Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Кометный анализ для количественной оценки повреждения ДНК в мутантно-экспрессирующих 32D-клетках FLT3 после воздействия ингибиторов FLT3 I и II типа

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описан эффективный метод количественной оценки разницы в повреждениях ДНК, вызванных ингибиторами I и II типов в мутантных клетках FLT3 с помощью кометного анализа.

Аннотация

FMS-подобная тирозинкиназа 3 (FLT3), рецепторная тирозинкиназа класса III, демонстрирует частоту мутаций около 30% у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и представляет собой важнейшую терапевтическую мишень. В качестве репрезентативных ингибиторов FLT3 типа I и II типа, соответственно, гилтеритиниб и квизартиниб (AC220) клинически используются в лечении ОМЛ с мутантным FLT3.

Гилтеритиниб ингибирует как активированные, так и инактивированные белки FLT3, с дополнительным ингибированием мишеней AXL, чтобы помочь преодолеть резистентность. AC220 ингибирует активированный FLT3. Анализ комет систематически использовался для количественной оценки и сравнения моделей повреждения ДНК, индуцированных ингибиторами FLT3 типа I и типа II в мутантных клетках. Экспериментальные результаты показали, что повреждение ДНК, вызванное AC220, было значительно выше, чем у гилтеритиниба. При сильном повреждении ДНК ингибиторы FLT3 можно комбинировать с ингибиторами восстановления повреждений ДНК для устранения дефектов репарации ДНК. Полученные результаты обеспечивают экспериментальное подтверждение рациональной комбинированной стратегии препаратов, нацеленных на повреждение ДНК.

Введение

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) представляет собой клональное заболевание гемопоэтических стволовых клеток, характеризующееся патологическим распространением недифференцированных миелоидных предшественников, приводящим к подавлению кроветворения и недостаточности костного мозга. Присущая ОМЛ молекулярная гетерогенность создает значительные терапевтические проблемы1. Особое клиническое значение имеют мутации FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3) представляют собой одну из наиболее распространенных генетических изменений при ОМЛ, встречающуюся примерно в 30% случаев, и демонстрируют сильную корреляцию с неблагоприятными клиническимиисходами. Тирозинкиназа рецептора FLT3 активируется на плазматической мембране, опосредуя сигнальные каскады PI3K/AKT и RAS/MAPK, в то время как мутантный вариант FLT3-ITD сохраняется в эндоплазматическом ретикулуме, индуцируя персистирующее фосфорилирование сигнального преобразователя и активатора транскрипции 5 (STAT5). Эти генетические изменения управляют лейкемогенезом через множественные онкогенные механизмы, главным образом через нарушение регуляции передачи сигнала, неконтролируемую пролиферативную передачу сигналови апоптотическую резистентность.

AC220 и гилтеритиниб, как типичные ингибиторы FLT3, ингибируют пролиферацию клеток и индуцируют апоптоз за счет подавления экспрессии FLT3, но с разными механизмами действия. Гилтеритиниб (ингибитор I типа) не только охватывает более широкий спектр мутаций, активирующих FLT3, но и ингибирует тирозинкиназу AXL, которая тесно связана с FLT3. Благодаря двойному ингибированию гилтеритиниб может более полно блокировать рост раковых клеток4. AC220 (ингибитор II типа) оказывает ингибирующее действие посредством конкурентного связывания с активированной конформацией киназы, специфически нацеливаясь на АТФ-связывающий карман с высокой специфичностью. Это ингибирование может привести к остановке клеточного цикла и усилению стресса репликации ДНК.

Гилтеритиниб связан с низким риском развития резистентности и показан для монотерапии при рецидивирующем/рефрактерном FLT3-мутантном ОМЛ. AC220 эффективен и селективен в отношении мутаций FLT3-ITD с хорошими показателями клинического ответа, но неэффективен в отношении мутаций FLT3-TKD и может быть устойчив к мутациям FLT3-TKD из-за вторичных мутаций FLT3-TKD (например, D835 или F691L) к развивающейся резистентности. Эти ингибиторы получили известное место в терапии ОМЛ на основании продемонстрированной клинической эффективности и улучшенных терапевтических показателей6. Тем не менее, клиническое применение этих препаратов осложняется приобретенной резистентностью и нецелевыми эффектами. Длительное применение AC220 в клинике приводит к резистентности из-за мутаций FLT3-TKD, в то время как длительное применение гилтеритиниба может иметь ограничения по сложным мутациям (например, FLT3-ITD в сочетании с TKD), даже если оно не приводит к резистентности из-за мутаций FLT3-TKD 7,8.

