Эффективная выборка генетически закодированных биосенсоров в пространстве для проектирования с помощью планирования экспериментов и автоматизации рабочего процесса

Summary

Этот протокол обеспечивает метод систематической глобальной оптимизации генетически кодируемых биосенсоров путем создания и оценки генетических библиотек с помощью автоматизации. Это сочетается с методологиями планирования экспериментов для оптимизации экспериментов и позволяет выбирать генетические компоненты для настройки биосенсоров в соответствии с конкретными результатами дизайна.

Abstract

Генетически кодированные биосенсоры являются мощными инструментами для высокопроизводительной обработки информации, позволяя преобразовывать входные сигналы окружающей среды или химические входные сигналы в различные выходы. Это обеспечивает динамическое зондирование, прямое управление и тонкую регуляцию экспрессии генов в широком спектре биотехнологических приложений, включая оптимизацию ферментов, разработку штаммов и управление микробными процессами. Чтобы сделать их пригодными для использования по назначению, характеристики биосенсора могут быть уточнены путем модификации стехиометрии компонентов контуров биосенсора (например, транспортеров, входных и выходных модулей) и/или настройки связанных межмолекулярных взаимодействий хозяин-биосенсор (например, ДНК-белок, белок-белок). Однако в данном случае огромное количество возможных перестановок биосенсоров создает сложное пространство комбинаторного проектирования, требующее тщательной оптимизации стратегий скрининга для выявления конфигураций, обеспечивающих желаемые фенотипические характеристики. Эта сложность еще больше усугубляется характеристиками биосенсора, такими как настраиваемость, которые требуют анализа титрования эффекторов в условиях моноклонального скрининга. Следовательно, необходимость исследования разнообразных последовательностей и экспериментального пространства делает методы дробной выборки особенно подходящими для этой цели. В основе этого рабочего процесса лежат алгоритмы планирования эксперимента (DoE), которые хорошо позиционируются для обеспечения эффективного структурированного отображения на основе статистики и дробной выборки этого комбинаторного экспериментального пространства.

В докладе представлен комбинированный высокопроизводительный подход к автоматизации и вычислениям для эффективного отбора проб в проектном пространстве биосенсоров на основе аллостерического транскрипционного фактора, чтобы обеспечить различные конфигурации как с цифровыми, так и с аналоговыми кривыми «доза-реакция». Протокол начинается с создания и автоматизированного выбора библиотек сайтов связывания промотора и рибосомы. Эти библиотеки и соответствующие им данные экспрессии преобразуются в структурированные безразмерные входные данные, что позволяет вычислительно отображать все пространство экспериментального дизайна. Затем выполняется дробная выборка с использованием алгоритма DoE в сочетании с анализом эффекторного титрования с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы. Этот рабочий процесс обеспечивает независимую основу для разработки и оптимизации будущих биосенсорных систем и генетических схем, предоставляя регуляторный инструментарий для сообщества синтетической биологии.

Introduction

Способность регулировать экспрессию генов является важной функцией во всех формах жизни, способствуя динамической реакции в режиме реального времени как на внутренние, так и на внешние воздействия, начиная от химических^{эффекторов и} заканчивая биофизическими стимулами. Мириады транскрипционных регуляторных систем, встречающихся в природе, обладают огромным потенциалом в расширении и ускорении метаболической инженерии и биотехнологических исследований, ставших возможными благодаря синтетической биологии. У прокариот большая часть регуляции, происходящей в клетке, контролируется однокомпонентными регуляторными механизмами, обусловленными взаимодействием аллостерических транскрипционных факторов (aTFs) с рядом низкомолекулярных^{эффекторов}. Обычно состоящие из эффектор-связывающего домена (EBD) и ДНК-связывающего домена (DBD), aTF действуют как молекулярные переключатели при связывании с конкретными низкомолекулярными эффекторами, модулируя сродство их DBD к специфическим последовательностям операторов ДНК, расположенным в промоторных областях генома, что приводит к активации или подавлению транскрипции³. Этот обманчиво простой механизм породил целый ряд разнообразных стратегий регуляции, начиная от систем репрессии/де-репрессии и заканчивая активаторами, способными обнаруживать и реагировать на ошеломляющее количество низкомолекулярных эффекторов или^{стимулов окружающей} среды. Следовательно, синтетическая биология использовала это разнообразие для создания генетически кодируемых биосенсоров, способных связывать множество входных сигналов с индивидуальными выходами, т.е. производить флуоресцентные репортерные белки и регулировать синтетические пути. При применении в биотехнологических рабочих процессах такие системы позволяют в режиме реального времени отслеживать внутриклеточные концентрации метаболитов, динамически регулировать пути и легко считывать данные, способствуя разработке более эффективных путей, штаммов и биопроцессов 5,6,7,8.

В принципе, биосенсоры характеризуются по ряду параметров, включая специфичность, рабочий диапазон, динамический диапазон, чувствительность и наклон, при этом кривая чувствительности биосенсора описывает эти параметры через выходной сигнал как функцию концентрации лиганда (рис. 1)9,10,11,12 . Уравнение Хилла может быть использовано для подгонки рабочих характеристик биосенсора, предоставляя полуэмпирические данные для каждого из описанных выше параметров, тем самым обеспечивая средства для характеристики биосенсорной системы, а также позволяя оценить усилия, необходимые для настройки системы в соответствии с результатами, управляемыми приложениями. Специфичность может быть определена как относительная разница в выходном сигнале, индуцированном одним эффектором по сравнению с массивом других молекул потенциального эффектора, и обычно модулируется на уровне EBD aTF. Рабочий диапазон определяется как диапазон концентраций лигандов, которые биосенсор способен определять, определяя диапазон концентраций, на которые биосенсор сможет реагировать. Динамический диапазон, напротив, описывает отношение наивысшего измеряемого состояния активации (ON) к состоянию инактивированного (OFF) и является важным параметром для обеспечения того, чтобы биосенсор надежно сообщал о концентрациях эффекторов выше фоновой автофлуоресценции¹⁰. Чувствительность эффекторной молекулы описывается как концентрация, необходимая для получения определенного выходного сигнала, измеряемая половинной максимальной концентрацией (EC₅₀) эффектора¹³. Наконец, наклон кривой обозначается кооперативностью (n_H) aTF для его оператора в промоторе и приводит к более цифровому или аналоговому выходному профилю отклика. Кооперативность возникает в результате белок-белковых взаимодействий между связанными лигандами aTF, образующими мультимерные комплексы, которые усиливают сродство к операторному сайту, что приводит к резкому увеличению чувствительности цепи с насыщающими концентрациями лигандов и более цифровым^{профилем} отклика.

Характеристики дозовой характеристики биосенсора могут существенно влиять на пригодность его применения и часто являются решающим фактором для любого концептуального применения. Производительность биосенсора может сильно варьироваться от системы к системе, при этом рабочий диапазон обычно варьируется от 0,1 нМ до 10 мМ¹³, тогда как динамический диапазон может составлять от 1,4 до 2000 раз¹⁵. Кроме того, несмотря на то, что количество эффекторных соединений, зарегистрированных для aTF, широко распространено (продукты метаболизма, аминокислоты, металлы, антибиотики, чувство кворума и т.д.)¹¹, он не является всеобъемлющим, что ставит перед исследователями проблемы, когда подходящий биосенсор для их эффектора еще не существует в литературе. Синтетическая биология позволила разработать биосенсоры, которые решают такие проблемы, позволяя настраивать область действия эффектора и характеристики «доза-реакция» для более тесного согласования с результатами исследований приложения, и была использована для решения обеих вышеупомянутых проблем, соответственно^16,17. Две ключевые области инженерии могут быть нацелены на синтетическую биологию: промоторную область биосенсора и саму aTF, опосредуя их эффекты на уровне транскрипции и белка. Подходы, которые сосредоточены на генетических элементах биосенсора с целью модуляции производительности на уровне промотора, включают в себя проектирование RBS, операторских сайтов и -35, -10 (гексбоксов) для настройки чувствительности, рабочего и динамического диапазонов, и находятся в центре внимания методологии, описанной в данной рукописи (рис. 1). Альтернативно, модификация селективности и чувствительности биосенсора путем анализа его эффектор-связывающего домена и мутации остатков, участвующих в координации эффектора (с использованием гомологии последовательностей и/или структурной биологии), может модулировать его ответ на родственный эффектор 18,19,20 или полностью изменить его в сторону неродственного эффектора, представляющего интерес 16,17,21. Такие усилия по настройке могут затем направить биосенсоры на конкретные приложения, которыми обычно являются метаболические контроллеры (петли обратной связи, цепи управления), инструменты первичного скрининга (обнаружение ферментов или штаммов), инструменты вторичного скрининга (скрининг вариантов ферментов, метаболическая инженерия) и биопоиск транспортеров 22,23,24. Один из таких примеров включает использование чувствительного к муконовой кислоте aTF, CatM, в сочетании с сконструированной промоторной последовательностью для улучшения динамического и рабочего диапазона. Эта система была интегрирована с сортировкой клеток, активируемых флуоресценцией, для выделения наиболее эффективных штаммов, продуцирующих муконовую кислоту, на основе флуоресценции GFP в соответствии с адаптивной лабораторной эволюцией²⁵.

