Флуоресцентный протокол предварительного скрининга ингибиторов синтеза белка из природных источников

Summary

Этот протокол вводит методологию флюорометрического скрининга, оптимизированную для выявления ингибиторов естественного продукта/малых молекул синтеза белка. Его практичность делает его подходящим как для обучения бакалавриате методам открытия лекарств, так и для внедрения в медицинских химических кампаниях.

Abstract

Натуральные продукты представляют собой богатый источник терапевтических соединений, применяемых при различных заболеваниях, особенно при раке. Используя эти биомолекулы в качестве структурных шаблонов для открытия лекарств, исследователи добились как более быстрых сроков разработки, так и повышения биологической эффективности по сравнению с полностью синтетическими соединениями. Путь синтеза белка стал привлекательной целью для натуральных продуктов, особенно учитывая его участие в трудно лечимых видах рака. Мощный ингибитор синтеза белков циклогексимид, полученный из Streptomyces griseus, демонстрирует потенциал природных соединений в этой области. По мере того как эти производные натуральных продуктов превращаются в похожие на лекарства молекулы, подтверждение их ингибирующей активности синтеза белка остаётся важным этапом валидации. Основная цель — предоставить дружественный для студентов протокол для быстрой оценки активности ингибирования соединений. Протокол использует флуоресцентный субстрат и передовые методы флуоресцентной микроскопии для систематического обнаружения и измерения ингибирующих возможностей этих натуральных продуктов. В исследовании изучались соединения, полученные из двух видов растений: Pinus sylvestris и Psoralea corylifolia. Используя циклогексимид в качестве эталонного ингибитора, оба натуральных продукта демонстрировали разные уровни подавления синтеза белка.

Introduction

Синтез белка включает в себя сильно регулируемые процессы: транскрипцию и трансляцию. Во время транскрипции копируются последовательности генов ДНК, образуя мессенджерную РНК (мРНК). Фермент РНК-полимераза работает для разделения двойной спирали ДНК и использует одну цепь как ориентир для построения соответствующей молекулы мРНК. После полного формирования мРНК она перемещается из ядра в цитоплазму для трансляции. Трансляция происходит в рибосоме, где мРНК используется как шаблон для формирования аминокислот в полипептидную цепь. Эта полипептидная цепь, выходя из выходного туннеля рибосомы, сворачивается в функциональный белок. Транскрипция в первую очередь регулируется транскрипционными факторами, модификациями хроматина и регуляторными РНК, тогда как трансляция регулируется факторами инициации, сигнальными путями и механизмами стабильности РНК. Эти регуляторные системы позволяют клеткам поддерживать клеточные функции и эффективно реагировать на стресс или^{повреждения. 1}.

Подавляющее большинство человеческих видов рака — примерно 85% — проявляются в виде солидных^{опухолей 2}. Хотя эти опухоли могут сильно различаться по своим особенностям и поведению, они, как правило, обладают определёнными общими физиологическими чертами и закономерностями, такими как повышенный синтез белка независимо от их этиологии или анатомического^{положения 3}. Раковые клетки нарушают синтез белков, захватывая трансляционные механизмы для поддержки своих высоких энергетических потребностей и неконтролируемого роста. Это перепрограммирование является результатом дисрегуляции почти всех основных онкогенных сигнальных путей, способствуя выживанию клеток, размножению и метастазам, одновременно подавляя пути клеточной^{гибели 4}. В опухолевых клетках механизм производства рибосом работает на пределе, что позволяет увеличить производство белка и быстрое деление клеток. Поскольку этот усиленный синтез белка критически важен для выживаемости при раке, методы лечения, направленные и блокирующие этот процесс, выглядят перспективно как потенциальные терапии⁵. Поэтому исследования, сосредоточенные на специфических для рака факторах трансляции, уникальных составах рибосом или изменённых сигнальных путях, регулирующих синтез белков, могут привести к более целевым ингибиторам с улучшенными терапевтическими окнами.

