Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Биосенсоры G-белка на основе BRET для измерения активности рецепторов, сопряженных с G-белком, в живых клетках

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68463

⸱

7 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В данном протоколе описывается использование биосенсоров на основе БРЭТ для измерения активации G-белка в живых клетках HEK293 в реальном времени при стимуляции лиганда рецептора, связанного с G-белком. Здесь β2-адренергический рецептор и каннабиноидный рецептор 1-го типа служат примерами для демонстрации эффективности сенсоров для нескольких подтипов G-белка и для различных GPCR.

Аннотация

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), составляют самое большое семейство трансмембранных рецепторов, играющих решающую роль в клеточной сигнализации, трансформируя внеклеточные стимулы во внутриклеточные реакции. Активация GPCR приводит к конформационным изменениям, которые обеспечивают взаимодействие с гетеротримерными G-белками. После активации субъединица Gα подвергается обмену GDP-GTP, диссоциируя от димера Gβγ и запуская нисходящие сигнальные каскады. Для изучения GPCR-опосредованной активации G-белка биолюминесцентно-резонансный перенос энергии биосенсоров (BRET) является высокочувствительным и неинвазивным подходом. Трицистронные датчики активности на основе G-белка (биосенсоры G-CASE), разработанные Schihada et al., обнаруживают диссоциацию гетеротримеров в качестве прокси для активации и позволяют осуществлять мониторинг активности GPCR в режиме реального времени с использованием одной плазмидной трансфекции, преодолевая ограничения подходов ко-трансфекции. Анализы BRET имеют ряд преимуществ по сравнению с методами, основанными на флуоресценции, такие как более низкий фоновый шум, уменьшенное фотообесцвечивание и повышенная чувствительность. В этом протоколе биосенсоры G-CASE на основе BRET были использованы в живых клетках и 96-луночных планшетах. В частности, мы оцениваем активность β2-адренергического рецептора (β2-AR) и каннабиноидного рецептора 1-го типа (CB1R) с точки зрения активации G-белка. С использованием клеток дикого типа HEK 293T, временно трансфицированных β2-AR, и HEK293T клеток, стабильно экспрессирующих CB1R, подтверждена устойчивость биосенсоров Gs и Gi3 G-CASE. Этот протокол подтверждает полезность данного подхода для фармакологических исследований и высокопроизводительного скрининга GPCR для лучшего понимания способности лигандов активировать определенные пути, например, посредством смещенной передачи сигналов и, таким образом, способствуя открытию новых терапевтических соединений.

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), представляют собой крупнейшее суперсемейство трансмембранных рецепторов, ответственных за трансформацию внеклеточных стимулов во внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к специфическим биологическим реакциям. Они являются ключевыми фармакологическими мишенями, при этом примерно 30% продаваемых препаратов действуют на GPCR1. Связывание лиганда GPCR индуцирует конформационные изменения в рецепторе, облегчая взаимодействие с гетеротримерными G-белками и/или GPCR-киназами (GRK) и β-аррестинами, тем самым инициируя нисходящую передачу сигналов или интернализацию рецептора2.

Гетеротримерные G-белки служат основными внутриклеточными преобразователями передачи сигналов GPCR и состоят из трех субъединиц: Gα, Gβ и Gγ. Эти гететертримеры классифицируются на четыре семейства — Gi/o, Gs, Gq и G12/13 — в зависимости от подтипа Gα , каждый из которых активирует различные сигнальные пути: подтип Gi/o ингибирует аденилатциклазу, тогда как Gs стимулирует ее, Gq активирует фосфолипазу C-β, а G12/13 регулирует ГТФазы семейства Rho.

Активация GPCR приводит к их конформационным перестройкам, обеспечивая быстрое вовлечение G-белка в пределах кинетики за доли секунды. Этот процесс вызывает конформационные изменения G-белка, способствуя обмену GDP-GTP в субъединице Gα. Связывание GTP дополнительно изменяет конформацию Gα субъединицы, что приводит к его диссоциации от димера Gβγ, что позволяет распространять сигнал. Таким образом, G-белки играют решающую роль в модуляции специфичности и временной динамики клеточных реакций, регулируя различные эффекторные белки, такие как аденилатциклаза или ионные каналы 3,4,5.

Этот протокол описывает измерение активации или инактивации G-белка с помощью биолюминесцентных биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (BRET) при стимуляции лиганда GPCR в живых клетках. Вдохновленная новаторской работой над биосенсорами G-белка 6,7,8,9, система G-CASE (G protein tri-cistronic activity sensors), представленная Schihada et al.10, основана на BRET между мечеными Gα и Gβγ субъединицами и предлагает оптимизированный подход, требующий только одной трансфекции плазмиды. Эта особенность повышает чувствительность и смягчает проблемы, связанные с котрансфекцией нескольких плазмид, кодирующих три субъединицы (Gα, Gβ и Gγ) гетеротримерного G-белка. Эти датчики были доступны академическим исследовательским группам на коммерческой основе (см. Таблицу материалов).

BRET обладает значительными преимуществами по сравнению с резонансной передачей энергии Förster (FRET). В БРЭТ передача энергии происходит между биолюминесцентным донором и флуоресцентным акцептором без необходимости использования внешних источников света. Эта собственная биолюминесценция уменьшает проблемы, связанные с FRET, такие как автофлуоресценция и рассеяние света, что приводит к снижению фонового сигнала и повышению чувствительности анализа 6,7,11.

Отсутствие внешнего возбуждения в BRET сводит к минимуму фотообесцвечивание и фототоксические эффекты, что приводит к снижению фоновых сигналов по сравнению с FRET. Следовательно, анализы BRET чаще всего демонстрируют повышенную чувствительность, что позволяет измерять активацию G-белка конститутивно активных GPCR. Повышенная чувствительность анализов BRET облегчает обнаружение тонких биологических взаимодействий, что особенно ценно в фармакологических исследованиях, где точное измерение активности рецепторов имеет решающее значение.

Эти биосенсоры могут быть переведены в высокопроизводительный скрининг на 96-луночных или 384-луночных планшетах, как недавно продемонстрировали Скотт-Деннис и др., где метод с использованием этих биосенсоров был разработан в мембранном анализе на 384 лунки для анализа активности каннабиноидных рецепторов CB1R и CB2R12. В данной статье описывается использование этих биосенсоров в 96-луночных планшетах в живых клетках путем измерения активности β2-AR в качестве прототипа GPCR класса А, который связывает белок Gs и CB1R, относящийся к GPCR класса A и активирующий белок семейства Gi/o . Валидировано использование двух биосенсоров G-CASE: Gs и Gi3 в клетках HEK 293T с GPCR либо временно (с β2-AR), либо стабильно (с CB1R).

Важно отметить, что этот эксперимент может быть проведен на различных клеточных линиях, демонстрируя универсальность и надежность этой методики в различных клеточных контекстах. Это гарантирует, что метод может быть применен к различным экспериментальным моделям, что делает его ценным инструментом для изучения передачи сигналов GPCR в различных физиологических и фармакологических условиях. На рисунке 1 показан принцип работы датчиков активности G-белка на основе BRET.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Принцип работы датчиков активности G-белка на основе BRET. Сенсоры G-белка состоят из трех субъединиц: Gα, нативный Gβ и Gγ. Субъединица Gα слита с маленькой и яркой нанолюциферазой (Nluc), в то время как субъединица Gγ помечена N-концевой меткой с кольцевой пермутацией Венеры (cpVenus173). Гены, кодирующие эти сконструированные субъединицы G-белка, объединены в одну плазмиду. Связывание лиганда с GPCR вызывает конформационные изменения GPCR, способствуя набору G-белка и последующей диссоциации с последующим гидролизом GTP. Эта диссоциация нарушает передачу энергии между партнерами, что приводит к снижению сигнала BRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Луночный посев в пластину (День 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все протоколы культивирования клеток в стерильном ламинарном колпаке для поддержания стерильных условий. Белые луночные планшеты с прозрачным плоским дном используются для отслеживания роста и жизнеспособности клеток. Используйте полностью белую пластину лунки, чтобы избежать использования наклейки на шаге 3.2.1.

  1. Покрытие луночных пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обхода этого этапа можно использовать пластины с предварительно нанесенным покрытием.
    1. Налейте в многоканальный резервуар около 6 мл стерильно отфильтрованного раствора поли-L-лизина (ФАПЧ) (0,01%). С помощью многоканальной пипетки заполните каждую лунку 96-луночного микропланшета с 96 лунками 60 мкл ФАПЧ.
    2. Поместите микропланшет в темное место и выдержите в течение 20 минут.
    3. Во время инкубации приступайте к подготовке клеток, как описано в пунктах 1.2.1-1.2.3.
    4. Отберите раствор ФАПЧ с помощью многоканальной пипетки и храните его при температуре 4 °C в пробирке объемом 15 мл.
    5. Трижды промойте пластину с помощью DPBS, чтобы удалить свободную ФАПЧ, которая может вызвать деградацию клеток.
  2. Подготовка и нанесение покрытий на ячеечные клетки
    1. Культивирование клеток HEK293 в модифицированной среде Dulbecco Eagle с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C в 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS добавляют в питательную среду для обеспечения необходимых питательных веществ и факторов роста, необходимых для надлежащей жизнеспособности клеток.
    2. Удалите среду и промойте клетки 2 мл DPBS.
    3. Добавьте 0,5 мл трипсина и инкубируйте в течение 3-5 минут при 37 °C, чтобы отделить клетки.
    4. Добавьте 4,5 мл DMEM в колбу, чтобы нейтрализовать трипсин, затем дважды пипетируйте вверх и вниз, чтобы отделить клетки и снова суспендировать их.
    5. Переложите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при температуре 1000 x g (при комнатной температуре, RT).
    6. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл DMEM.
    7. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Малассеса и приготовьте 9 мл при концентрации 300 000 клеток/мл. Поместите их в многоканальный резервуар и засейте 96-луночный микропланшет, вылив 100 μL в лунку с помощью многоканальной пипетки (конечная плотность 30 000 клеток/лунку).
    8. Инкубируйте микропланшет при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение примерно 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достигать слияния около 70%-80% для эффективной трансфекции.

2. Трансфекция плазмид (день 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекцию клеток можно проводить в первый день на взвешенных клетках перед осаждением, на этапе 1.2.7, и сбор данных на 3-й день.

  1. Разбавьте 10 г желаемой плазмидной ДНК (например, 5 г β2-адренергического рецептора и 5 г Gs(short)-CASE в клетках HEK wt или только 10 г Gi3-CASE в клетках HEK CB1) и 20 мкл липофектамина в пробирках, содержащих 500 мкл среды Opti-MEM. Инкубировать при RT в течение 5 минут.
    1. Для получения отрицательного контроля замените β2-адренергический рецептор пустой плазмидой pcDNA 3.1 в той же концентрации. Соедините растворы в одну пробирку и перемешайте до получения трансфекционной смеси (1 мл).
  2. Инкубировать трансфекционную смесь при РТ в течение 20 мин.
  3. Добавьте по 10 мкл трансфекционной смеси из шага 2.2 по каплям в каждую лунку и осторожно покачивайте пластину вперед и назад, чтобы обеспечить полное перемешивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ДНК составляет 100 нг на лунку.
  4. Инкубировать микропланшет в увлажненном инкубаторе при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.

3. Сбор данных (День 3)

  1. Подготовка лиганда
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS): NaCl 140 мМ, хлорид калия 5 мМ, хлорид кальция 1 мМ, гептагидрат сульфата магния 0,4 мМ, гексагидрат хлорида магния 0,5 мМ, дигидрат двухосновного фосфата натрия 0,3 мМ, одноосновной фосфат калия 0,4 мМ, D-глюкоза (декстроза) 6 мМ, бикарбонат натрия 4 мМ, pH 7,4, фильтрованный 0,22 мкм.
    1. Приготовьте исходный раствор в максимально возможной концентрации в соответствующем растворителе для солюбилизации для различных лигандов (в этом протоколе изопротеренол получают в H20 mQ, а WIN-55.212-2 в ДМСО).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию стокового раствора лиганда необходимо регулировать в зависимости от растворимости и известной константы диссоциации (Kd) лиганда.
    2. Из этого материала готовят серийное разведение лиганда в диапазоне около Kd лиганда в пределах 10 мкл в соответствующем растворителе для солюбилизации. Храните этот серийный раствор при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от лиганда, диапазон серийного разведения может быть заморожен и разморожен до десяти раз, прежде чем произойдет деградация. Приготовьте раствор, содержащий только растворитель, используемый для растворения лиганда, с учетом состояния транспортного средства (в данном протоколе Н20 или ДМСО).
    3. Для каждой концентрации лиганда и носителя проводят разведение 1/100 в HBSS путем добавления 1,3 мкл каждой концентрации в общий объем 130 мкл. Это приводит к конечной концентрации 1% транспортного средства в HBSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот окончательный диапазон разбавления используется для экспериментов путем добавления 10 мкл для получения общего объема 100 мкл на лунку. Это приводит к тому, что конечная концентрация носителя во всех скважинах составляет 0,1%. Объем 130 мкл соответствует количеству, необходимому для заполнения одного ряда 96-луночного планшета: (10 x 12) ± 10%. Каждый ряд соответствует разной концентрации лигандов, причем последний ряд служит в качестве управления транспортным средством.
    4. Приготовьте 980 мкл разведения Фуримазина 1/100 из исходного раствора (9,8 мкл в 970,2 мкл HBSS с получением общего объема 980 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор фуримазина и дайте ему поинкубироваться не менее 3 минут. Затем добавьте его непосредственно перед приобретением. Его не следует готовить слишком рано, так как период полураспада сигнала составляет примерно 120 минут при комнатной температуре. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать производные фуримазина длительного действия, такие как вивазин и эндуразин. Эти подложки поддерживают стабильный сигнал BRET в течение 48 часов.
  2. Показания пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многорежимный считыватель пластин. Отрегулируйте измерение в соответствии с изучаемыми условиями и количеством повторов. Здесь сбор данных разбивается на три показания по 4 столбцам, что соответствует 32 скважинам. Все показания производятся с помощью верхней оптики с прозрачной крышкой, чтобы предотвратить буферное испарение. Перед всеми показаниями отрегулируйте коэффициент усиления. В данном исследовании усиление было зафиксировано на уровне 3600. Можно избежать ручного добавления лиганда с помощью автоматического инжектора или шприцевой системы, которая имеется во многих считывателях планшетов.
    1. Удалите среду из первых 4 столбцов 96-луночного планшета. Промойте каждую лунку 100 μL HBSS и добавьте 80 μL HBSS. Наклейте белую наклейку на нижнюю сторону тарелки. Это улучшает измерения флуоресценции и/или биолюминесценции.
    2. Запись спектров люминесценции G-белка: Вставьте 96-луночный планшет в считыватель планшетов. Запишите излучение cpVenus173 с помощью монохроматора 535/30 нм и измерьте люминесцентное излучение в диапазоне от 500 до 600 нм с разрешением 2 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения излучения флуоресценции при возбуждении cpVenus173 .
    3. Запись спектров люминесценции G-белка: Зарегистрируйте интенсивность излучения Nluc с помощью монохроматора 450/40 нм и измерьте люминесцентное излучение в диапазоне от 400 нм до 600 нм с разрешением 5 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения отсутствия биолюминесценции перед добавлением субстрата Nluc, фуримазина.
    4. Извлеките планшет из считывателя пластин и добавьте в каждую лунку по 10 мкл ранее приготовленного раствора фуримазина (шаг 3.1.4.) с помощью многоканальной пипетки.
    5. Повторите шаг 3.2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения биолюминесценции при добавлении фуримазина. Непосредственно после этого измерения перейдите к шагу 3.2.6, чтобы предотвратить отклонение сигнала из-за потребления и/или ухудшения качества фуримазина. Изменение сигнала BRET может происходить из-за потребления и/или деградации фуримазина, а регуляторные процессы прекращают ответ, вызванный стимуляцией агонистов. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать ингибиторы GRK (CMPD101) и ингибиторы интернализации (dynasore) или генетически отредактированные клетки, лишенные GRK или арестинов.
    6. Регистрация базального BRET G-белка: Перед добавлением лиганда GPCRs зарегистрируйте интенсивность излучения Nluc и cpVenus173 с помощью монохроматора 450/40 нм и 535/30 нм соответственно. Измерьте 3 цикла по 60 с с интервалом измерения 0,30 с (общее время считывания 3 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение времени интервала измерения до 0,90 с обычно значительно улучшает отношение сигнал/шум, но приводит к гораздо более длительному времени считывания. Экспериментатор должен решить, что важнее для их применения: более высокое временное разрешение или улучшенное отношение сигнал/шум.
    7. Извлеките планшет из считывателя планшетов и добавьте по 10 мкл ранее подготовленного диапазона разведения лиганда GPCR (шаг 3.1) соответственно в каждую лунку одной колонки с помощью многоканальной пипетки. Выполните ту же процедуру для 3 других столбцов.
    8. Регистрация BRET, индуцированной лигандом G-белка: Регистрация интенсивности излучения Nluc и cpVenus173 с использованием монохроматора 450/40 нм и 535/30 нм соответственно. Отмерьте 16 циклов по 60 с интервалом измерения 0,30 с (общее время считывания 16 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте параметры измерений для измерения скважин в колоннах. Дубликаты считываются с разницей во времени 2,4 с.
    9. Повторите шаг 3.2. для следующих четырех столбцов 2 раза.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте данные о каждом считывании в отдельных файлах электронных таблиц данных.

  1. Контрольные показания
    1. Построите график зависимости интенсивности излучения от длины волны.
  2. Базальные показания BRET
    1. Для каждой лунки рассчитайте коэффициент BRET трех прочтений. Коэффициент BRET определяется как экцепторная эмиссия/донорная эмиссия.
      figure-protocol-1
    2. Для каждой лунки рассчитайте среднее значение трех соотношений BRET до добавления лиганда. Эта величина называется базальным отношением BRET до стимуляции лиганда: Ratiobasal.
    3. Чтобы нормализовать предыдущие коэффициенты BRET для всех скважин, для каждого из трех измерений соответственно вычтите значение коэффициента BRET, рассчитанное по контрольным колодцам транспортного средства, из коэффициента BRET в соответствующее время измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируемые данные соответствуют временным точкам до добавления лиганда. Поскольку лунки, в которые добавляется лиганд, известны, контрольные колодцы транспортного средства могут быть идентифицированы соответствующим образом.
  3. Показания BRET, индуцированные лигандом G-белка
    1. Для каждой скважины рассчитайте коэффициент BRET для каждого чтения, как описано в разделе 4.2.1. Эти значения называютсяRatio stim.
    2. Чтобы количественно оценить изменения, вызванные лигандом, рассчитайте ΔBRET для каждогостимула Ratio каждой лунки в процентах от базального. Для этого используйтесоответствующий базальный коэффициент, рассчитанный ранее в разделе 4.2.2.
      figure-protocol-2
    3. Рассчитайте ΔBRET (%) для нормализации значений ΔBRET для каждой скважины. Для этого вычтите соответствующие значения ΔBRET автомобиля.
    4. Чтобы визуализировать кинетику ΔBRET в таблице данных, добавьте три базальных показания BRET, нормализованные на шаге 4.2.3. напротив соответствующих значений ΔBRET (%), рассчитанных для каждой скважины в разделе 4.3.3.
    5. Постройте график зависимости предыдущих данных от времени чтения, чтобы получить кинетический график.
    6. Когда будет достигнуто плато, возьмите значения ΔBRET (%) в выбранное время и сопоставьте их с концентрацией используемого лиганда, поскольку каждая скважина соответствует своей концентрации лиганда. Получается кривая «доза-реакция».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плато обычно достигается примерно через 5 минут после стимуляции лигандом. В этом протоколе отображаются значения, полученные после 15-минутной стимуляции лигандом. Чтобы сравнить данные разных экспериментов, отрегулируйте время в зависимости от кинетики активации.
    7. Постройте график предыдущих данных в программном обеспечении для анализа и подгоните с помощью сигмоидальной подгонки «доза-реакция» по трем параметрам на основе следующего уравнения:
      figure-protocol-3
      где X – концентрация используемого лиганда, Y – значения ΔBRET (%), Top и Bottom – плато, а EC50 – концентрация лиганда, необходимая для достижения 50% максимального эффекта. Это позволяет получить Emax и EC50.
    8. Сравните данные из контрольного условия с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Результаты считаются значимыми при p < 0,05.

figure-protocol-4
Рисунок 2: Основные этапы проведения анализа BRET. Обзор трех основных экспериментальных этапов, описанных в этом протоколе (посев клеток, трансфекция клеток и получение сигнала BRET), а также подробное пошаговое руководство по сбору данных. Экспериментальная установка: В 1-й день клетки засеваются в белый 96-луночный планшет с покрытием из ФАПЧ и плоским прозрачным дном при плотности 30 000 клеток/лунку. На 2-й день клетки трансфицируют выбранным сенсором G-белка вместе с исследуемыми плазмидами GPCR или pcDNA3.1. После 24-часовой инкубации активность сенсора G-белка измеряется с помощью биолюминесценции и показаний флуоресценции при добавлении лиганда. Сбор данных: После промывки ячеек HBSS в лунки добавляют 80 мкл HBSS, а флуоресцентное излучение cpVenus173 измеряют в диапазоне от 500 нм до 600 нм с помощью монохроматора 535/30 нм (1). Затем измеряют биолюминесценцию Nluc в диапазоне от 400 нм до 600 нм с помощью монохроматора с длиной волны 450/40 нм как до (2), так и после (3) добавления фуримазина. Наконец, сигнал BRET для базальной и лиганд-индуцированной активности G-белка измеряют с помощью монохроматоров с длиной волны 450/40 нм и 535/30 нм, соответственно, в течение 3 минут (3 цикла по 60 с с интервалом измерения 0,30 с) (4) и 16 минут (16 циклов по 60 с с интервалом измерения 0,30 с) (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обобщенная схема постановки и выполнения эксперимента подробно изложена на рисунке 2. Активация белков семейства Gs или Gi/o после лигандной активации двух GPCR оценивалась с помощью биосенсоров G-CASE. Во-первых, был изучен прототип GPCR семейства А, в котором β2-AR временно трансфицируется в клетках HEK 293T. При применении агониста (т.е. изопротеренола) к клеткам HEK wt, экспрессирующим β2-AR вместе с сенсором белка Gs(sho...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем протоколе описывается использование биосенсоров BRET для измерения активации G-белка в живых клетках в режиме реального времени в ответ на стимуляцию GPCR специфическими лигандами. Используя биолюминесцентный принцип донорно-акцепторного переноса энергии, этот подход позволяет обнаруживать конформационные изменения и диссоциацию гетеротримерных G-белков при активации рецептора, обеспечивая надежную и чувствительную платформу для изучения передачи сигналов GPCR. Этот протокол ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Клетки HEK-CB1 были добрым подарком от M. Guzman (Университет Комплутенсе, Мадрид, Испания), а β2-адренергический рецептор плазмида была добрым подарком от D. Perrais (IINS, Междисциплинарный институт неврологии, Бордо, Франция). Gi3-CASE и Gs(short)-CASE были подарком от Гуннара Шульте (плазмида Addgene #168122; Адгеновая плазмида #168124). Некоторые иллюстрации были созданы с использованием BioRender.com. Эта работа поддержана Министерством высшего образования и исследований Франции и финансируется Французским национальным исследовательским агентством (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) и SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Продвинутая пластина на 96 лунок для посевов, белая с прозрачным плоским дном, с крышкой, bio-one GreinerДатшер655983
BrightMax ClearLine White FilmДатшер760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Диметилсульфоксид (DMSO)SigmaD4540
DPBS Модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния, жидкий, стерильно фильтрованный, подходит для клетокSigma D8537
Дульбекко модифицированный Eagle' s средний (DMEM) GlutaMAXSigmaD0822Тепло 37 градусов; Водяная баня C перед использованием
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-ВенераAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Подарок от Гуннара Шульте
Гальфасы (короткая изоформа)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-ВенераAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Подарок от Гуннара Шульте
HEK-293T стабильно экспрессирует CB1R (HEK CB1)Добрый подарок от М. Гусмана (Университет Комплутенсе, Мадрид, Испания)
HEK-293T дикого типа (HEK wt)
ИзопротеренолSigmaI6504Растворён в H20 и хранится в – 20 и °; C
Липофектамин 2000Invitrogen 11668019
Добавка Opti-MEM I с уменьшенной средней сывороткой GlutaMAXФишер11564506
pcDNA3 Флаг бета-2-адренергическо-рецепторный метка FLAG C-terДобрый подарок от Д. Перре (IINS, Бордо)
pcDNA3.1-(пустой)-ТЕГAddgene138209
Пенициллин/стрептомицинSigma P4333
Раствор поли-L-лизина (PLL)SigmaRNBL7086
Trypsin-EDTA Sigma T3924
ПОБЕДА-55,212-2Cayman Chemicals10009023Растворён в DMSO и хранится в – 20 и °; C

Ссылки

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).
  3. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. protein pathways. Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).
  5. Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).
  6. Van Unen, J., et al. A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells. PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).
  7. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  8. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2411 (2001).
  9. Galés, C., et al. Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).
  10. Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors. Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).
  11. Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors. Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).
  12. Scott-Dennis, M., et al. Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors. Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).
  13. Violin, J. D., et al. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics. J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).
  14. Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics. Life Sci. 38, 309-315 (1985).
  15. Thomas, B. F., et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).
  16. Schihada, H., et al. Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias. J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

Теги

GPCRBRETG96HEK293T2CB1
Биосенсоры G-белка на основе BRET для измерения активности рецепторов, сопряженных с G-белком, в живых клетках
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.