В то время как успех описанных выше инженерных стратегий самоочевиден, взаимозависимость рычагов, доступных синтетическому биологу для настройки биосенсоров, может усложнить процесс проектирования и продлить период, затрачиваемый на разработку биосенсоров, что может отпугнуть некоторых исследователей от внедрения биосенсоров в свои собственные рабочие процессы. Как показано на рисунке 1, попытки настроить биосенсор на определенный результат путем модификации гексбоксов могут непреднамеренно ослабить другие параметры, и эта взаимозависимость является признанной проблемой^{в биосенсорной} инженерии. Общие подходы к настройке биосенсоров состоят из рационального проектирования и направленной эволюционной инженерии, причем первый опирается на априорное понимание структурных и механистических особенностей системы для сосредоточения экспериментов на компонентах с высокой вероятностью успеха; в то время как последний опирается на рандомизированный мутагенез и естественную эволюцию в сочетании с высокопроизводительным скринингом для отбора вариантов, демонстрирующих оптимизированные характеристики 26,27,28,29,30. Несмотря на свою эффективность, оба метода также имеют некоторые недостатки: целенаправленная инженерия, например, фокусируясь на конкретных структурных или функциональных элементах, склонна к ограниченному исследованию всего экспериментального пространства и может игнорировать аллостерические или вторичные^{эффекты}. Нецелевое создание и экранирование библиотек, хотя и идеально подходит для оптимизации проектов неуправляемым образом, не требует предварительной работы по проектированию (т.е. проектирования и генерации библиотеки), но требует смещения в сторону полезных мутаций. Без такой систематической ошибки ожидается, что гораздо больший процент мутаций может быть вредным, требуя более^{тщательного} скрининга. Таким образом, целостные подходы, учитывающие не только первичный эффект составных частей биосенсора (aTF, RBS, операторских сайтов и гексбоксов), но и то, как эти компоненты взаимодействуют друг с другом, влияя на параметры биосенсора, являются весьма привлекательными.

Методологии структурированного многомерного экспериментирования и статистического моделирования получили широкое распространение в технологических процессах для исследования многомерного экспериментального пространства с использованием минимально возможного числа экспериментов. Этот подход, сочетающий в себе экспериментирование и моделирование, называемый дизайном экспериментов (DoE), в первую очередь позволяет исследователям оптимизировать сложные многомерные процессы для достижения определенных результатов, не требуя при этом обширных априорных ^{знаний.} В то время как DoE обычно применяется для оптимизации непрерывных переменных, для которых структурированное экспериментальное исследование является более легким, он также используется для оптимизации метаболических путей на генетическом уровне 31,32,33. Это включает в себя начальный этап скрининга, на котором выбираются факторы, считающиеся наиболее важными для желаемого результата, за которым следует этап оптимизации, посредством которого выбранные факторы корректируются для получения желаемого результата, в данном случае для оптимизации конкретных параметров биосенсора с целью увеличения сферы их применения. Важно отметить, что этот метод может быть объединен с автоматизированными платформами обработки жидкостей для увеличения производительности скрининга до библиотек среднего размера 10³ - 10⁴ для глобальной оптимизации производительности биосенсоров на основе данных²³. Ниже мы опишем протокол для реализации подхода к оптимизации биосенсоров, основанного на DoE, с помощью робототехники для работы с жидкостями для оптимизации создания библиотек, скрининга и сбора данных для глобальной оптимизации чувствительности биосенсоров.

Protocol

1. Проектирование RBS/промоутерной части

1. Определение регуляторных элементов, специфичных для биосенсоров, которые могут быть систематически настроены в качестве непрерывных переменных в процессе DoE. Сгруппируйте эти регулирующие элементы в отдельные модули. Это может включать модули, регулирующие транспорт эффекторов, экспрессию транскрипционного фактора и/или экспрессию выходных генов. Убедитесь, что каждый модуль регулируется на уровне транскрипции и/или трансляции промотором или RBS (например, RBS_trans, P_reg,_{RBS out} и P_out соответственно).
2. Определите ключевые функциональные сайты в выбранных областях промотора и RBS, такие как шестнадцатеричные блоки, сайты операторов и последовательности RBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В литературе существует множество характерных промоутеров и RBS для создания библиотек из 34,35,36. Тем не менее, для нехарактеризированных промоторных последовательностей (обычно промотора P_reg) см. ниже дальнейшие шаги по поиску настраиваемых элементов генетической последовательности, если таковые отсутствуют в литературе.
   1. Найдите другие опероны, содержащие интересующие последовательности биосенсоров, с помощью BlastP-поиска aTF с нужным входным сигналом. Экстрагируйте межгенную область aTF и ее регулируемые гены для получения промоторных последовательностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение и количество промоторных последовательностей будет варьироваться в зависимости от используемого класса aTF.
3. Используйте несколько инструментов выравнивания последовательностей и другое программное обеспечение для поиска предполагаемых промоторов для сохранения мотивов, таких как гексбоксы и сайты операторов. На основе анализа промоторных последовательностей выберите нуклеотидные последовательности для рандомизации с вырожденными основаниями, например, N = что угодно, R = любой пурин, Y = любой пиримидин и т. д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Читатели направляются к исходной публикации для получения более подробной информации об анализе промоторов и рандомизации базы²³.

2. Сборка и проверка библиотеки деталей

1. Дизайн и порядок праймеров, которые будут специфично амплифицировать желаемый вектор экспрессии, чтобы обеспечить возможность вставки вариантов последовательности промотора/RBS перед флуоресцентным маркером (например, GFP). Разбавлять лиофилизированные праймеры по их поступлению до конечной концентрации 100 мкМ в стерильном деионизированном_Н2О.
   1. Собрать реакционную смесь ПЦР на льду в ПЦР-пробирках в соответствии с параметрами конкретной полимеразы. Убедитесь, что для предотвращения переноса мутаций в основу вектора экспрессии используется полимераза высокой точности. Отрегулируйте температуру отжига и время продления в соответствии с потребностями грунтовок и длиной желаемого продукта PCR.
   2. Проанализируйте продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза и очистите линеаризованный вектор с помощью ПЦР-очистки или набора для экстракции геля. Измерьте концентрацию линеаризованной векторной ДНК и храните при -20 °C.
2. Закажите разработанные библиотеки вариантов (RBS или промоторы) для встраивания в линеаризованный вектор в виде одноцепочечных вырожденных олигонуклеотидов с плазмидными плечами 30.о. на 5'- и 3'-концах для таргетной гомологичной рекомбинации в экспрессирующий вектор.
   1. По прибытии лиофилизированные олигонуклеотиды ресуспендируют до конечной концентрации 100 нг/мкл в стерильном деионизированном_Н2О.
3. Определите объемы эквимолярных величин линеаризованных векторов и библиотеки вариантов с помощью онлайн-калькуляторов. Убедитесь, что конечный объем реакции составит 20 мкл и что используется молярное отношение вставки к вектору 2:1.
   1. Разморозьте аликвоту коммерческой сборочной мастер-смеси Gibson (X2) на льду и соберите реакцию в ПЦР-пробирку в соответствии с объемами, предоставленными выбранным калькулятором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-микс Gibson также может быть изготовлен в лаборатории^37,38.
   2. Добавьте 10 мкл 2x мастер-смеси Gibson к фрагментам ДНК и инкубируйте в течение 1 ч при 50 °C в термоамплификаторе или аналогичном устройстве.
   3. Нанесите все 20 мкл продукта лигирования на 200 мкл компетентной кишечной палочки в микроцентрифужной пробирке. Инкубировать на льду в течение 30 мин с последующим тепловым шоком в течение 45 с при 42 °C.
   4. Верните клетки в лед на 2 минуты, добавьте в пробирку 800 μL супероптимального бульона со средой для подавления катаболитов (SOC) и дайте клеткам восстановиться в течение 1 часа при 37 °C в встряхивающем инкубаторе.
   5. Распределите 50 мкл трансформированных клеток на несколько 60 мм агаровых пластин Лурия-Бертани (LB) Петри с соответствующим выбором антибиотика. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 18 часов.
4. Проверьте пластины на трансформанты, рассчитайте количество колоний, которые представляют собой в 3 раза больше теоретического библиотечного разнообразия, чтобы получить достаточное представление каждого варианта. Оптимизируйте изотермическую сборку, если количество колоний мало/равно нулю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточная дискретизация требуется при рассмотрении идеальной библиотеки, созданной из высокоточных реагентов или синтеза. Обычно это в 3 раза больше, чем общий размер библиотеки. Например, 4 позиции вырождения (NNNN) = 4⁴ = 256 уникальных последовательностей. Таким образом, наскрести ~768 колоний.
   1. Соскребите необходимое количество колоний в одну стерильную колбу объемом 125 мл, содержащую 25 мл ЛБ-среды с добавлением соответствующих антибиотиков. Инкубируйте колбу при температуре 37 °C в течение 18 часов в встряхивающем инкубаторе (180 об/мин), следя за тем, чтобы по истечении этого времени культура стала заметно плотной.
   2. Используйте набор для очистки плазмиды midi-prep для очистки библиотеки вариантов от подготовленной культуры-трансформанта. Определить концентрацию ДНК плазмидной библиотеки; Для последующих этапов требуется 1-10 мкг. Убедитесь, что библиотечная ДНК элюирована с использованием стерильного деионизированного H₂O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшие шаги будут сосредоточены на клонировании и валидации библиотек вариантов в хосте экспрессии Pseudomonas putida (P. putida); Адаптация протокола к другим хозяевам может потребовать изменения времени инкубации, температуры инкубации и методов трансформации.
5. Приготовьте LB-агаровую тарелку нужного экспрессивного хозяина P. putida путем нарезки из глицеринового бульона и инкубации планшета при 30°С в течение 18 ч.
   1. Соберите одну колонию P. putida с агаровой пластины LB, внесите 10 мл среды LB и выращивайте при 30 °C в течение 18 часов, встряхивая со скоростью 180 об/мин.
   2. Подготовьте клетки к электрокомпетентности, центрифугируя выращенную культуру при 4000 x g при 18 °C в течение 2 минут. Слейте надосадочную жидкость, ресуспендируйте в 1 мл стерильного деионизированного_Н2О и перенесите ресуспендированные клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки P. putida должны выглядеть розоватыми при гранулировании.
   3. Центрифугируйте клетки в течение 1 мин при 4 x g в микроцентрифуге, слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 1 мл стерильного деионизированного H₂O. Повторите этапы центрифугирования и ресуспензии еще 4 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потеря клеток может произойти при сливе надосадочной жидкости во время умывания; Это нормально и не должно влиять на урожайность.
   4. Перенесите 100 мкл промытых клеток в кювету для электропорации 0,2 см, добавьте в кювету 1-10 мкг ДНК плазмидной библиотеки и перемешайте.
   5. Включите электропоратор, убедитесь, что напряжение установлено на 2,5 кВ для кюветы 0,2 см, вставьте кювету в камеру электропорации и проведите импульс.
   6. Добавьте 900 μл среды SOC в кювету, перемешайте и перенесите ячейки в стерильную микроцентрифужную пробирку. Дайте клеткам восстановиться в течение 2 ч при 30 °C в встряхивающем инкубаторе.
6. Распределите 50 мкл трансформированных клеток на большие квадратные чашки Петри (230 мм) из LB-агара с добавлением соответствующего антибиотика и инкубируйте при 30 °C в течение 18 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте умеренную плотность колоний на библиотечных пластинах (2-3 КОЕ/^см2). Это будет зависеть от компетентности бактерий и объема покрытия. Если значение слишком низкое, оптимизация трансформации или последовательные раунды трансформации могут быть использованы для увеличения численности колоний.
7. Выберите одну из 25-50 колоний из всех трансформантных планшетов для валидации последовательностей. Используйте праймеры, которые амплифицируют по всей вырожденной последовательности, амплифицируют область с помощью ПЦР и отправляют ее на секвенирование по Сэнгеру для оценки разнообразия последовательностей, а также поликлональности.
   Примечание: Если поликлональность становится проблематичной, распространение трансформаций на несколько партий кювет с 1 мкг ДНК может помочь уменьшить этот эффект.