Поскольку натуральные продукты (НП) известны своим широким спектром биологической активности, разработка селективных ингибиторов синтеза белка для лечения рака с использованием их каркасов является перспективным^{подходом 6,7}. NP могут воздействовать на различные компоненты механизма синтеза белков — от связывания рибосом до помех с факторами инициации или процессов удлинения, что делает их незаменимыми отправными точками для разработки лекарств для ингибиторов синтеза белка в твердых^{опухолях 6}. Возможность быстрого скрининга соединений на желаемую активность служит важной точкой входа для платформ для поиска лекарств, стремящихся эффективно выявлять NP-совпадения. Обычно высокопроизводительный скрининг соединений использует флуоресцентные анализы для быстрого сужения выбора молекул^{свинца-кандидатов 8}.

Учёные по всему миру опираются на флуоресцентные методы как на важные инструменты для анализа биологических систем. Эти подходы широко применяются для изучения клеточных процессов, позволяя исследователям отслеживать биомолекулярные взаимодействия в реальном^{времени 9}. В сочетании с биоортогональными клик-химическими реакциями эти методы позволяют точно визуализировать синтез^{белка 10}. Представленный анализ синтеза флуоресцентного белка — это нерадиоактивный метод оценки синтеза белков, использующий O-пропаргил-пуромицин (OPP), клеточно-проницаемый аналог пуромицина, содержащий алкин. После клеточного лечения ОПП инкорпорируется на C-конце удлиняющихся полипептидных цепей, вызывая прерывание трансляции. Эти алкино-маркированные усечённые белки затем обнаруживают с помощью медно-катализированной щелк-химии в сочетании с 5 FAM-азидом.

Этот флюорометрический анализ является ценным исследовательским инструментом и доступным методом химической биологии для подготовки студентов бакалавриата. Обеспечивая доступный и эффективный протокол с минимальной обработкой данных, он предоставляет студентам практический опыт современных методов обнаружения лекарств и ускоряет процесс их обнаружения. По мере роста спроса на новые ингибиторы синтеза белка этот подход предоставляет студентам значимые исследовательские возможности и способствует развитию терапии рака.

Protocol

1. Подготовка реагента из комплекта

ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно хорошо перемешивайте, закрутите и держите все реагенты на льду до использования.

1. Организуйте и получите комплект для ингибирования синтеза белка, буфер PBS, среду для клеточной культуры, обработанные пластины, конические стерильные полипропиленовые центрифугные трубки объёмом 15 мл, центрифугные трубки объемом 2 мл, пипетки p10, p20, p200 и p1000, а также соответствующие наконечники.
2. Подготовьте буфер для стирки.
   1. Разморозьте буфер для стирки 10x при 37 °C, сложив флакон в руке. Используйте тепло тела в руках для размораживания и часто проверяйте, завершено ли размораживание.
   2. Разведите буферные запасы 10 раз в промывке в соотношении 1:10 в деионизированной воде в центрифугной трубке. Смешивайте с помощью инверсии или подвешивания с помощью пипета вверх и вниз. Храните на льду до использования.
3. Растворить фиксационный раствор при комнатной температуре. Храните на льду до использования.
4. Подготовьте буфер проницаемости.
   1. Разморозьте буфер проницаемости 10x при 37 °C, удерживая флакон в руке. Используйте тепло тела в руках для размораживания и часто проверяйте, завершено ли размораживание.
   2. Разведите 10x стандарт в соотношении 1:10 в деионизированной воде в центрифугной трубке. Смешивайте компоненты с помощью инверсии или подвески с помощью пипета вверх и вниз. Храните на льду до использования.
5. Разморозить 400x белковую метку, 100x флуоресцентный азид, 100x циклогексимид, ДНК-окрашивку и 20x восстанавливает при комнатной температуре. Держите на льду в тёмной обстановке во время использования. Накройте красители фольгой или храните их в холодильнике при температуре 2 °C, когда они не используются.

2. Маркировка контролей и экспериментальных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан с использованием стабильных клеток EPITHELIAL рака молочной железы MDA-MB-231. Можно использовать любые клеточные линии. Все перечисленные ниже этапы используют пластину с 96 лунками, а все объёмы и концентрации рассчитываются для двух тестовых соединений и двух контрольных веществ с рабочим объёмом 100 мкл.

1. Культивирование клеток млекопитающих
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки следует выводить до достижения слияния 80-90%, чтобы поддерживать здоровый, экспоненциальный рост и предотвратить ингибирование или дифференцировку контактов.
2. Разморозить флакон с криоконсервированными клетками до комнатной температуры, затем разбавить соответствующей средой.
3. Центрифугуйте суспензию, чтобы пеллетировать клетки и аспирировать супернатант. Суспензируйте гранулу в свежей среде и перенесите в новую колбу с нужной плотностью клетки.
4. Когда клетки срастаются на 80%, удалите среду и аспирируете старое образование из колбы. Затем промывайте клетки стерильным PBS, чтобы удалить остаточную сыворотку, которая подавляет трипсин. Добавьте раствор трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный слой, и инкубировать в течение 3-5 минут или до тех пор, пока клетки не отсоединятся при 37 °C.
5. Добавьте полную среду с сывороткой для инактивации трипсина, затем перенесите клеточную суспензию в трубку, аккуратно перемешайте и посчитайте клетки.
6. Семенные клетки в скрининговых пластинах разбавляют клетки при соответствующем соотношении разделения (например, 1:3 или 1:5) в свежие колбы с новой средой и инкубируют (обычно 37 °C, 5%_CO2) для получения желаемой концентрации клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь эксперименте клеточная линия была покрыта при 2 × 10⁴ на каждую яме (пластина с 96 лунками) и инкубировала при 37 °C в течение 12 часов.

3. Добавление сложных веществ

1. Приготовьте мастер-микс A.
   1. Маркируйте центрифугную трубку как «A». Пипетта 598,5 мкл культурной среды и 1,5 мкл белковой метки в «A». Восстановите суспензию смеси для обеспечения однородности, проводя пипеток вверх и вниз.
2. Приготовьте мастер-микс B.
   1. Маркуйте центрифугную трубку как «B». Пипетта — 1,5 мкл белковой метки, 6,6 мкл циклогексимида и 591,9 мкл культурной среды в «B». Восстановите суспензию смеси для обеспечения однородности, проводя пипеток вверх и вниз.
3. Обрабатывайте клетки желательными соединениями (рисунок 1), положительными и отрицательными контролями.
   1. Извлеките клетки из инкубатора и удалите среду роста с помощью аспирации. Наклоните пластину и аспирируйте сбоку колодца, а не в центре, чтобы предотвратить возмущение клеток.
   2. Пипетта — 1 мкл тестового состава в скважину и 1 мкл тестового состава (0,1% по в/в DMSO) в скважину. Для дублирующих исследований добавьте каждый образец во вторую яму и повторите этот процесс. Добавьте в эти скважины 99 мкл мастер-смеси A. Аккуратно вводите пипетку под углом в боковую сторону колодца, чтобы предотвратить кинетическое нарушение клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация DMSO для скрининга соединений зависит от типа клетки и анализа, но общие рекомендации следующие: 0,1-0,5% DMSO — обычно безопасно для большинства клеточных тестов с минимальной токсичностью, и 1% — обычно используемый DMSO, максимальный и допустимый для многих типов клеток в краткосрочных анализах.
   3. Пипетта 100 мкл мастер-микса B в две колодцы. Пипетка под углом в сторону колодца, чтобы предотвратить нарушение клеток.
   4. Аккуратно постучите по пластине, чтобы добиться интеграции нужных компонентов в элементы. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 0,5–2 часа.

4. Завершение эксперимента и промывка клеток

1. Удалите посевную среду с помощью аспирации. Наклоните пластину и аспирируйте сбоку колодца, а не в центре, чтобы предотвратить возмущение клеток.
2. Добавьте 100 мкл буфера PBS в каждую скважину и центрифугайте пластину при 900 × г в течение 5 минут.
3. Удалите буфер PBS с помощью аспирации.

5. Фиксация и проницаемость

1. Добавьте 100 мкл фиксирующего раствора в каждую скважину. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 15 минут в тёмной среде.
2. Удалите фиксационный раствор с помощью аспирации. Наклоните пластину и аспирируйте сбоку колодца, а не в центре.
3. Промыйте ячейки с помощью 100 мкл буфера и удалите буфер аспирацией. Повторяйте этот шаг дважды.
4. Добавьте 100 мкл буфера проницаемости в каждую скважину и инкубуйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
5. Удалите буфер проницаемости с помощью аспирации. Наклоните пластину и аспирируйте сбоку колодца, а не в центре.

6. Реакция белка и окрашивание

1. Приготовьте смесь реакционного коктейля мастера.
   1. Добавьте 651 мкл буфера PBS, 7,0 мкл 100x медного реагента, 7 мкл флуоресцентного азида и, наконец, 35 мкл восстанавлющего агента в центрифугную трубку. Восторгите эту смесь для обеспечения однородности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте точно такому порядку при добавлении реагентов. Используйте в течение 15 минут после подготовки.
2. Добавьте по 100 мкл реакционного коктейля в каждую яму. Инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной температуре в тёмной среде, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
3. Центрифугные клетки при 900 × г в течение 5 минут. Сбалансируйте центрифугу, добавляя пустые пластины для равномерного распределения веса. Удалите смесь с помощью аспирации.
4. Промыйте ячейки с помощью 100 мкл буфера и удалите буфер аспирацией. Повторяйте этот шаг дважды.

7. Окрашивание ДНК

1. Приготовьте разбавление общего количества окрашивания ДНК в 1x и добавьте по 100 мкл в каждую яму. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 минут в тёмной среде, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
2. Центрифугуйте пластину при 900 × г в течение 5 минут. Сбалансируйте центрифугу, добавляя пустые пластины для равномерного распределения веса. Удалите смесь с помощью аспирации.
3. Промыйте ячейки с помощью 100 мкл буфера и удалите буфер аспирацией. Повторяйте этот шаг дважды.
4. Суспензируйте клетки с 100 мкл охлаждённого буфера PBS, чтобы подготовить их к визуализации.

8. Визуализация

1. Вставьте пластину в считыватель пластин.
2. Установить увеличение на 20x.
3. Проанализировать окрашивание ядра с помощью канала GFP 469/525 нм. Используйте автобинирование и автофокус для улучшения результатов изображения.
4. Проанализировать активный синтез белка с помощью канала Texas Red 586/647 нм. Используйте автобинирование и автофокус для улучшения результатов изображения.

Results

В этом анализе флуоресценция использовалась для визуализации и количественной оценки способности различных натуральных продуктов подавлять синтез белка. Циклогексимид (CHX) — известный ингибитор синтеза белков, режим действия которого включает вмешательство в процесс транслокации во время^{удлинения.} Для этого исследования живые клетки были обнаружены с помощью зелёного флуоресцентного ядерного красителя. OPP — это производное пуромицина, ковалентно связывающееся с ...

Discussion

Этот протокол предусматривает методологию флуорометрического скрининга для тестирования натуральных продуктов и малых молекул с целью оценки их способности ингибировать синтез белка. Простота этого протокола позволяет студентам-исследователям правильно его внедрять, что позволяет им вносить существенный вклад в научные знания. Протокол требует базового понимания биологических методов и методов, при этом этапы требуют тщательного выполнения для обеспечения точных и надёжных результатов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Многорежимный считыватель Agilent Biotek Cytation 1 Cell Imaging	Agilent	BTCYT1V
Соединение 1 (дегидроабиетиламин, CAS 1446-61-3)	Энамин	EN300-7409771
Комплекс 2 (Бакучиол, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific	75004271
Ibidi Gmbh-slide пластина с 96 скважинами	Ибиди	80826
Клеточные линии MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
pH солёного раствора с буфером фосфатов 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Набор для анализа синтеза белка (зелёный)	Abcam	Ab239725