Эти два класса ингибиторов FLT3 оказывают двойное терапевтическое действие, косвенно индуцируя репликативный стресс через ингибирование FLT3 и блокаду пролиферативного сигнального пути - RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5 signaling. Блокада пролиферации клеток обычно приводит к остановке клеточного цикла, метаболическим нарушениям (нарушение регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза) и, в конечном счете, к апоптозу 9,10. Этот механизм в конечном итоге генерирует повреждения ДНК, которые активируют компенсаторные адаптации репарации ДНК в резистентных клеточных популяциях. Кометный анализ позволяет количественно сравнивать специфичные для ингибитора профили повреждения ДНК в FLT3-мутантных клетках. Этот экспериментальный подход дает критически важные идеи для разработки рациональных комбинированных терапий, которые используют уязвимости к повреждениям ДНК, тем самым преодолевая приобретенную терапевтическую резистентность.

Современные методологии выявления повреждений ДНК включают иммуногистохимический анализ, электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование нового поколения (NGS), каждая из которых демонстрирует высокую аналитическую чувствительность и специфичность11. Однако эти подходы ограничены значительными финансовыми требованиями, длительной продолжительностью обработки и жесткими экспериментальными условиями. Это подчеркивает необходимость принятия стратегий обнаружения, которые сочетают аналитическую точность с простотой эксплуатации.

Анализ комет широко используется в экологической токсикологии и оценке генотоксичности благодаря его превосходной чувствительности, технической доступности, количественной оценке визуализированных повреждений ДНК и широкой применимости в биологических системах12,13. Были разработаны три основных методологических варианта: щелочной анализ комет для обнаружения одноцепочечного/двухцепочечного разрыва, анализ нейтральной кометы для анализа двухцепочечного разрыва и ферментно-модифицированный анализ комет для идентификации специфических повреждений ДНК. 14

Методологический принцип включает в себя: (1) индукцию разрыва нити ДНК посредством экспериментального лечения; (2) Опосредованное лизисом буферное растворение клеточных и ядерных мембран, позволяющее цитоплазматическим/ядерным белкам и РНК диффундировать в буфер для электрофореза, в то время как высокомолекулярная ДНК остается иммобилизованной в агарозном матриксе; (3) Щелочная денатурация (pH > 13), индуцирующая раскручивание ДНК и высвобождение поврежденных фрагментов ДНК; (4) Электрофоретическая анодная миграция фрагментированной ДНК, вызванная полем, создающая характерную морфологию кометы, при этом неповрежденная ДНК сохраняет сферическую нуклеоидную структуру15,16. Количественное определение повреждений ДНК достигается с помощью компьютерного анализа процентного соотношения хвостовой ДНК (TDP), что обеспечивает точное измерение генотоксического воздействия при разрешении одной клетки17.

В этом исследовании использовалась систематическая экспериментальная структура для сравнения дифференциальных генотоксических эффектов гилтеритиниба и AC220 в валидированных FLT3-мутантных клетках 32D. План эксперимента состоял из двух основных компонентов: (i) создание модели повреждения ДНК, специфичной для мутации FLT3, и (ii) количественная оценка повреждения ДНК, вызванного лекарственными препаратами, с помощью методологии анализа щелочных комет. Клеточную линию 32D с мутацией FLT3 поддерживали в стандартных условиях in vitro до воздействия серийно разбавленных ингибиторов FLT3. Клеточную жизнеспособность оценивали с помощью анализов CCK-8 с последующим расчетом значений полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) с помощью нелинейного регрессионного анализа. В качестве порога индукции повреждения ДНК было выбрано пятикратное значение IC50 . Обработанные лекарственными препаратами клетки собирали и помещали в агарозу с низкой температурой плавления на предметных стеклах для последующего анализа. Электрофоретическое разделение проводили при напряжении 24 В (~0,74 В/см) и 300 мА в течение 30 мин в щелочном буфере, в ходе которого фрагментированная ДНК анально мигрировала, образуя характерную морфологию кометы, в то время как интактная ДНК сохраняла сферическую нуклеоидную конфигурацию. Количественная оценка повреждений ДНК была достигнута с помощью компьютеризированного анализа изображений, программного обеспечения для анализа комет (CASP), измеряющего момент хвоста, при этом увеличенные значения момента оливкового хвоста напрямую коррелировали со степенью фрагментации ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Построение модели повреждения ДНК в 32D-клетках с мутациями FLT3-ITD 18

  1. Восстановление клеток
    1. С помощью щипцов можно быстро перенести криоконсервированные мутантные 32D-клетки FLT3-ITD (хранящиеся при -80 °C). Извлеките криовиалы с помощью щипцов и немедленно погрузите их в водяную баню с регулируемой температурой (37 °C ± 0,5 °C) ровно на 60 секунд для завершения контролируемого размораживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время размораживания периодически встряхивайте криовиалы на водяной бане, чтобы обеспечить равномерный нагрев.
    2. Центрифугируйте криоконсервированные образцы при 150 × г в течение 5 мин при температуре 25 °C ± 1 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью стерильных серологических пипеток, сохраняя при этом клеточную гранулу.
    3. Добавьте 1 мл полной питательной среды (RPMI 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки + 1% пенициллин/стрептомицин) в пробирку для криоконсервации. Выполните щадящую растирание в течение 10 последовательных циклов пипетирования (объем 1 мл) для обеспечения полной ресуспензии. Перенесите клеточную суспензию в 100-миллиметровую чашку для клеточных культур и добавьте 7 мл готовой среды до конечного объема 8 мл.
    4. Осторожно взбалтывайте сосуд для культивирования пятью горизонтальными и пятью вращательными движениями. Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37,0 °C ± 0,2 °C с 5%CO2 и 95% влажности. Инкубировать в течение 24 ч перед экспериментальной обработкой.
  2. Оценка жизнеспособности клеток
    1. Для эксперимента выберите мутантные 32D-клетки FLT3-ITD в логарифмической фазе роста с хорошим клеточным статусом.
      Примечание: Клетки в логарифмической фазе роста обычно имеют короткий цикл деления и высокую частоту деления.
      1. Наблюдайте за морфологией и состоянием роста 32D-клеток с мутацией FLT3-ITD с помощью электронного микроскопа. Убедитесь, что критерии пороговых значений клеточной пролиферации соблюдены: ищите клетки che, которые имеют форму одной глобулы с гладкими краями, равномерной дисперсией, небольшим количеством агрегатов, одинаковым размером клеток, неповрежденной целостностью плазматической мембраны и клеточным мусором < 5%.
    2. Используйте клеточный счетчик для определения концентрации клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте клеточные суспензии (10 последовательных циклов пипетирования с использованием 1 мл стерильных наконечников при максимальной скорости пипетки 50%).
    3. Стандартизируйте клеточную суспензию до 2,0 ×10 5 клеток/мл в полной питательной среде с использованием итерационного разведения. С помощью пипетки диспенсируйте 50 мкл аликвот в центральные лунки (B2-G7) 96-луночного планшета с плоским дном. Заполните периферийные лунки (A1-H12) 100 мкл стерильного PBS для поддержания влажности и минимизации эффектов испарения по краям.
    4. Приготовление среды, содержащей ингибитор FLT3: Выберите девять лунок в 12-луночном планшете для культивирования клеток и пометьте их в соответствии с лестницей концентраций ингибитора FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 и 1000 нМ). Добавьте 400 мкл полной среды в лунки с маркировкой 10,0 мкМ и 200 мкл полной среды в остальные лунки.
      1. Разведение гилтеритиниба: Добавьте 4 мкл 100 мкМ реагента Гилтеритиниба (Гилтеритиниб в диметилсульфоксиде) в каждую из лунок с маркировкой 1000 нМ с помощью пистолета-пипетки и тщательно перемешайте раствор. Пипетку 200 мкл 1000 нМ гилтеритиниба в лунки с маркировкой 500 нМ и перемешать; затем пипетку 200 мкл 500 нМ гилтеритиниба в лунки с маркировкой 250 нМ и перемешать. Каждый раз возьмите 200 мкл предыдущего разбавления в следующую лунку и перемешайте до достижения желаемой концентрации.
      2. Разведение AC220: Добавьте 4 мкл 100 мкМ реагента AC220 (AC220 в диметилсульфоксиде) в каждую из лунок с маркировкой 1000 нМ с помощью дозатора. Выполните шаг 1.2.4.1 для других скважин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исходный раствор ингибитора FLT3 в пипетке полностью перенесен в лунки, чтобы избежать остатков раствора. Убедитесь, что раствор хорошо перемешан, прежде чем приступать к разбавлению.
    5. Инкубация: Дозируйте среду, содержащую ингибитор FLT3, в специальные лунки (50 мкл/лунка) с помощью пипетки. Выдерживайте 96-луночный планшет в физиологических условиях культивирования (37,0 °C ± 0,2 °C, 5%CO2, 95% влажности) в течение ровно 72 ч ± 15 мин.
    6. Аликвоту 10 мкл реагента CCK-8 во все опытные и холостые контрольные лунки с помощью пипетки. Защитите планшет от света и инкубируйте его в нормоксических условиях (37 °C, 5%CO2) в течение 2,0 ч ± 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозируйте реагент с низкой скоростью дозатора с глубиной погружения наконечника 2 мм, чтобы свести к минимуму образование пузырьков. Избегайте образования пузырьков воздуха во время добавления пробы, чтобы предотвратить искажение показаний наружного диаметра.
    7. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора и измерьте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов. Запишите результаты.
    8. Рассчитайте % торможения по формуле расчета IC50 :
      Торможение (%) = figure-protocol-1 × 100%
      Экспериментальной лункой препарата обозначены клеточные лунки, обработанные препаратом. Клеточным контрольным колодцем обозначаются клеточные лунки, которые не были обработаны препаратом. Глухие контрольные лунки указывают на среду только без ячеек.
    9. Анализируйте нормализованные данные «доза-реакция» с помощью нелинейной регрессии с использованием четырехпараметрической логистической модели. Нажмите кнопку «Аппроксимация кривой» для аппроксимации кривой. Выведите полумаксимальную ингибиторную концентрацию (IC50) из сходимости модели (R2 > 0,98, остаточная сумма квадратов < 0,15) и рассчитайте 95% доверительные интервалы с помощью 1000-итеральной бутстреп-редискретизации.
  3. Эксперимент по повреждению ДНК 32D-клеток с мутацией FLT3-ITD, индуцированной ингибитором FLT3
    1. Выберите мутантные 32D-клетки FLT3-ITD, демонстрирующие скачок роста (время удвоения популяции < 24 ч) для оценки повреждений ДНК.
    2. Подсчитайте ячейки (подробнее см. шаг 1.2.2).
    3. Посев клеток: Отрегулируйте плотность клеточной суспензии до 1 ×10 6 клеток на чашку, используя чашку диаметром 6 см и 4 мл клеточной суспензии на чашку.
    4. Для каждой концентрации ингибитора готовят три реплики: 55 нМ гилтеритиниба: 4 мл среды + 2,2 мкл 100 мкМ запаса, 0,15 нМ AC220: 4 мл среды + 6 мкл 100 нМ запаса. Вихревой перемешивают растворы и уравновешивают их при 37 °С в течение 15 мин; Осторожно встряхните трубки, чтобы обеспечить достаточное перемешивание. Аспирируйте исходную среду и замените ее 4 мл на чашку свежеприготовленной среды, содержащей ингибиторы, с помощью стерильных серологических пипеток.
    5. Обработанные клетки инкубируют в физиологических условиях (37 °C, 5%CO2, 95% влажности) в течение определенных интервалов времени (0, 2, 4, 6 ч). Мгновенный контроль нулевого времени обработки для базовой оценки повреждений ДНК.
    6. Эксклюзионный тест на трипановый синий
      1. Центрифугируйте собранные клетки при 150 × г в течение 1 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки 1 мл питательной среды.
      2. Пипетку 100 мкл ресуспендированных клеток в пластиковую центрифужную пробирку, добавьте 100 мкл трипанового синего красителя (2x), аккуратно перемешайте и окрашивайте в течение 3 минут.
      3. Подсчитайте ячейки (подробнее см. шаг 1.2.2).
      4. Рассчитать жизнеспособность клеток можно следующим образом:
        %Выживаемость клеток = figure-protocol-2 × 100%
        Примечание: Для анализа комет были обработаны только образцы с жизнеспособностью ≥90%.

2. Подготовка реагентов и образцов клеток

  1. Уравновесить раствор лизиса (содержащий 2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, рН 10, 1% Тритон Х-100, 10% ДМСО) при 4 °C ± 0,5 °C в течение 30 мин в холодильнике.
  2. Растопите легкоплавкую агарозу (LMA) при температуре 95 °C в течение 15 минут, затем держите ее на водяной бане при температуре 37 °C, чтобы предотвратить застывание.
  3. Приготовьте буфер для щелочного электрофореза (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, pH >13), взвесив 12 г NaOH с помощью электронных весов, пипетируя 2 мл 500 мМ раствора ЭДТА, а затем добавив ddH2O для получения до 1 л буфера.
  4. Забор клеток
    1. Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют клеточные суспензии при 800 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной фильтрации.
      1. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды с помощью наконечников пипеток с широким отверстием объемом 1 мл, а затем проведите 10 вертикальных инверсий.
      2. Посчитайте ячейки, как в шаге 1.2.
      3. Центрифугируйте клеточную суспензию в центрифужной пробирке объемом 15 мл при давлении 150 × г в течение 5 мин, чтобы удалить всю среду. Ресуспендируйте промытые клетки в PBS без кальция до ~5,0 × 105 клеток/мл.

3. Процедура пробирного анализа комет

  1. Заранее подготовьте предметные стекла для анализа комет и образцы клеток. Приготовьте с помощью пипетки смесь агарозы LMA и клеточной суспензии в соотношении 10:1 (v/v) (5 × 105 клеток/мл) в пробирках объемом 1,5 мл и осторожно перемешайте. Распределите 55 мкл аликвоты смеси агарозных клеток на предметные стекла кометы с помощью пипетки, расположенной под углом 45°, сохраняя расстояние 2 мм от поверхности предметного стекла. Поместите предметные стекла, покрытые смесью, при температуре 4 °C на 30 минут, чтобы избежать попадания света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время добавления LMA и клеточной смеси к предметным стеклам для анализа комет, медленно и равномерно дозируйте суспензию, чтобы предотвратить образование пузырьков и обеспечить равномерное распределение геля.
  2. Погрузите затвердевшие предметные стекла в предварительно охлажденный раствор для лизиса (содержащий 2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, pH 10, 1% Triton X-100, 10% ДМСО) и выполните лизис в течение ≥1 ч при 4 °C в светозащищенных условиях.
  3. После лизиса извлеките предметное стекло из лизата и с помощью пистолета-пипетки всосайте как можно больше жидкости вокруг лопатки. Затем поместите предметное стекло в буфер для щелочного электрофореза (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, pH >13) и предварительно уравновесьте в течение 1 часа при 4 °C, стараясь избегать света.
  4. Электрофорез: Поместите предметные стекла в камеру для электрофореза и добавьте достаточное количество щелочного раствора для электрофореза, чтобы погрузить предметные стекла. Проводите электрофорез при напряжении 24 В (эквивалентно 0,74 В/см) постоянным током (300 мА) в течение 30 мин с использованием предварительно уравновешенного буфера (4 °C) для минимизации повреждения ДНК.
  5. Нейтрализация: После электрофореза с помощью пистолета-пипетки отсасывайте раствор щелочного электрофореза из предметного стекла, погрузите предметные стекла на 2 x 5 минут в dH2O, а затем погрузите их в 70% этанол на 5 минут. Высушите предметные стекла в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 15 минут.
  6. Окрашивание: Нанесите 100 мкл аликвоты 1x YeaRed нуклеиновой кислоты на лунку и инкубируйте в течение 30 минут при температуре окружающей среды в защищенных от света условиях. Удалите излишки пятна с помощью осторожного водного полоскания с последующей термической сушкой при 37 °C.
  7. Визуализация: Выполнение флуоресцентной визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 4-кратным объективом, с получением цифрового изображения в стандартизированных условиях экспозиции.

4. Обработка данных

  1. Выполните количественный анализ изображений для определения стандартных параметров кометы, включая ДНК хвоста (%), момент оливкового хвоста и длину хвоста (мкм).
    1. Откройте интерфейс программного обеспечения (рисунок 5).
    2. Импортируйте изображение в программу, нажмите «Файл», затем нажмите «Выбрать файл », чтобы импортировать изображение, которое вы хотите проанализировать, в программу. Далее, удерживая нажатой кнопку мыши, перетаскивайте до тех пор, пока не появится синее поле. Перетащите синюю рамку, чтобы убедиться, что ячейка, которую вы хотите проанализировать, заключена в поле. Опция «Настроить» на рисунке может быть использована для настройки положения кадра, чтобы включить в него всю ячейку (рис. 5).
    3. Перед началом анализа нажмите кнопку Начать, а затем нажмите кнопку Анализировать. Результаты анализа отдельных клеток будут отображаться справа в разделе «Профили». Проанализировав каждую ячейку, нажмите кнопку Сохранить. Параметры, которые могут быть обнаружены, отображаются в правой части «Профилей», а числовые значения различных параметров отображаются в нижней части. Наконец, нажмите «Файл» | Экспорт результатов. Полученные результаты включают HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment и OliveTailMoment.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кометный анализ систематически использовался для количественной оценки дифференциальных профилей повреждения ДНК, индуцированных гилтеритинибом и AC220 в FLT3-мутантных клеточных линиях. Анализ показал, что разница в повреждении ДНК между популяциями клеток, не обработанных гилтеритинибом и AC220, не была статистически значимой (P > 0,05). Дозозависимое увеличение значений ДНК хвоста (%) и хвоста оливкового момента (ОМТ) достигло статистической значимости (P < 0,05) после воздействия в течение 2-6 часов. ОМТ предст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ комет представляет собой значительный шаг вперед в методологиях оценки генотоксичности. Этот метод имеет явные преимущества по сравнению с традиционными подходами благодаря своей технической доступности, разрешению для одной клетки и прямой визуализации картин повреждений с помощью профилей электрофоретической миграции. При разработке методов лечения ОМЛ кометный анализ позволяет проводить систематическую оценку генотоксических профилей агентов-кандидатов на этапах валидации мишен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Инновационной исследовательской группой по науке и технологиям Высшего учебного заведения Цзянсу (2021 г.), Программой Исследовательского центра инженерных технологий Профессионального колледжа Цзянсу (2023 г.), Программой медицинских наук и технологий провинции Чжэцзян (2025KY1861), Ключевым фондом естественных наук Высших учебных заведений Цзянсу Китая (грант No 24KJA310008), Программами Профессионального медицинского колледжа Сучжоу (грант No. SZWZYTD202201, szwzy202406) и проект Государственной ключевой лаборатории радиационной медицины и защиты Университета Сучжоу (GZK12023013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 м ЭДТАБейотимСТ066
1x Краситель для нуклеиновых кислот YeaRedЙезен10202ЧС
32D ЯЧЕЙКАCobioerCBP60995
АС220ТаргетМолТ2066
Набор для подсчета ячеек-8ДодзиндоСК04
Счетная пластина для ячеекЦюцзинХБ-К-25
CO2 инкубаторТермо51032872
Проект программного обеспечения для пробирного анализа комет (CASP)
Набор для анализа кометы Тревиген4250-050-К
Цитация 5БиоТек16280004
ФБССКОВОРОДАСТ30-3302
ГилтеритинибТаргетМолТ4409
ГрафПад Призма 9.0
высокоскоростная центрифугаТермо  9АК2861
Пипетки L-1000XLS+Райнин17014382
Пипетки L-20XLS+Райнин17014392
бак для жидкого азотаМвекриогеYDS-175-216
Микропланшетный фотометр Multiskan FCТермо1410101
Na2OHДАМАО1588
ПБССоларбиоП1020
Пенициллин-стрептомицин раствор, 100xБейотимС0222
RPMI 1640 среднийGibcoC22400500BT
Тринокулярный микроскоп живых клетокМотик1.1001Э+12
Сверхнизкотемпературная морозильная камераХейрV118574

Ссылки

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FLT3III
Кометный анализ для количественной оценки повреждения ДНК в мутантно-экспрессирующих 32D-клетках FLT3 после воздействия ингибиторов FLT3 I и II типа
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.