3. Клональный скрининг библиотеки деталей - автоматизация

1. Настройка обработчика жидкостей
   1. Создайте 7 программ на платформе для работы с жидкостями, чтобы упростить шаги, интенсивно работающие с пипетированием.
   2. Создайте программу "MTP Liquid Transfer", убедитесь, что манипулятор жидкости настроен на пипетирование регулируемого объема из подготовленного резервуара в пустые микротитровые планшеты (MTP) в его компоновке.
   3. Создайте программу «Добавьте глицерин в MTP», убедитесь, что манипулятор запрограммирован на дозирование 100 мкл 50% глицерина в планшеты, убедитесь, что скорость дозирования и аспирации составляет 5-20 мкл/с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельная программа создана для учета более высокой вязкости 50% глицерина, которая может привести к образованию пузырьков, неполной аспирации или перекрестному загрязнению соседних скважин из-за разбрызгивания, если ее не контролировать.
   4. Создайте программу «Перекачка жидкости DWB», настройте обработчик жидкости для пипетирования в блоки глубоких скважин (DWB) с регулируемой настройкой объема и убедитесь, что обработчик жидкости пипетирует из предварительно заполненного резервуара.
   5. Создайте программу «Инокуляция из размороженного MTP», убедитесь, что обработчик жидкости запрограммирован на аспирацию 5 μL из размороженного MTP, содержащего выбранные колонии, и перенесите их в соответствующие планшеты DWB в компоновке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите особое внимание на расположение MTP и DWB в компоновке, обеспечив логический порядок событий, чтобы избежать случайной двойной инокуляции или пропущенных пластин.
   6. Создайте программу "Перенос в анализ DWB", убедитесь, что обработчик жидкости настроен на перенос 5 мкл клеток из одного положения планшета DWB в другое положение планшета DWB. Затем программа должна повторить это действие 4 раза, при этом при каждой передаче изменяется положение пластины, т.е. P1 -> P2, P1 -> P3 и т.д.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа обеспечивает бесшовное субкультивирование 96 вариантов в различные концентрации анализов.
   7. Создайте программу "Настройка анализа - ресуспендия PBS (DWB)", убедитесь, что обработчик жидкостей пипетирует каждый DWB в компоновке 500 μL PBS, программа также должна включать этап смешивания, чтобы обеспечить надлежащую ресуспендию клеточных гранул.
   8. Создайте программу "Настройка анализа - добавление клеток и PBS (MTP)", убедитесь, что эта программа включает этап переноса 200 μL ресуспендированных клеток из одной позиции планшета DWB в пустую позицию MTP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов 3.1 схемы программирования и работы с жидкостями будут различаться; Исследователи должны обратиться к руководствам по конкретным коммерческим манипуляторам для работы с жидкостями, чтобы модифицировать вышеуказанные программы в соответствии с возможностями и потребностями эксперимента.
2. Культивирование и штрихкодирование библиотеки вариантов
   1. Определите теоретический размер библиотеки и рассчитайте количество отдельных вариантов, чтобы обеспечить покрытие библиотеки > 95% (рекомендуется в 3 раза больше размера библиотеки) (см. примечание к шагу 2.5.).
   2. Рассчитайте необходимый объем ЛБ-среды с добавлением антибиотиков в соответствии с количеством колоний, подлежащих скринингу (200 мкл на колонию + 10% сверх).
   3. Откройте программное обеспечение для работы с жидкостями и нажмите « Выполнить » рядом с программой MTP Liquid Transfer (см. Дополнительный файл 1). Поместите подготовленную среду в соответствующее положение резервуара и заполните деку пустыми МТП в соответствии с планировкой. Установите программу на дозирование 200 μл среды. Нажмите OK , чтобы подтвердить запуск программы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда убедитесь, что резервуары и наконечники надлежащим образом поданы на платформу для работы с жидкостями, прежде чем подтвердить запуск программы, чтобы предотвратить сбои.
   4. Повторите программу столько раз, сколько потребуется, запечатайте заполненные МТР дышащей мембраной для поддержания стерильности.
   5. Перенесите заполненные MTP-планшеты на платформу для сбора колоний и распечатайте, а также перенесите квадратные пластины P. putida , преобразованные с помощью ДНК из библиотеки вариантов плазмид, на платформу для сбора колоний. С помощью средства выбора колоний засейте каждую из предварительно заполненных микротитровальных пластин одной колонией из библиотечных пластин трансформанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что минимальная глубина агара составляет 25 мл, чтобы не повредить колонозахватную головку.
   6. Повторно запечатайте и перенесите инокулированные планшеты в встряхивающий офлайн-инкубатор при температуре 30 °C (800 об/мин), обеспечивая контроль влажности на уровне 75% для предотвращения испарения культуры. Оставьте их расти на 16 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации культуры будут казаться заметно плотными для глаза, если это не так, перепроверьте среду и требования к антибиотикам.
   7. По истечении 16 часов роста верните выращенные пластины на платформу для работы с жидкостями и отпечатайте. Нажмите « Выполнить » рядом с протоколом «Добавить глицерин в MTP» (см. Дополнительный файл 1), убедитесь, что расположение пластин на экране совпадает с расположением док-станции для обработки жидкостей. Нажмите OK и разрешите запуск протокола.
   8. После этого снова запечатайте пластины и кратковременно перемешайте в автономном встряхивающем инкубаторе (800 об/мин) в течение 5 минут перед нанесением штрих-кодирования и хранением при -80 °C.
   9. Повторите шаги 3.2.7. и 3.2.8. до тех пор, пока во все МТР не будет добавлен глицерин, они будут смешаны, нанесены штрих-коды и будут храниться при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен для подготовки к приведенным ниже шагам по определению характеристик. Кроме того, можно запланировать блокировку плит в различных экспериментальных прогонах в соответствии с производительностью используемой платформы для работы с жидкостями или для снижения рабочей нагрузки за один присест.
3. Скрининг библиотеки вариантов
   1. Рассчитайте необходимый объем среды с добавлением антибиотиков для количества заполняемых DWB (~495 μL на лунку + 10% сверх).
   2. Нажмите кнопку «Выполнить » рядом с программой DWB Liquid Transfer (см. Дополнительный файл 1), убедитесь, что фильтрующий материал добавлен в правильный резервуар в макете программы. Убедитесь, что пустой DWB добавлен в соответствующие положения макета и что имеется достаточный запас наконечников. Установите программу на дозирование 495 μл среды. Когда все будет готово, нажмите OK , чтобы запустить программу.
   3. Заполненные DWB запечатать дышащей мембраной и перенести на временное хранение при температуре 4 °C, повторить шаг 3.3.2. до тех пор, пока необходимое количество DWB не будет заполнено носителями.
   4. Нажмите « Запустить » рядом с программой «Incoculate from Thawed MTP » (см. Дополнительный файл 1), убедитесь, что криосклады MTP и заполненные DWB переданы на платформу для обработки жидкостей в соответствии с планировкой. Убедитесь, что у вас есть достаточный запас чаевых. Нажмите OK для инициализации программы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размораживайте планшеты на льду в течение 30 минут только после того, как подготовлены предварительные программы и планшеты для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток.
   5. Когда программа будет завершена, запечатайте инокулированные на ночь DWB с дышащей мембраной, переложите в автономный инкубатор с 75% контролем влажности и дайте расти в течение ночи в течение 16 часов при 30 °C (180 об/мин).
   6. Повторно запечатайте, смешайте и верните криосток MTP в морозильную камеру при температуре -80 °C в соответствии с шагом 3.2.8.
   7. Повторите шаги 3.3.4. к 3.3.6. столько же раз требуется до тех пор, пока необходимое количество ночных DWB не будет привито и перенесено в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется записывать, когда каждая партия планшетов добавляется в инкубатор, чтобы учесть временную задержку между прогонами во время инокуляции и использовать тот же порядок для последующих этапов.
   8. Рассчитать необходимый объем среды, дополненной различными концентрациями эффектора и антибиотика, в зависимости от количества ночных DWB, подлежащих скринингу (495 мкл на лунку + 10% сверх). Для каждой концентрации эффектора требуется отдельный резервуар в манипуляторе жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для первоначальной характеристики, такой как скрининг ВКЛ/ВЫКЛ, достаточно двух концентраций эффекторов (например, 0 и 1000 мкМ конечная концентрация). Для получения данных о зависимости «доза-реакция» для более надежной характеристики этот диапазон увеличивается как минимум до четырех концентраций (например, 0, 1, 25 и 1000 мкМ конечная концентрация). Репрессорные системы не требуют добавления эффектора для определения функции, в то время как для активаторов, таких как описанная система, требуется эффектор.
   9. Нажмите « Выполнить » рядом с программой DWB Liquid Transfer (см. Дополнительный файл 1). Убедитесь, что резервуары с эффекторными добавками находятся в правильном положении в соответствии с планировкой. Добавьте пустые DWB в платформу для работы с жидкостями. Убедитесь, что платформе доступно достаточное количество чаевых. Когда все будет готово, нажмите OK , чтобы запустить протокол для генерации DWB анализа.
   10. После наполнения пробирные DWB запечатать тестируемые ДВБ воздухопроницаемой мембраной и перенести на временное хранение при температуре 4 °C, а платформу для обработки жидкости снова наполнить пустыми пластинами.
   11. Повторяйте шаги 3.3.9 и 3.3.10 столько раз, сколько необходимо, пока не будет заполнено необходимое количество DWB.
   12. Нажмите кнопку «Выполнить » рядом с программой «Перенести в анализ DWB » (см. Дополнительный файл 1). Убедитесь, что незапечатанные пробирные DWB, содержащие эффекторные среды, добавлены в правильные места на схеме обработки жидкостей.
   13. Перенесите и распечатайте ночные DWB, содержащие выращенную P. putida , инокулированную на шаге 3.3.4. на платформу для работы с жидкостями, опять же, следя за строгим соблюдением планировки. Убедитесь, что платформе доступно достаточное количество чаевых. Когда все будет готово, нажмите OK , чтобы запустить протокол.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос и размещение субкультур в пробирных пластинах, как правило, необходимо выполнять партиями в зависимости от размера платформы для обработки жидкостей.
   14. После завершения программы наложите пломбы и перенесите пробирные планшеты в офлайн-инкубатор при температуре 30 °C, при влажности 75% в течение 16 ч (180 об/мин), итоговый объем анализа на этом этапе составит 500 мкл.
   15. Выбросьте ночные DWB после инокуляции и повторяйте шаги с 3.3.12 по 3.3.14 по мере необходимости, пока все необходимые анализы DWB не будут инокулированы и не начнут выращиваться в автономных инкубаторах.
   16. Извлеките DWB из инкубатора, перенесите в центрифугу и грануляционные ячейки при температуре 4000 x g, 18°C в течение 5 минут. Слейте надосадочную жидкость и поместите центрифугированные DWB на платформу для работы с жидкостями.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы гранул клеток могут варьироваться в зависимости от концентрации эффектора или варианта, кроме того, некоторые гранулы могут казаться более заметными для глаза, чем другие.
   17. Рассчитайте требуемый объем 1x PBS в зависимости от количества DWB, подлежащих скринингу (500 μL на лунку + 10% сверх).
   18. Нажмите кнопку «Выполнить » рядом с программой «Настройка анализа - ресуспензия PBS» (DWB) (см. Дополнительный файл 1), установите объем дозирования на 500 μл, убедитесь, что в нужный резервуар добавлен 1x PBS, затем расположите центрифугируемые планшеты в соответствии с расположением манипулятора жидкости. Убедитесь, что у вас достаточно чаевых. Нажмите OK , чтобы запустить программу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка клеток проводится для удаления остатков питательной среды, которая может привести к некоторой автофлуоресценции.
   19. Запечатайте и снимите подвешенные пластины с обработчика жидкостей. Убедитесь, что гранулы полностью восстановлены, проверив нижнюю сторону пластины. Продолжайте передавать гранулированные DWB в обработчик жидкостей и повторите шаг 3.3.18. до тех пор, пока все пластины не будут подвешены.
   20. Нажмите кнопку «Выполнить » рядом с программой «Настройка анализа - Добавление клеток и PBS» (MTP) (см. Дополнительный файл 1). Перенесите повторно приостановленные DWB из шага 3.3.18. в обработчик жидкостей в соответствии с предложенной схемой. Передайте пустые MTP в манипулятор жидкостей в соответствии с схемой. Убедитесь, что объем дозатора установлен на 200 μл и что имеется достаточное количество наконечников. Нажмите OK , чтобы запустить программу.
   21. Перенесите заполненные MTP (объем конечного анализа 200 μL) в автономный многомодовый считыватель планшетов, измерьте относительную флуоресценцию при соответствующей длине волны излучения возбуждения (например, sfGFP lEx/lEm = 488/520) и наружном диаметре₆₀₀ для каждой лунки в планшете.
       Примечание: Настройка длины волны излучения возбуждения будет зависеть от выбора флуоресцентного гена, закодированного в векторе экспрессии. Убедитесь, что настройки усиления на считывателе пластин одинаковы по всей длине и позволяют различать низкие и высокие варианты без перегрузки детектора.
   22. Повторите шаги 3.3.20. и 3.3.21. до тех пор, пока все ДВП анализа не будут переданы в МТР и измерены.

4. Обработка/преобразование данных и дифференциальное ранжирование

1. Выполните нормализацию собранных данных путем деления зарегистрированной флуоресценции GFP (RFU) на зарегистрированное измерение OD₆₀₀ для каждого варианта для каждой из оцениваемых концентраций эффекторов (0 и 1000 мкМ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство считывателей пластин могут быть запрограммированы на автоматическую нормализацию флуоресценции по наружному диаметру₆₀₀ во время сбора данных.
2. Рассчитайте ВКЛ/ВЫКЛ для получения динамического диапазона для каждого варианта путем деления RFU/OD₆₀₀ при 1000 μМ (ON) на RFU/OD₆₀₀ при 0 μM (ВЫКЛ). Отобразите все значения ВКЛ/ВЫКЛ всех вариантов в виде точечной диаграммы с помощью ВКЛ/ВЫКЛ базовой конструкции биосенсора, чтобы определить варианты, проявляющие активность выше базового уровня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ВКЛ/ВЫКЛ исходной конструкции биосенсора, использованной в протоколе, было определено как 3,6-кратное на основе первоначальной характеристики последовательности^{дикого типа 23}.
3. Для более глубокого определения характеристик подгонка данных «доза-реакция» с помощью функции Хилла с переменным наклоном для извлечения значений EC50 и/или наклона Хилла с помощью аналитического программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить чувствительность и EC₅₀, соберите по крайней мере четыре точки данных, охватывающие диапазон, в котором реакция переходит от низкой к высокой активации, обычно это самая крутая часть кривой. В то время как большее количество точек данных повышает разрешение и точность, четырех точек достаточно для оценки рейтинга чувствительности.
4. Из полного набора вариантов выберите подмножество вариантов (например, N = 100), обеспечивающее сбалансированный охват желаемых ранжирований, в данном случае EC₅₀. Для этого определите варианты, которые охватывают широкий диапазон в EC₅₀, гарантируя, что варианты с высоким и низким рейтингом пропорционально представлены. Удалите избыточные варианты (например, варианты с похожим рейтингом и минимальным влиянием на охват дистрибуции).
5. После выбора окончательного варианта библиотеки образцов (например, N = 100) преобразуйте данные с помощью следующего линейно-логарифмического (лин-логарифмического) уравнения преобразования (уравнение 1).
   Уравнение 1:
   
   где
   
   
   
6. Для значений EC50 назначьте +1 для самого высокого (наименее чувствительного) и -1 для самого низкого (наиболее чувствительного). Среднее геометрическое 0 соответствует промежуточным уровням выражения.

5. Генерация окончательного дизайна скрининга / DoE

1. Для систематического исследования пространства дизайна биосенсоров используйте окончательный скрининговый дизайн (DSD). Эта конструкция предпочтительна из-за ее способности эффективно исследовать пространство проекта, адаптируя исследование к конкретным потребностям системы.
2. Нажмите на категорию DOE , а затем нажмите кнопку «Окончательный дизайн скрининга » в статистическом программном обеспечении (см. Дополнительный файл 2).
3. Определите экспериментальные факторы (например, RBS_{trans ,} P_reg , RBS_out и P_out) как непрерывные переменные, нажав кнопку Continuous и назвав их, установив значения +1 и -1 (см. Дополнительный файл 3).
4. Определите желаемые ответы (например, ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Slope), нажав кнопку « Добавить ответ» и настроив имя (см. Дополнительный файл 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установите цель ответа, нажав на выпадающее меню цели, выберите «Нет » или «Максимизировать » в зависимости от цели проекта (например, исследование или оптимизация).
5. После того, как факторы и реакции определены, нажмите « Продолжить », чтобы открыть вкладку «Варианты дизайна». Выберите «Блоки не требуются», затем нажмите кнопку «Создать дизайн » (см. Дополнительный файл 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки могут быть добавлены для изоляции конструкции от неприятных факторов (факторов, не представляющих первостепенного интереса). Это может усложнить эксперименты; Тем не менее, он используется на усмотрение исследователя.
6. Программное обеспечение сгенерирует таблицу экспериментального дизайна, в которой будут изложены конкретные комбинации факторов, подлежащих тестированию. Генетические части из соответствующих преобразованных библиотек lin-log будут использованы для генерации соответствующих 17 конструкций. Сохраните и экспортируйте таблицу проекта, нажав кнопку «Создать таблицу » (см. Дополнительный файл 6).

6. Повторите шаг 2 - Проектирование и сборка генетических дизайнов, учитывающих DoE

1. Начните конструирование многомерных плазмид в соответствии с планом Definitive Screening Design (DSD).
   1. Определите исходную переменную (например, промотор, RBS и т. д.). Проектирование и упорядочивание праймеров для линеаризации вектора выражения, обеспечение того, чтобы праймеры располагались по бокам от целевой области переменной, обеспечивая удаление любых ранее существовавших элементов последовательности.
   2. Разработайте и упорядочьте праймеры, которые будут целенаправленно амплифицировать вариантные последовательности, соответствующие предопределенным уровням библиотеки (например, -1, 0, +1) для каждого регуляторного узла (P_{out P reg RBS out RBS trans}). Убедитесь, что каждый праймер включает плечи гомологии 30.о., которые комплементарны сайту вставки вектора экспрессии.
   3. Очистите плазмидную ДНК из соответствующей криостоковой культуры, соответствующей уровням библиотеки +1, 0 и -1 для идентифицированной переменной, с помощью miniprep.
2. Настройте ПЦР-реакции для линеаризоватого вектора экспрессии и фрагментов библиотеки на льду и определите концентрацию продукта, как описано в шагах 2.1.1 и 2.1.2.
   1. Повторите шаги с 2.3 по 2.4 протокола, чтобы выполнить сборку Gibson из линеаризованного вектора экспрессии и фрагментов библиотеки. Убедитесь, что на этом этапе используются чашки Петри стандартного размера.
   2. Отсейте колонии с помощью секвенирования по Сэнгеру для подтверждения правильности сборки конструктов для каждой из предложенных конструкций DSD, а затем перейдите к трансформации P. putida (шаги 2.5 - 2.6).
   3. С помощью ПЦР подтвердить наличие правильной плазмиды в трансформированных колониях. Выберите подтвержденные трансформанты и инокулируйте их в 10 мл LB с добавлением антибиотика для ночного роста при 30 °C в течение 18 часов (180 об/мин). Создать криостоки (25% глицеринового финиша) и хранить при температуре -80 °C.

7. Скрининг и рационализация данных

1. Из криозапасов полосы P. putida , преобразованной с помощью соответствующих конструкций DSD, в агар LB с добавлением антибиотика, инкубируют при 30 °C в течение 18 часов в течение ночи для выращивания колоний.
   1. Выберите три одиночные колонии с каждой пластины, соответствующие предложенным схемам DSD, и заквашивайте их в течение ночи в 10 мл среды LB с добавлением антибиотика при 30 °C в течение 18 ч.
   2. На следующий день загрузите DWB с градиентом концентрации эффектора в диапазоне от 0 мМ до 1 мМ (конечная концентрация) на ряд до общего объема 50 мкл на лунку. Разбавьте ночные культуры на 1/100 в свежем LB и добавьте 450 мкл культуры в DWB по градиенту концентрации.
   3. Вручную повторите шаги 3.3.14 и 3.3.16 для получения выращенных DWB, затем перейдите к шагам 3.3.18, 3.3.20 и выполните их вручную. и 3.3.21. получить данные РФС/ОД для каждого предложенного варианта.
2. Подгонка данных о реакции на дозу (RFU/OD) с помощью функции Хилла (с переменным наклоном), извлечение соответствующих параметров (факторов) для оптимизации, таких как EC₅₀, наклон холма, динамический диапазон или рабочий диапазон. Преобразуйте полученные данные в log10 и введите извлеченные параметры в таблицу DSD для каждого из тестируемых проектов.
   1. Выполните двухуровневый скрининговый анализ для выявления существенных факторов, влияющих на работу биосенсора. Используйте t-коэффициент Лента и анализ графиков^{23, 30} Half-Normal, чтобы определить, какой фактор отклоняется от ожидаемого распределения и должен быть сохранен в модели. Поддерживать эффект наследственности, следя за тем, чтобы любой значимый только во взаимодействии фактор включался также в отдельности.
   2. Проведите стандартное моделирование регрессии по методу наименьших квадратов (SLSR)³⁰ для каждой переменной отклика независимо, включая только выявленные значимые факторы. Оцените диагностику регрессионной модели, включая графики невязк, тесты на несоответствие и значения R², чтобы обеспечить надлежащую подгонку данных.
   3. Используйте профилировщик отклика для определения оптимальных настроек коэффициента на основе желаемых характеристик биосенсора. Определите целевые функции для каждой реакции (например, максимизация динамического диапазона при минимизации EC₅₀) для создания настроек коэффициентов, которые достигают наилучшего баланса для всех откликов с учетом системных ограничений и компромиссов.
3. Вернитесь к библиотекам вариантов и сконструируйте оптимизированный биосенсор в соответствии с модулями, предложенными профилировщиком ответов, следуя шагам с 6.1 по 6.2 протокола. Проверка производительности оптимизированной конструкции с помощью определения характеристик «доза-реакция».

Results

Первоначально модули, которые должны влиять на функцию биосенсора, должны быть выбраны для вариативности; Это может включать регуляцию транспортных белков, которые могут влиять на внутриклеточную концентрацию лигандов и, следовательно, на выход биосенсора, а также относительные уровни транскрипции и трансляции самого aTF, а также флуоресцентного репортера или выходного гена (рис. 1). На рисунке 2 показан типичный рабочий процесс, используемый при разработке эксперимента на основе DoE для оптимизации биосенсоров; начиная с организации регуляторных элементов в отдельные модули, которыми можно манипулировать с помощью синтетической биологии посредством изменений на уровне последовательностей, в частности, в сайтах операторов, гексбоксах или RBS (рис. 2A). Таким образом, следующим шагом в рабочем процессе DoE является рандомизация сайтов последовательностей с целью создания библиотек вариантов (рисунок 2B). Степень рандомизации должна быть тщательно продумана, так как количество скрининговых колоний должно масштабироваться со степенью рандомизации 4^N, где N равно количеству рандомизированных базовых позиций. Рассмотрение каждого уникального промотора или последовательности RBS в качестве уникальной категориальной переменной в DoE увеличило бы количество требуемых конструкций до экспериментально неосуществимых уровней, поскольку такое преобразование в непрерывные переменные путем определения характеристик библиотек является необходимым шагом сортировки для измерения диапазона функций, приобретаемых в результате рандомизации, и для определения верхнего, среднего, и нижние границы функциональности. В первую очередь это достигается путем анализа выходных данных библиотек в качестве меры силы RBS или промоторного варианта через репортерный ген (рисунок 2C). Преобразование lin-log выполняется, как показано, для дискретизации непрерывных переменных на уровни, которые могут быть использованы DoE для исследования различных комбинаций и разработки модели, описывающей эффекты этих вариантов. Затем реализуется план скрининга с использованием 3 уровней, которые комбинаторным образом описывают диапазон активности для каждого фактора (рисунок 2D). Благодаря сборке и тестированию предложенных конструкций экспериментальное пространство эффективно исследуется и выявляются взаимодействия между факторами. Статистический анализ полученных данных используется для определения того, какая комбинация факторов оказывает наиболее значительное влияние на выход биосенсора, а SLSR используется для прогнозирования поведения системы при различных критериях, способствуя оптимизации биосенсора для достижения конкретных результатов, таких как увеличение динамического диапазона или чувствительности (рисунок 2D).

Рисунок 3 демонстрирует сборку и скрининг библиотеки промоторов, регулируемой aTF. Изотермическая сборка с использованием вырожденного олигонуклеотида была выполнена для создания плазмидно-кодируемой библиотеки, в которой каждая плазмида уникально рандомизируется в определенных положениях. Степень разнообразия библиотек в конечном итоге определит количество колоний, подлежащих скринингу, при этом большие теоретические размеры библиотек значительно выиграют от автоматизации. Анализ промоторной последовательности гомологичных оперонов к TphR позволил получить карту сохранения оснований, которая была использована для информирования о местах рандомизации, в частности, основаниях, которые показали некоторую степень изменчивости и, следовательно, могут модулировать активность, не будучи абсолютно необходимыми²³. Три базы в каждом из шестиугольников -35 и -10 были нацелены на полную рандомизацию в дополнение к шести базам на площадке оператора (Рисунок 3А), в результате чего теоретическая библиотека промоутеров составляет ~500 000. Впоследствии для преобразования штамма-хозяина была использована библиотека плазмид. На данном этапе хорошая эффективность преобразования имеет решающее значение для получения достаточного охвата библиотекой с помощью общих подходов к устранению неполадок, показанных в Рисунок 3B. Оптимизация концентраций ДНК, метод трансформации и дизайн клонирования могут значительно повысить выход трансформанта. Рисунок 3C демонстрирует типичный рабочий процесс: при получении трансформантов отдельные колонии, соответствующие уникальным вариантам, должны быть сначала выращены в среде, прежде чем можно будет начать какую-либо работу по определению характеристик. Чтобы покрыть теоретический размер библиотеки, необходимо будет выбрать огромное количество вариантов и расположить их в виде пластин. Использование автоматизированных систем, таких как обработчики жидкостей и сборщики колоний, может сделать этот трудоемкий шаг тривиальным. Шаг 1 Рисунок 3C иллюстрирует перекачку питательных сред в MTP, которые были вручную загружены в док-станцию для обработки жидкостей, с последующей автоматической инокуляцией с помощью сборщика колоний. Некоторые этапы, такие как запечатывание планшетов и перенос их в офлайн-инкубаторы, выполняются вручную, но при желании их также можно автоматизировать. После роста культур можно также использовать манипуляторы для обработки жидкостей для получения криоматериалов путем добавления глицерина, как показано на рисунке Рисунок 3C. На этом этапе штрихкодирование пластин гарантирует, что каждый выбранный вариант будет связан с конкретной платформой и местоположением скважины, что позволит легко ссылаться на него для дальнейшего определения характеристик на последующих этапах производства. Одним из основных преимуществ автоматизированных подходов, помимо сокращения трудозатрат, является снижение количества человеческих ошибок, при этом ошибки на этапе подготовки библиотеки с меньшей вероятностью будут перенесены в дальнейшем. Шаг 2 Рисунок 3C иллюстрирует этап автоматического определения характеристик при подготовке библиотеки. Это начинается via заполнение DWB средами с помощью платформы для обработки жидкостей с последующим посевом с помощью криоматериалов со штрих-кодом. Автоматизация на этом этапе также гарантирует, что ошибки пипетирования и трудозатраты будут сведены к минимуму. Затем планшеты запечатываются и вручную переносятся в автономные инкубаторы для роста, после чего может быть начата укладка эффекторных соединений в свежие глубоколуночные планшеты. Для целей начального скрининга библиотек деталей может быть желателен простой экран ВКЛ/ВЫКЛ, поскольку он может быть использован для предварительного отсеивания нефункциональных вариантов, которые демонстрируют такую же или худшую активность, чем базовая конструкция, и обогащения пула вариантов для тех, которые демонстрируют повышенную активность. Это дает дополнительное преимущество в виде снижения материальных затрат на наконечники и пластины, которые могут стать непомерно высокими в больших протоколах библиотечного скрининга. Однако в тех случаях, когда требуется оптимизация более сложных метрик производительности биосенсора (например, EC₅₀), потребуются дополнительные концентрации эффекторов. После роста культур планшеты возвращаются на платформу для обработки жидкостей, которая начинает инокулировать планшеты, содержащие эффекторные соединения, прежде чем снова вручную возвращать их в инкубатор на время проведения анализа. Рисунок 3D Демонстрирует последний шаг автоматизации перед сбором данных. По истечении периода роста и активации биосенсоров планшеты извлекаются из офлайн-инкубатора и возвращаются на платформу для обработки жидкостей. Для удаления остаточных питательных сред, которые могут мешать сбору флуоресцентных данных, требуется центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и промывка клеток с помощью 1x PBS. Использование манипуляторов для обработки жидкостей может опять-таки упростить этот процесс, благодаря автоматизированной ресуспендированию культур, позволяющей быстро обрабатывать планшеты, включая перенос промытых клеток в MTP формата 96 лунок для скрининга. Сбор данных может выполняться вручную или автоматически, при этом некоторые считыватели оснащены планшетными стеками, которые могут взаимодействовать с манипуляторами жидкостей для дальнейшей автоматизации процесса сбора данных. Сравнивая отношение активации биосенсора в присутствии эффектора (ON) к его отсутствию (OFF), оценивали 5000 вариантов с использованием степени активации биосенсора (кратного изменения) для определения функции биосенсора; Для дальнейшей характеризации были взяты только варианты с активностью выше базовой конструкции (в 3,6 раза), на что указывает красно-розовая заштрихованная область точечной диаграммы (Рисунок 3D). На основе расположения планшетов и лунок пула обогащенных вариантов можно затем провести надежную характеризацию с использованием биологических репликатов или различных концентраций эффекторов путем обращения к исходным криостоковым планшетам со штрих-кодом, созданным на этапе 1 рабочего процесса.

