraw V3 Высокопроизводительная персональная пишущая и черчовая машинаЗлые безумные ученые, СШАН/Д
Бычий коллаген (PureCol 3 мг/мл)Усовершенствованная биоматрица5005
Клеточная линия выбораН/ДН/Д
Clip Easel (входит в комплект поставки AxiDraw V3)Злые безумные ученые, СШАН/Д
Питательные среды по выборуН/ДН/Д
Грязеулавливающая защитная лента3 МИН.6851 PN36851
Двусторонняя полиакриловая клейкая лента (800 мм x 1200 мм)Исследования адгезивов, ARcare90106НБ
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco12483-020
Фильтры для чая Finum XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Гамбург, Германия420.69.00
Плоские колпачки для ПЦР-пробирок объемом 0,2 мл (стрипы по 8 шт.)Сарштедт65.989.002
Сверхпрочные пластиковые пружинные зажимыРЕПЕР1024-554
Модуль HEPA – Модель 110-130 В 60 ГцОпентроны999-00109
Пакет со льдом (замороженный, 1400 мм x 1800 мм)Н/ДН/Д
Программное обеспечение InkscapeН/ДН/Д
Лазерный резакУниверсальная лазерная системаVLS3.75
Миниатюрная трубка из этилвинилацетата (ЭВА) с наружным диаметром 0,07 дюймаМакмастер-Карр, штат Иллинойс, США1883Т3
Многоканальный электронный дозатор P20 (Gen2)Опентроны999-00005
Многоканальный электронный дозатор P300 (Gen2)Опентроны999-00006
ЛакСалли ХансенСБС-006861Опционально, для пигментации чернил из ПММА
Опентроны ОТ-2Опентроны999-00111
Пипетка P1000ГилсонFA10006M
8-канальный дозатор P200ГилсонF144072
Пипетка P200ГилсонFA10005M
Бумажные полотенцаН/ДН/Д
ПарафильмКомпания Bemis, Inc.52859-079
Пергаментная бумага   Н/ДН/Д
Пастеровские пипеткиВВР14672-380
Пенициллин-стрептомицин (P/S)Сигма-ОлдричП4333
Полиметилметакрилат (ПММА)Сигма-Олдрич182230
Поликарбонатная пленка (760 мм x 1300 мм)Макмастер-Карр85585К102
Мономер и сшиватель полидиметилсилоксана (PDMS, 1500 мм x 2700 мм)Клеи Ellsworth4019862
Прецизионный ножН/ДН/Д
Жесткая акриловая опора (размер прилегает к дну колодезной пластины)Макмастер-Карр8560К239
Жесткая картонная опораН/ДН/Д
ЛинейкаН/ДН/Д
Ножницы Н/ДН/Д
Бикарбонат натрия (0,8М в дистиллированной воде)Сигма-ОлдричС6014
Температурная дека с алюминиевыми блоками (Gen2)Опентроны999-00097
Обводящее колесо HEEPDD (Амазонка)B07YQWB284
Прозрачная лента Н/ДН/Д
Трипан синийGibco15250-061
ТрипсинGibco25200-056
ПинцетН/ДН/Д
Вихревой смеситель Н/ДН/Д

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи