Биосенсоры G-белка на основе BRET для измерения активности рецепторов, сопряженных с G-белком, в живых клетках

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), представляют собой крупнейшее суперсемейство трансмембранных рецепторов, ответственных за трансформацию внеклеточных стимулов во внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к специфическим биологическим реакциям. Они являются ключевыми фармакологическими мишенями, при этом примерно 30% продаваемых препаратов действуют на GPCR¹. Связывание лиганда GPCR индуцирует конформационные изменения в рецепторе, облегчая взаимодействие с гетеротримерными G-белками и/или GPCR-киназами (GRK) и β-аррестинами, тем самым инициируя нисходящую передачу сигналов или интернализацию рецептора².

Гетеротримерные G-белки служат основными внутриклеточными преобразователями передачи сигналов GPCR и состоят из трех субъединиц: G_α, G_β и G_γ. Эти гететертримеры классифицируются на четыре семейства — G_i/o, G_s, G_q и G_12/13 — в зависимости от подтипа G_α , каждый из которых активирует различные сигнальные пути: подтип G_i/o ингибирует аденилатциклазу, тогда как G_s стимулирует ее, G_q активирует фосфолипазу C-β, а G_12/13 регулирует ГТФазы семейства Rho.

Активация GPCR приводит к их конформационным перестройкам, обеспечивая быстрое вовлечение G-белка в пределах кинетики за доли секунды. Этот процесс вызывает конформационные изменения G-белка, способствуя обмену GDP-GTP в субъединице G_α. Связывание GTP дополнительно изменяет конформацию G_α субъединицы, что приводит к его диссоциации от димера G_βγ, что позволяет распространять сигнал. Таким образом, G-белки играют решающую роль в модуляции специфичности и временной динамики клеточных реакций, регулируя различные эффекторные белки, такие как аденилатциклаза или ионные каналы ^3,4,5.

Этот протокол описывает измерение активации или инактивации G-белка с помощью биолюминесцентных биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (BRET) при стимуляции лиганда GPCR в живых клетках. Вдохновленная новаторской работой над биосенсорами G-белка ^6,7,8,9, система G-CASE (G protein tri-cistronic activity sensors), представленная Schihada et ^al.10, основана на BRET между мечеными G_α и G_βγ субъединицами и предлагает оптимизированный подход, требующий только одной трансфекции плазмиды. Эта особенность повышает чувствительность и смягчает проблемы, связанные с котрансфекцией нескольких плазмид, кодирующих три субъединицы (G_α, G_β и G_γ) гетеротримерного G-белка. Эти датчики были доступны академическим исследовательским группам на коммерческой основе (см. Таблицу материалов).

BRET обладает значительными преимуществами по сравнению с резонансной передачей энергии Förster (FRET). В БРЭТ передача энергии происходит между биолюминесцентным донором и флуоресцентным акцептором без необходимости использования внешних источников света. Эта собственная биолюминесценция уменьшает проблемы, связанные с FRET, такие как автофлуоресценция и рассеяние света, что приводит к снижению фонового сигнала и повышению чувствительности анализа ^6,7,11.

Отсутствие внешнего возбуждения в BRET сводит к минимуму фотообесцвечивание и фототоксические эффекты, что приводит к снижению фоновых сигналов по сравнению с FRET. Следовательно, анализы BRET чаще всего демонстрируют повышенную чувствительность, что позволяет измерять активацию G-белка конститутивно активных GPCR. Повышенная чувствительность анализов BRET облегчает обнаружение тонких биологических взаимодействий, что особенно ценно в фармакологических исследованиях, где точное измерение активности рецепторов имеет решающее значение.

Эти биосенсоры могут быть переведены в высокопроизводительный скрининг на 96-луночных или 384-луночных планшетах, как недавно продемонстрировали Скотт-Деннис и др., где метод с использованием этих биосенсоров был разработан в мембранном анализе на 384 лунки для анализа активности каннабиноидных рецепторов CB1R и CB2R¹². В данной статье описывается использование этих биосенсоров в 96-луночных планшетах в живых клетках путем измерения активности β2-AR в качестве прототипа GPCR класса А, который связывает белок G_s и CB1R, относящийся к GPCR класса A и активирующий белок семейства G_i/o . Валидировано использование двух биосенсоров G-CASE: G_s и G_i3 в клетках HEK 293T с GPCR либо временно (с β2-AR), либо стабильно (с CB1R).

Важно отметить, что этот эксперимент может быть проведен на различных клеточных линиях, демонстрируя универсальность и надежность этой методики в различных клеточных контекстах. Это гарантирует, что метод может быть применен к различным экспериментальным моделям, что делает его ценным инструментом для изучения передачи сигналов GPCR в различных физиологических и фармакологических условиях. На рисунке 1 показан принцип работы датчиков активности G-белка на основе BRET.

Рисунок 1: Принцип работы датчиков активности G-белка на основе BRET. Сенсоры G-белка состоят из трех субъединиц: G_α, нативный G_β и G_γ. Субъединица G_α слита с маленькой и яркой нанолюциферазой (Nluc), в то время как субъединица G_γ помечена N-концевой меткой с кольцевой пермутацией Венеры (cpVenus¹⁷³). Гены, кодирующие эти сконструированные субъединицы G-белка, объединены в одну плазмиду. Связывание лиганда с GPCR вызывает конформационные изменения GPCR, способствуя набору G-белка и последующей диссоциации с последующим гидролизом GTP. Эта диссоциация нарушает передачу энергии между партнерами, что приводит к снижению сигнала BRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Луночный посев в пластину (День 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все протоколы культивирования клеток в стерильном ламинарном колпаке для поддержания стерильных условий. Белые луночные планшеты с прозрачным плоским дном используются для отслеживания роста и жизнеспособности клеток. Используйте полностью белую пластину лунки, чтобы избежать использования наклейки на шаге 3.2.1.

1. Покрытие луночных пластин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обхода этого этапа можно использовать пластины с предварительно нанесенным покрытием.
   1. Налейте в многоканальный резервуар около 6 мл стерильно отфильтрованного раствора поли-L-лизина (ФАПЧ) (0,01%). С помощью многоканальной пипетки заполните каждую лунку 96-луночного микропланшета с 96 лунками 60 мкл ФАПЧ.
   2. Поместите микропланшет в темное место и выдержите в течение 20 минут.
   3. Во время инкубации приступайте к подготовке клеток, как описано в пунктах 1.2.1-1.2.3.
   4. Отберите раствор ФАПЧ с помощью многоканальной пипетки и храните его при температуре 4 °C в пробирке объемом 15 мл.
   5. Трижды промойте пластину с помощью DPBS, чтобы удалить свободную ФАПЧ, которая может вызвать деградацию клеток.
2. Подготовка и нанесение покрытий на ячеечные клетки
   1. Культивирование клеток HEK293 в модифицированной среде Dulbecco Eagle с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C в 5%_CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS добавляют в питательную среду для обеспечения необходимых питательных веществ и факторов роста, необходимых для надлежащей жизнеспособности клеток.
   2. Удалите среду и промойте клетки 2 мл DPBS.
   3. Добавьте 0,5 мл трипсина и инкубируйте в течение 3-5 минут при 37 °C, чтобы отделить клетки.
   4. Добавьте 4,5 мл DMEM в колбу, чтобы нейтрализовать трипсин, затем дважды пипетируйте вверх и вниз, чтобы отделить клетки и снова суспендировать их.
   5. Переложите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при температуре 1000 x g (при комнатной температуре, RT).
   6. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл DMEM.
   7. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Малассеса и приготовьте 9 мл при концентрации 300 000 клеток/мл. Поместите их в многоканальный резервуар и засейте 96-луночный микропланшет, вылив 100 μL в лунку с помощью многоканальной пипетки (конечная плотность 30 000 клеток/лунку).
   8. Инкубируйте микропланшет при температуре 37 °C, 5%_CO2 в течение примерно 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достигать слияния около 70%-80% для эффективной трансфекции.

2. Трансфекция плазмид (день 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекцию клеток можно проводить в первый день на взвешенных клетках перед осаждением, на этапе 1.2.7, и сбор данных на 3-й день.

1. Разбавьте 10 г желаемой плазмидной ДНК (например, 5 г β2-адренергического рецептора и 5 г G_s(short)-CASE в клетках HEK wt или только 10 г G_i3-CASE в клетках HEK CB1) и 20 мкл липофектамина в пробирках, содержащих 500 мкл среды Opti-MEM. Инкубировать при RT в течение 5 минут.
   1. Для получения отрицательного контроля замените β2-адренергический рецептор пустой плазмидой pcDNA 3.1 в той же концентрации. Соедините растворы в одну пробирку и перемешайте до получения трансфекционной смеси (1 мл).
2. Инкубировать трансфекционную смесь при РТ в течение 20 мин.
3. Добавьте по 10 мкл трансфекционной смеси из шага 2.2 по каплям в каждую лунку и осторожно покачивайте пластину вперед и назад, чтобы обеспечить полное перемешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ДНК составляет 100 нг на лунку.
4. Инкубировать микропланшет в увлажненном инкубаторе при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч.

3. Сбор данных (День 3)

1. Подготовка лиганда
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS): NaCl 140 мМ, хлорид калия 5 мМ, хлорид кальция 1 мМ, гептагидрат сульфата магния 0,4 мМ, гексагидрат хлорида магния 0,5 мМ, дигидрат двухосновного фосфата натрия 0,3 мМ, одноосновной фосфат калия 0,4 мМ, D-глюкоза (декстроза) 6 мМ, бикарбонат натрия 4 мМ, pH 7,4, фильтрованный 0,22 мкм.
   1. Приготовьте исходный раствор в максимально возможной концентрации в соответствующем растворителе для солюбилизации для различных лигандов (в этом протоколе изопротеренол получают в H₂0 mQ, а WIN-55.212-2 в ДМСО).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию стокового раствора лиганда необходимо регулировать в зависимости от растворимости и известной константы диссоциации (K_d) лиганда.
   2. Из этого материала готовят серийное разведение лиганда в диапазоне около K_d лиганда в пределах 10 мкл в соответствующем растворителе для солюбилизации. Храните этот серийный раствор при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от лиганда, диапазон серийного разведения может быть заморожен и разморожен до десяти раз, прежде чем произойдет деградация. Приготовьте раствор, содержащий только растворитель, используемый для растворения лиганда, с учетом состояния транспортного средства (в данном протоколе Н₂0 или ДМСО).
   3. Для каждой концентрации лиганда и носителя проводят разведение 1/100 в HBSS путем добавления 1,3 мкл каждой концентрации в общий объем 130 мкл. Это приводит к конечной концентрации 1% транспортного средства в HBSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот окончательный диапазон разбавления используется для экспериментов путем добавления 10 мкл для получения общего объема 100 мкл на лунку. Это приводит к тому, что конечная концентрация носителя во всех скважинах составляет 0,1%. Объем 130 мкл соответствует количеству, необходимому для заполнения одного ряда 96-луночного планшета: (10 x 12) ± 10%. Каждый ряд соответствует разной концентрации лигандов, причем последний ряд служит в качестве управления транспортным средством.
   4. Приготовьте 980 мкл разведения Фуримазина 1/100 из исходного раствора (9,8 мкл в 970,2 мкл HBSS с получением общего объема 980 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор фуримазина и дайте ему поинкубироваться не менее 3 минут. Затем добавьте его непосредственно перед приобретением. Его не следует готовить слишком рано, так как период полураспада сигнала составляет примерно 120 минут при комнатной температуре. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать производные фуримазина длительного действия, такие как вивазин и эндуразин. Эти подложки поддерживают стабильный сигнал BRET в течение 48 часов.
2. Показания пластин
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многорежимный считыватель пластин. Отрегулируйте измерение в соответствии с изучаемыми условиями и количеством повторов. Здесь сбор данных разбивается на три показания по 4 столбцам, что соответствует 32 скважинам. Все показания производятся с помощью верхней оптики с прозрачной крышкой, чтобы предотвратить буферное испарение. Перед всеми показаниями отрегулируйте коэффициент усиления. В данном исследовании усиление было зафиксировано на уровне 3600. Можно избежать ручного добавления лиганда с помощью автоматического инжектора или шприцевой системы, которая имеется во многих считывателях планшетов.
   1. Удалите среду из первых 4 столбцов 96-луночного планшета. Промойте каждую лунку 100 μL HBSS и добавьте 80 μL HBSS. Наклейте белую наклейку на нижнюю сторону тарелки. Это улучшает измерения флуоресценции и/или биолюминесценции.
   2. Запись спектров люминесценции G-белка: Вставьте 96-луночный планшет в считыватель планшетов. Запишите излучение cpVenus¹⁷³ с помощью монохроматора 535/30 нм и измерьте люминесцентное излучение в диапазоне от 500 до 600 нм с разрешением 2 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения излучения флуоресценции при возбуждении cpVenus¹⁷³ .
   3. Запись спектров люминесценции G-белка: Зарегистрируйте интенсивность излучения Nluc с помощью монохроматора 450/40 нм и измерьте люминесцентное излучение в диапазоне от 400 нм до 600 нм с разрешением 5 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения отсутствия биолюминесценции перед добавлением субстрата Nluc, фуримазина.
   4. Извлеките планшет из считывателя пластин и добавьте в каждую лунку по 10 мкл ранее приготовленного раствора фуримазина (шаг 3.1.4.) с помощью многоканальной пипетки.
   5. Повторите шаг 3.2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта запись является контролем для обеспечения биолюминесценции при добавлении фуримазина. Непосредственно после этого измерения перейдите к шагу 3.2.6, чтобы предотвратить отклонение сигнала из-за потребления и/или ухудшения качества фуримазина. Изменение сигнала BRET может происходить из-за потребления и/или деградации фуримазина, а регуляторные процессы прекращают ответ, вызванный стимуляцией агонистов. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать ингибиторы GRK (CMPD101) и ингибиторы интернализации (dynasore) или генетически отредактированные клетки, лишенные GRK или арестинов.
   6. Регистрация базального BRET G-белка: Перед добавлением лиганда GPCRs зарегистрируйте интенсивность излучения Nluc и cpVenus¹⁷³ с помощью монохроматора 450/40 нм и 535/30 нм соответственно. Измерьте 3 цикла по 60 с с интервалом измерения 0,30 с (общее время считывания 3 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение времени интервала измерения до 0,90 с обычно значительно улучшает отношение сигнал/шум, но приводит к гораздо более длительному времени считывания. Экспериментатор должен решить, что важнее для их применения: более высокое временное разрешение или улучшенное отношение сигнал/шум.
   7. Извлеките планшет из считывателя планшетов и добавьте по 10 мкл ранее подготовленного диапазона разведения лиганда GPCR (шаг 3.1) соответственно в каждую лунку одной колонки с помощью многоканальной пипетки. Выполните ту же процедуру для 3 других столбцов.
   8. Регистрация BRET, индуцированной лигандом G-белка: Регистрация интенсивности излучения Nluc и cpVenus¹⁷³ с использованием монохроматора 450/40 нм и 535/30 нм соответственно. Отмерьте 16 циклов по 60 с интервалом измерения 0,30 с (общее время считывания 16 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте параметры измерений для измерения скважин в колоннах. Дубликаты считываются с разницей во времени 2,4 с.
   9. Повторите шаг 3.2. для следующих четырех столбцов 2 раза.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте данные о каждом считывании в отдельных файлах электронных таблиц данных.

1. Контрольные показания
   1. Построите график зависимости интенсивности излучения от длины волны.
2. Базальные показания BRET
   1. Для каждой лунки рассчитайте коэффициент BRET трех прочтений. Коэффициент BRET определяется как экцепторная эмиссия/донорная эмиссия.
      
   2. Для каждой лунки рассчитайте среднее значение трех соотношений BRET до добавления лиганда. Эта величина называется базальным отношением BRET до стимуляции лиганда: Ratio_basal.
   3. Чтобы нормализовать предыдущие коэффициенты BRET для всех скважин, для каждого из трех измерений соответственно вычтите значение коэффициента BRET, рассчитанное по контрольным колодцам транспортного средства, из коэффициента BRET в соответствующее время измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируемые данные соответствуют временным точкам до добавления лиганда. Поскольку лунки, в которые добавляется лиганд, известны, контрольные колодцы транспортного средства могут быть идентифицированы соответствующим образом.
3. Показания BRET, индуцированные лигандом G-белка
   1. Для каждой скважины рассчитайте коэффициент BRET для каждого чтения, как описано в разделе 4.2.1. Эти значения называются_{Ratio stim}.
   2. Чтобы количественно оценить изменения, вызванные лигандом, рассчитайте ΔBRET для каждого_{стимула Ratio каждой} лунки в процентах от базального. Для этого используйте_{соответствующий базальный} коэффициент, рассчитанный ранее в разделе 4.2.2.
      
   3. Рассчитайте ΔBRET (%) для нормализации значений ΔBRET для каждой скважины. Для этого вычтите соответствующие значения ΔBRET автомобиля.
   4. Чтобы визуализировать кинетику ΔBRET в таблице данных, добавьте три базальных показания BRET, нормализованные на шаге 4.2.3. напротив соответствующих значений ΔBRET (%), рассчитанных для каждой скважины в разделе 4.3.3.
   5. Постройте график зависимости предыдущих данных от времени чтения, чтобы получить кинетический график.
   6. Когда будет достигнуто плато, возьмите значения ΔBRET (%) в выбранное время и сопоставьте их с концентрацией используемого лиганда, поскольку каждая скважина соответствует своей концентрации лиганда. Получается кривая «доза-реакция».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плато обычно достигается примерно через 5 минут после стимуляции лигандом. В этом протоколе отображаются значения, полученные после 15-минутной стимуляции лигандом. Чтобы сравнить данные разных экспериментов, отрегулируйте время в зависимости от кинетики активации.
   7. Постройте график предыдущих данных в программном обеспечении для анализа и подгоните с помощью сигмоидальной подгонки «доза-реакция» по трем параметрам на основе следующего уравнения:
      
      где X – концентрация используемого лиганда, Y – значения ΔBRET (%), Top и Bottom – плато, а EC₅₀ – концентрация лиганда, необходимая для достижения 50% максимального эффекта. Это позволяет получить E_max и EC₅₀.
   8. Сравните данные из контрольного условия с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Результаты считаются значимыми при p < 0,05.

Рисунок 2: Основные этапы проведения анализа BRET. Обзор трех основных экспериментальных этапов, описанных в этом протоколе (посев клеток, трансфекция клеток и получение сигнала BRET), а также подробное пошаговое руководство по сбору данных. Экспериментальная установка: В 1-й день клетки засеваются в белый 96-луночный планшет с покрытием из ФАПЧ и плоским прозрачным дном при плотности 30 000 клеток/лунку. На 2-й день клетки трансфицируют выбранным сенсором G-белка вместе с исследуемыми плазмидами GPCR или pcDNA3.1. После 24-часовой инкубации активность сенсора G-белка измеряется с помощью биолюминесценции и показаний флуоресценции при добавлении лиганда. Сбор данных: После промывки ячеек HBSS в лунки добавляют 80 мкл HBSS, а флуоресцентное излучение cpVenus¹⁷³ измеряют в диапазоне от 500 нм до 600 нм с помощью монохроматора 535/30 нм (1). Затем измеряют биолюминесценцию Nluc в диапазоне от 400 нм до 600 нм с помощью монохроматора с длиной волны 450/40 нм как до (2), так и после (3) добавления фуримазина. Наконец, сигнал BRET для базальной и лиганд-индуцированной активности G-белка измеряют с помощью монохроматоров с длиной волны 450/40 нм и 535/30 нм, соответственно, в течение 3 минут (3 цикла по 60 с с интервалом измерения 0,30 с) (4) и 16 минут (16 циклов по 60 с с интервалом измерения 0,30 с) (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обобщенная схема постановки и выполнения эксперимента подробно изложена на рисунке 2. Активация белков семейства Gs или Gi/o после лигандной активации двух GPCR оценивалась с помощью биосенсоров G-CASE. Во-первых, был изучен прототип GPCR семейства А, в котором β2-AR временно трансфицируется в клетках HEK 293T. При применении агониста (т.е. изопротеренола) к клеткам HEK wt, экспрессирующим β2-AR вместе с сенсором белка Gs(short)-CASE, наблюдалось зависящее от концентрации снижение сигнала BRET, что указывает на активацию белка Gs (рис. 3B). Значения ΔBRET снижались с концентрацией лиганда до достижения насыщения, при этом плато наблюдалось примерно через 5 минут после стимуляции лиганда. Напротив, клетки HEK wt, трансфицированные пустой плазмидой pcDNA3.1 и белковым сенсором Gs(short)-CASE, продемонстрировали обратное, но низкое и незначительное реагирование на стимуляцию изопротеренолом (рис. 3B). В этом протоколе отображаются значения, полученные после 15 мин стимуляции лигандом. Чтобы обеспечить согласованность результатов и независимость от выбора времени, следует протестировать другие временные точки, убедившись в достижении равновесия. Кроме того, для сравнения результатов различных экспериментов выбор времени должен быть скорректирован в зависимости от кинетики активации каждого эксперимента.

Для построения сигмоидальных кривых "доза-реакция", показанных на рисунке 3C, значения ΔBRET, измеренные через 15 минут после стимуляции (когда плато стабилизируется), были построены в зависимости от различных концентраций лигандов. Наблюдаемый EC50 (9,4 нМ ± 2,1 нМ) находится в диапазоне значений известного рецептору Kd для изопротеренола (13 нМ ± 6 нМ)13,14 (рис. 3C,D). Эти результаты демонстрируют эффективность сенсоров G-CASE в оценке активации G-белка с наблюдаемым ответом, специфически связанным с присутствием β2-AR.

Рисунок 3: Оценка сенсора белка Gs в клетках HEK wt. Кинетические показания ΔBRET при добавлении агониста изопротеренола в клетки HEK wt, трансфицированные сенсором белка Gs и β2-AR (A) или pcDNA3.1 (B). (C) Кривые "доза-реакция", полученные путем подгонки значений ΔBRET (%) после 15-минутной стимуляции лиганда при различных концентрациях лиганда. (D) Сравнение максимальных значений ΔBRET между контрольными pcDNA3.1 и β2-AR трансфицированными клетками, стимулированными изопротеренолом. Статистическая разница с состоянием pcDNA3.1 проверялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (**p < 0,01). Данные показывают среднее значение ± SEM трех независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Во-вторых, биосенсоры были протестированы на клетках HEK CB1, клеточной линии HEK 293T, стабильно экспрессирующей CB1R. Эти клетки были временно трансфицированы с помощью белкового сенсора Gi3-CASE. Стимуляция агонистом CB1R WIN-55,212-2 индуцировала зависящий от концентрации сигнал ΔBRET, указывающий на активацию пути Gi3 (рис. 4A). Напротив, клетки HEK wt, трансфицированные белковым сенсором Gi3-CASE и стимулированные в тех же условиях, не показали никакого ответа, что подтверждает специфичность активации CB1R (рис. 4B). Плато было достигнуто примерно через 5 минут после активации лиганда. Соответствующая кривая «доза-ответ» показала зависящий от концентрации ответ ΔBRET, индуцированный стимуляцией WIN-55,212-2 в клетках HEK-CB1, в то время как в клетках HEK wt такой реакции не наблюдалось (рис. 4C). Наблюдаемый EC50 (112 нМ ± 25 нМ) находится в диапазоне значений известного рецептору EC50 для WIN-55,212-2 (354 нМ ± 62 нМ)15 (рис. 4C, D). Наконец, сравнение значений ΔBRET, полученных через 15 мин после стимуляции агониста 10 мкМ WIN-55,212-2 в клетках HEK CB1 и HEK wt, иллюстрирует CB1R-зависимую активацию сигнального пути Gi3 (рис. 4D).

Рисунок 4: Оценка сенсора белка Gi3 в клетках HEK CB1. Кинетические показания ΔBRET при добавлении агониста WIN-55,212-2 к HEK CB1 (A) или HEK wt клеткам (B). Кривые «доза-реакция», полученные путем подгонки значений ΔBRET (%) после 15 мин стимуляции лиганда к концентрации лиганда (C). Сравнение максимальных значений ΔBRET между контрольными клетками HEK wt и HEK CB1, стимулированными с помощью WIN-55.212-2 (D). Статистическая разница с WT условием HEK проверялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (****p < 0,0001). Данные показывают среднее значение ± SEM пяти независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.