На рисунке 4 показан скрининг сортированных вариантов из первоначального скрининга библиотеки с целью разработки библиотеки промоторов для оптимизации чувствительности. Используя данные из 5000 вариантов, проверенных в предыдущем рабочем процессе, отсортированный пул из 226 вариантов с первоначального экрана ВКЛ/ВЫКЛ, которые были определены как более активные, чем родительская последовательность, был затем дополнительно охарактеризован и ранжирован в соответствии с их чувствительностью, чтобы действовать как уровни, вокруг которых может быть спроектирован DSD. В качестве первого шага категориальные переменные, в данном случае варианты P_out top, должны быть преобразованы в непрерывные переменные, охватывающие широкий диапазон чувствительности. Для скрининга чувствительности требуются кривые зависимости от дозы для получения данных EC₅₀ из построенной функции Хилла; Это значительно увеличивает объем работы по нанесению покрытий и хорошо подходит для автоматизации с использованием манипуляторов для обработки жидкостей для упрощения процесса настройки и скрининга анализов, как показано на рисунке 4A. В соответствии с технологическим процессом, описанным на этапе 2 рисунка 3C, для инокуляции DWB, заполненных питательными средами и антибиотиками, использовались штрих-коды планшетов и положения лунок, соответствующие обогащенному пулу вариантов. Для повышения экспериментальной надежности варианты были подвергнуты скринингу в биологической тройке. После переноса планшетов в офлайн-инкубатор для выращивания свежие DWB заполняли питательными средами с эффектором 0, 1, 25 и 1000 мкМ с использованием манипуляторов для снижения трудозатрат. Чтобы уменьшить количество планшетов, необходимых для анализа, был выбран диапазон концентраций, охватывающий нижнюю середину и верхнюю часть кривой, при этом средние концентрации раскрывают относительную чувствительность каждого варианта, как показано на рисунке 4А. После инокуляции пулов вариантов при каждой концентрации эффектора и анализа флуоресценции и OD₆₀₀ были построены кривые реакции на дозу, а для определения EC₅₀ использовался нелинейный регрессионный анализ. На этом этапе была сгенерирована исходная библиотека каждого варианта с уникальным значением EC₅₀ , а 100 наиболее надежных вариантов были перенесены вперед, как показано на рисунке 4B , чтобы еще больше уменьшить размер библиотеки. Однако, прежде чем эта библиотека может быть использована в DoE, необходимо преобразовать уникальные варианты в ранжированную библиотеку, представляющую диапазон чувствительности, содержащийся в ней. Это было достигнуто путем выполнения lin-log преобразования данных, которое ранжирует и масштабирует данные таким образом, чтобы каждый вариант ранжировался от наиболее чувствительного (-1) до наименее чувствительного (+1), а также определения среднего значения (0), которое представляет собой среднее геометрическое набора данных (рисунок 4C). Преобразование исходных данных привело к получению синего графика, показанного на рисунке 4D, из которого дискретные последовательности P_out , соответствующие +1, 0 и -1, были перенесены в окончательный дизайн скрининга как уровни P_{out-фактора} .

Рисунок 5 демонстрирует полный рабочий процесс после создания библиотеки от генерации DSD до моделирования и глобальной оптимизации биосенсора на основе обучения с помощью DoE. Рисунок 5А представляет собой разбивку типового биосенсора на 3 модуля с 1 (транспортный и регуляторный модули) или 2 (выходной модуль) узлами регулирования. По примеру Рисунок 4, RBS или промоторные библиотеки, и уровни в диапазоне от +1, 0 и -1 будут выбраны, чтобы охватить наибольшую вариацию каждого фактора. Размер отобранных библиотек обычно определяет количество экспериментов, необходимых для полного исследования пространства проектирования, например, если бы каждая библиотека имела размер 22, это было бы равно 22⁴ (234 256) комбинаций. DoE стремится упростить экспериментальную рабочую нагрузку за счет сокращения количества комбинаций с помощью структурированных дизайнов скрининга. Несмотря на то, что существует множество методологий, DSD идеально подходит для разработки биосенсоров, поскольку он позволяет идентифицировать основные факторы и двухфакторные взаимодействия, избегая при этом смешивающих эффектов второго порядка. Кроме того, поскольку в проектах DSD используются 3 уровня, можно оценить кривизну (нелинейность). Рисунок 5А демонстрирует типичный выход DSD, где каждый из 4 модулей настроен на разные уровни; Поскольку каждый уровень соответствует определенному промотору или варианту RBS, изотермическая сборка используется для создания генетических конструкций, соответствующих рекомендуемым конструкциям DSD. После сборки и трансформации штамма-хозяина с помощью рекомендованных конструкций затем получают кривые реакции дозы с использованием полного диапазона концентраций эффекторов, чтобы обеспечить большую уверенность в работоспособности каждой из конструкций Рисунок 5B. Поскольку DSD значительно сокращает количество конструкций, этот шаг часто можно выполнить вручную или с помощью автоматизированных обработчиков жидкостей, если это необходимо. Рисунок 5C представлен вывод профиля прогнозирования, полученный после построения и тестирования предложенных комбинаций с экрана DSD и построения прогностических моделей на основе коэффициента Хилла (n_H) и EC₅₀ вывод каждой тестируемой комбинации. Целью эксперимента была разработка биосенсорной конструкции, которая была бы глобально оптимизирована как для n_H и EC₅₀ за счет модуляции экспрессии 4 регуляторных узлов для максимизации обоих параметров. Каждый регуляторный фактор отображается в отдельном столбце со степенью выражения, указанной по оси x, соответствующей библиотеке преобразованного промотора lin-log и части RBS (от -1 до +1). Влияние изменения выражения узлов на оба EC₅₀ и n_H обозначается кривыми на подграфиках. Профильные графики подчеркивают часто неинтуитивную природу оптимизации биосенсора, в результате которой настройка одного регуляторного узла может оказывать противоположное влияние на выходные параметры. Например, RBS_через не имеет сильной корреляции с n_H,_{тем не менее, он положительно коррелирует с EC50} нелинейным образом. Также подразумеваются взаимодействия более высокого порядка (нелинейные) в случае RBS_вне Увеличение прочности приведет к увеличению наклона (выше N_H) с сопутствующим повышением чувствительности (ниже EC₅₀), в результате чего получается кривая с более цифровым наклоном и более острой реакцией на увеличение концентрации эффектора. С помощью этих моделей можно более наглядно отобразить неинтуитивные аспекты настройки биосенсоров, что позволяет оптимизировать узлы регулирования в направлении глобального оптимума. Модели были использованы для прогнозирования глобального оптимума для обоих EC₅₀ и n_H , красными линиями на графике обозначены оптимальные уровни каждого регулирующего узла (Рисунок 5C). Рисунок 5D демонстрирует профиль «доза-реакция» исходной родительской биосенсорной конструкции (синий) в сравнении с наиболее эффективной конструкцией DSD (зеленый) и глобально оптимизированной конструкцией (сиреневый). Использование модели для прогнозирования идеальных прочных характеристик модуля для максимизации EC₅₀ и n_H, авариант, соответствующий RBS_через (-1),_рег (-0.7),_вне (-0,3) и RBS_вне (+1) прочных характеристик был собран и охарактеризован с помощью оптимизированной конструкции, показывающей улучшения в EC₅₀ и n_H (Рисунок 5D). В то время как DSD и глобально оптимизированные биосенсоры демонстрируют схожие EC₅₀ (0,8 против 0,7 мкМ), н_H был значительно улучшен без ущерба для ЕС₅₀ Успехи, которые уже были достигнуты. Результаты ясно демонстрируют преимущества проектирования, основанного на данных, по сравнению с подходами, основанными на интуиции, и служат валидацией DoE как средства оптимизации и упрощения процесса настройки биосенсоров.

Рисунок 1:Настройка генетически закодированных параметров биосенсора. Компоновка генетических модулей генетически кодируемого биосенсора, включая aTF, операторские сайты (ОС), гексбоксы (-35, -10) и компоненты RBS. Цветные прямоугольники соответствуют взаимодействиям, которые обычно влияют на параметры биосенсора, такие как: аффинность лиганд-aTF (серый), aTF-оператор (розовый), RNAP-Hexbox (зеленый) и RBS (оранжевый). Влияние каждого параметра на характеристики «доза-реакция» показано на репрезентативных графиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Обзор типичного рабочего процесса оптимизации биосенсора DoE. (А) Обзор модульности компонентов биосенсора, показывающий транспортный модуль, кодирующий транспортный белок для импорта целевого эффектора, регуляторный модуль, относящийся к aTF, и выходной модуль, который кодирует репортерный белок, такой как sfGFP. Также показаны узлы регуляции, такие как RBS_trans, P_reg, P_out и RBS_out, которые соответствуют генетическим узлам, которые будут подвергнуты рандомизации с целью изучения параметров биосенсора. (B) Набор элементов последовательности, поддающихся рандомизации оснований, включая промоторы и RBS. Родительская последовательность промотора показана в верхней строке, а окончательная мутантная последовательность показана ниже, звезды указывают на неизмененные основания, тогда как K, M и N относятся к гуанину/тимину, аденину/цитозину или любому нуклеотиду соответственно. Промоутеры предлагают больший потенциал рандомизации за счет нацеливания на гексбоксы или сайты операторов, а также могут включать дублирование или изменение интервалов между последовательностями. Библиотеки RBS предлагают более ограниченные возможности рандомизации, однако их значительно легче отсеивать из-за их меньшего максимального разнообразия. (C) Уровни экспрессии вариантов характеризуются, а затем преобразуются в ранжированную библиотеку lin-log для преобразования категориальных вариантов множителей в 3 дискретных уровня, которые лучше поддаются анализу с помощью DoE. (D) Картирование экспериментального пространства выполняется с использованием мультиплексных комбинаций трех уровней каждого модуля для создания модели, которая может быть использована для обоснования выбора дизайна для настройки характеристик биосенсора в сторону желаемых результатов, то есть в сторону динамического диапазона или в сторону чувствительности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Модульность биосенсора, построение библиотеки промоторов и автоматизированный рабочий процесс. (A) Пример рандомизации специфических последовательностей в промоторе aTF и вставки в конструкцию биосенсора с помощью изотермической сборки. Жирным шрифтом выделены позиции, которые были рандомизированы на сайте оператора или в шестиугольниках в соответствии с предоставленным ключом во время синтеза вырожденных олигонуклеотидов. (B) Панель, описывающая преобразование полученной библиотеки вариантов биосенсора в клонируемого хозяина, такого как E. coli, и последующие шаги в зависимости от выхода трансформанта. Низкая эффективность преобразования может привести к плохому охвату теоретической библиотекой и недостаточному исследованию пространства проектирования. Устранение неполадок на этом этапе необходимо для того, чтобы убедиться, что значительная часть вариантов доступна для определения характеристик, с описанием общих мер по устранению неполадок. (C) Рабочий процесс этапов 1 и 2, как указано в протоколе, где символ красной руки указывает на ручные шаги, а шестеренка указывает на автоматизированные шаги. В рабочем процессе на этапе 1 выделены ключевые этапы протокола от выбора колонии до создания криопоголовья. На этапе 2 демонстрируется оживление и повторная компоновка криостоков для анализа по кривой реакции на дозу. (D) Панель, демонстрирующая окончательную процедуру перед скринингом, включая промывку клеток и перенос на пробирные пластины перед измерением флуоресценции и OD. На панели показан отсортированный пул из 5000 вариантов, при этом варианты, демонстрирующие ВКЛ/ВЫКЛ в количестве, превышающем последовательность родительского промотора (в 3,6 раза), выделены в оранжевом поле. Многие из вариантов могут быть сгруппированы вокруг 1, что указывает на плохую производительность и низкую вариабельность, вероятно, из-за рандомизации на уровне последовательности, вызывающей потерю функции. 226 вариантов, показанных в сюжете в рамках, были взяты вперед для надежной характеристики. Данные были адаптированы из оригинальной публикации Альвареса Гонсалеса и др.²³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Скрининг и дискретизация верхних вариантов библиотеки промоторов с помощью преобразования lin-log. (A) Описание стандартной процедуры генерации данных экспрессии для RBS или библиотеки промотора. Используя сортируемые варианты, которые представляют собой хороший диапазон уровней экспрессии, обработчики жидкостей используются для создания аналитических планшетов, предварительно заполненных заданной концентрацией эффектора, из которых можно получить кривые реакции на дозу 226 сортируемых вариантов. (B) После определения EC₅₀ и дальнейшего сокращения характеризуемой библиотеки до 100 вариантов, данные отображаются в виде гистограммы, показывающей сочетание различных чувствительностей, полученных в результате рандомизации промотора. (с)Данные EC₅₀ преобразуются с использованием уравнения лин-логарифмической скорости для преобразования непрерывного набора данных в категориальный, более подходящий для факторизации в DSD. (D) Преобразованные данные по варианту EC₅₀ теперь показаны в упрощенном масштабе и ранжированы от высокой до низкой активности EC₅₀ . Исходя из этого, выбираются 3 уровня, соответствующие верхнему (+1) среднему геометрическому (0) и нижнему (-1) вариантам, которые будут перенесены в DSD для исследования экспериментального пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Планирование эксперимента DSD, тестирование и результаты обучения на основе моделей. (A) Схематический рабочий процесс, показывающий создание таблицы проектирования DSD на основе преобразованных lin-log ранжированных библиотек модулей_{RBS trans}, P_reg, P_{out и RBSout} . Таблица проектирования DSD предлагает наименьшее количество комбинаций для эффективного картографирования экспериментального пространства. Приведен пример выходных данных, в котором +1, 0 и -1 относятся к верхним, средним и нижним вариантам для каждого регуляторного узла, как описано преобразованиями lin-log. Они конструируются с помощью изотермической сборки и подтверждаются секвенированием перед преобразованием в хост экспрессии для характеризации. (В) После трансформации клетки выращивают и анализируют в широком диапазоне концентраций эффекторов, а флуоресцентный выход измеряют для построения кривых "доза-реакция". Различные параметры, такие как nH и EC50, извлекаются из кривых «доза-реакция» и вводятся в DSD для создания прогностических моделей для каждого фактора. (C) Используя эти модели, можно сделать прогнозы о влиянии модуляции одного параметра биосенсора путем изменения уровня экспрессии любого регуляторного модуля. Важно отметить, что становится возможной глобальная настройка регуляторных узлов, позволяющая максимизировать один или несколько параметров биосенсора одновременно, обозначенных пунктирными красными линиями на каждом подграфике. (D) Оптимизация модели в направлении максимальной чувствительности приводит к глобально оптимизированной конструкции (сиреневый), кривая реакции на дозу которой строится относительно наиболее эффективной конструкции DSD (зеленый) и родительской биосенсорной конструкции (синий). Извлеченные n_H и EC₅₀ параметров показаны ниже графика, демонстрируя улучшение обоих параметров по сравнению с наиболее эффективной конструкцией DSD, подтверждая эффективность прогностических моделей, сгенерированных на основе DSD. Данные были адаптированы из оригинальной публикации Альвареса Гонсалеса и др.²³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Этапы протокола автоматизированной работы с жидкостями, используемые для подготовки библиотеки биосенсоров и настройки анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2 к дополнительному рисунку 6: Пошаговое создание окончательного дизайна скрининга (DSD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Библиотеки генетических элементов, охватывающие широкую генетическую изменчивость, имеют решающее значение для успеха методологии, основанной на DoE. Как показано на рисунке 2A, количество теоретических вариантов увеличивается с увеличением числа позиций, на которые нацелен мутагенез, а также со степенью рандомизации, при этом постоянно растущий размер библиотеки создает значительные узкие места для скрининга. Уменьшение количества целевых позиций или степени рандомизации может уменьшить количество вариантов, которые необходимо просматривать, и является привлекательным подходом, если требуется более целенаправленный подход к настройке или если существуют значительные априорные знания системы в качестве руководства. Однако в случае таких систем, как биосенсоры, которые имеют много перекрывающихся признаков или могут не иметь хорошо охарактеризованных генетических элементов, трудно обойти требование к размеру библиотеки. Использование автоматизированных манипуляторов жидкостей может упростить трудозатраты на отбор колоний и культивирование вариантов, особенно когда требуется расширенный сбор точек данных для построения более сложных функций, таких как кривые реакции дозы по сравнению с двумя точками сравнения данных, таких как ВКЛ/ВЫКЛ. Несмотря на то, что трудно точно количественно оценить время, сэкономленное за счет включения автоматизированных рабочих процессов, Основное преимущество его реализации заключается в том, что время может быть посвящено другим параллельным^{экспериментам}.

Несмотря на это, во многих случаях, когда размер библиотеки превышает 104^{, даже} методологии с помощью обработчиков жидкостей становятся непрактичными³⁹. В таких случаях весьма привлекательным подходом является предварительный скрининг вариантов с помощью проточных цитометров, обладающих значительно большей сортировочной способностью до 10⁷ клеток в час⁴⁰. Использование флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) с двумя раундами положительного отбора и, по меньшей мере, одним раундом отрицательного отбора обычно используется для сортировки наиболее эффективных вариантов биосенсоров перед более обширной характеристикой 16,26,42. Разработка и исполнение таких протоколов с использованием СУИМ были подробно рассмотрены в других разделах³¹. Первоначальные сортировочные скрининги возможны с использованием планшетных анализов с помощью обработчиков жидкостей, как описано в вышеуказанном протоколе; Путем сравнения данных ВКЛ/ВЫКЛ с использованием одной концентрации эффектора, как показано на рисунке 3D, можно выбрать только варианты биосенсоров с заметным усилением функции (в 3,6 раза, как предусмотрено в методах) для дальнейшей детальной характеризации, оптимизации разработки библиотек и времени проведения эксперимента. Однако как платформы FACS, так и платформы для работы с жидкостями требуют значительных капиталовложений для лаборатории и часто требуют определенного уровня технических знаний для эксплуатации и обслуживания. Экраны на основе агаровых пластин обеспечивают более низкий технический и финансовый барьер для входа и используются в сочетании с gfp или скринингом сине-белых колоний для отбора вариантов библиотеки RBS, а также мутантов ферментов на основе интенсивности флуоресценции^43,44. Они также, однако, ограничены в числе вариантов, которые могут быть эффективно обследованы, но также требуют значительной разницы во флуоресценции, чтобы их можно было обнаружить^. В качестве компромисса между полностью комбинаторной одновременной мутацией нескольких элементов одновременно, методология «разделяй и властвуй» вместо этого направлена на разделение больших библиотек вариантов на более управляемые экранирующие блоки⁴¹. Хотя модульный подход может быть прагматичным, он не позволяет эффективно исследовать пространство комбинаторного дизайна, поскольку известно, что производительность биологических компонентов сильно зависит от контекста, особенно у бактерий, где преобладает транскрипционная и трансляционная связь. Это может привести к тому, что при проектировании будут приниматься решения, ориентированные на локальные максимумы, а не на глобальные оптимумы.

Транспортировка и распознавание специфических индукторов – еще одна важная особенность развития биосенсоров, которая заслуживает упоминания, несмотря на то, что не является основным направлением изложенного протокола. Отсутствие подходящего aTF для молекулы-мишени представляет собой серьезную проблему для исследователей. Рациональный выбор существующего aTF, который связывает структурный аналог целевого эффектора, может обеспечить идеальный шаблон для применения рандомизации кодонов с целью настройки специфичности aTF на желаемый эффектор¹⁷. Выравнивание последовательности-мишени в соответствии с решенными структурами или предсказаниями Alphafold может позволить идентифицировать сайты связывания эффекторов с предполагаемыми аминокислотными остатками, подвергнутыми полурациональной рандомизации и ранжированию, адаптируемым к протоколу¹⁷. Аналогичным образом, выбор и модуляция транспортеров, ответственных за импорт/экспорт эффекторов, могут существенно изменить характеристики «доза-реакция» биосенсора. Было обнаружено, что экспрессия генов транспортеров играет важную роль в биосенсорном ответе, при этом диверсифицированная библиотека промоторов P_tac и RBS контролирует экспрессию транспортера MucK, используемого для стабилизации его экспрессии в течение нескольких раундов FACS, повышая^{надежность биосенсорного} ответа. Аналогичным образом, скрининг различных белков-транспортеров сам по себе может модулировать специфичность биосенсоров, при этом скрининг предполагаемого набора транспортеров PcaK с использованием биосенсора, чувствительного к PCA, приводит к идентификации двух транспортеров, уникально способных поглощать 3,5-гидроксилированные субстраты, расширяя набор соединений, обнаруживаемых этой системой²⁴.

Автоматизированные платформы могут стать еще более мощными инструментами для определения характеристик и исследований, если объединить принципы DoE с моделями глубокого обучения^46,47. После первого исследования пространства проектирования биосенсора с высокопроизводительной платформой, алгоритмы машинного обучения были использованы для прогнозирования функции нехарактерных последовательностей с ^{хорошей точностью}. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть легко применены при тестировании новых моделей обучения языку для промоторного дизайна, сродни моделям, которые были разработаны на основе предсказания последовательности кросс-RBS⁴⁸. Кроме того, интеграция таких моделей может использовать преимущества данных о функциях последовательности, содержащихся в нефункциональных конструкциях промотора, и обеспечить критическое понимание более широкой функциональности биосенсора в целом. А именно, это может устранить важнейшее ограничение рабочего процесса DoE, заключающееся в том, что ложные срабатывания, например, нефункциональный промотор, не обязательно приравниваются к измеренному результату, равному нулю, с такими явлениями, как ложная транскрипция или внесение элемента шума в данные DoE, который трудно идентифицировать и контролировать. Важно отметить, что для того, чтобы охватить все пространство экспериментального дизайна, любые сгенерированные библиотеки должны демонстрировать широкий спектр действий, поскольку недостаточный диапазон активности приведет к искажению результатов проектирования и создаст ненадежность любых статистических моделей, сгенерированных на основе набора данных³⁰. Если низкая вариативность библиотек становится проблемой, можно реализовать исследование других элементов последовательности или увеличить степень рандомизации, а также сравнивать вариации между библиотеками до тех пор, пока не будет достигнут подходящий пул вариантов.

Важнейшим аспектом процесса DoE является правильная оценка и выбор первичных и вторичных эффектов, полученных в результате DSD, которые затем будут включены в статистический анализ. DoE, будучи подходом, основанным на моделировании, очень подвержен переобучению и смещению, что может быстро усложнить процесс оптимизации, направляя итеративные инженерные усилия в неоптимальные разделы пространства проектирования⁴⁹. Таким образом, крайне важно убедиться, что любые конструкции надежно изолированы от таких эффектов, как на этапе концепции, так и на этапе анализа данных. На начальном этапе проектирования скрининга центрированные прогоны, в которых все факторы установлены в геометрическом среднем (т.е. 0,0,0,0), могут помочь уменьшить смещение модели за счет лучшего учета нелинейных взаимодействий, не добавляя при этом значительной экспериментальной нагрузки (1-3 дополнительных прогона)⁴⁹. Кроме того, включение рандомизированных дизайнов может помочь учесть посторонние переменные, которые не включены в план эксперимента, но все же могут влиять на измеряемые переменные отклика. В биологическом контексте рандомизация решает такие проблемы, как пространственно-временные эффекты, такие как положение пластины или вариации от партии к партии, что предотвращает существенное влияние таких эффектов на интерпретацию данных. Внимание к таким деталям на этой ранней стадии может повысить надежность моделей и привести к более надежным выводам. После проведения экспериментов, предложенных DSD, требуется статистический анализ данных для выяснения тех факторов, которые оказали существенное влияние на выходные параметры. Полунормальные графики обеспечивают интуитивно понятное визуальное представление величины эффекта, при этом эффекты без значимости обычно располагаются вдоль прямой линии, в то время как эффекты со значительным влиянием будут отклоняться от этой линии, что позволяет легко выбрать наиболее важные факторы в оптимизации биосенсора. Учитывая это, следует придерживаться консервативного подхода к выбору эффекта, как и при любом моделировании, чтобы снизить риск переобучения модели.

Возможность быстрого проектирования и оптимизации биосенсоров и других генетических схем значительно ускорит темпы исследований в области биотехнологий, таких как разработка штаммов и ферментов, а также диагностика в режиме реального времени. Появление методологий скрининга на основе DoE в этой области является особенно многообещающим, способствуя эффективному использованию времени и ресурсов при исследовании максимально возможного пространства для проектирования, и уже было использовано с большим успехом для оптимизации генетических цепей метаболических путей и биосенсоров 31,33,34,51. DoE особенно хорошо подходит для задач многофакторной оптимизации, в которых задействовано множество взаимодействий первого, второго или даже третьего порядка, которые в противном случае было бы трудно исследовать с помощью типичного подхода к экспериментальному планированию с использованием одного фактора за раз. Кроме того, попытки спроектировать один аспект биосенсора часто непреднамеренно приводят в жертву другому параметру, например, к повышению чувствительности за счет динамического диапазона⁵¹. Благодаря способности DoE отображать такие скрытые взаимодействия, а также создавать модели, которые предсказывают поведение биосенсора, цикл обучения сборочному тесту значительно ускоряется.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &микро; L CO-RE Наконечники, стерильные без фильтра	Гамильтон	235939
2,2 мл 96 Глубокая пластина, квадратные лунки с V-образным дном	Термо	11594754
300 &микро; L CO-RE Наконечники, штабелированные NTR, стерильные	Гамильтон	235985
96 хорошо прозрачное дно, черные микротитровые пластины	Грайнер	655097
Агароза	Инвитроген	16500100
Собранная плазмидная ДНК	Предоставлено пользователем	NA
Считыватель микропланшетов ClarioStar Plus	БМГ	NA
Смесь растворов дексинуклоэтида (дНТФ)	КЛЮВ	Н0447Л
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Фишер БиоРеаггентс	БП231-100
Лестница ДНК 100 б.о.	КЛЮВ	Н3231Л
Лестница ДНК 1KB	КЛЮВ	Н3232Л
Секвенирование ДНК	Источник: Бионаука	NA
Синтез ДНК	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Компотентные клетки	КЛЮВ	С2987Н
Гелевый краситель, фиолетовый X6 без паспорта безопасности	КЛЮВ	В7025С
Кюветы для электропорации генного пульсера / микропульсатора, зазор 0,2 см	Биорад	1652082
Графическая площадка Prism 10	ГрафПад	NA
Манипулятор для работы с жидкостями Hamilton Star	Гамильтон	NA
Инкубатор для вибростендов HT multitron	Инфорс ХТ	NA
Пакет статистического анализа JMP	СПМ	NA
LB Бульон (Миллер)	Мельник	Л3522
LB Бульон (Мельник) с агаром	Сигма	Л3147
Электропоратор MicroPulser	Биорад	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	КЛЮВ	Е2621С
Q5 Высокоточная ДНК-полимераза	КЛЮВ	М0491С
QIAprep Spin Midiprep Kit	ЦИАГЕН	12143
QIAprep Spin Мини-набор для подготовки	ЦИАГЕН	27104
QIAquick Набор для экстракции геля	ЦИАГЕН	28706Х4
Набор для очистки ПЦР QIAquick	ЦИАГЕН	28104
Qpix 420 Подборщик колоний	Молекулярные приборы Великобритания	NA
SOC Outgrowth Medium	КЛЮВ	В9020С
SYBR Safe DNA Гелевая морилка	Инвитроген	С33102
Буфер TAE (Трис-ацетат-ЭДТА, 50X)	Термо Фишер	В49
UltraPureTM дистиллированная вода без Dnase/Rnase	Инвитроген	10977015