Методическая статья

Расщепленный гибридизационный зонд с использованием флуоресцентного светящегося аптамера ДНК в качестве сигнального репортера для анализа последовательно-специфичных нуклеиновых кислот

DOI:

10.3791/68483

⸱

8 июля 2025 г.

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается конструкция зондов раздельной гибридизации с использованием флуоресцентного светящегося аптамера DAP-10-42 в качестве сигнального репортера и их применение для обнаружения нуклеиновых кислот и дифференциации мишеней с однонуклеотидными заменами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентные светящиеся аптамеры (FLAPs) на основе ДНК являются перспективными для биоаналитических анализов, поскольку они обеспечивают недорогое считывание флуоресцентного сигнала без необходимости маркировки репортеров сигналов нуклеиновых кислот флуорофорами и/или гасителями, в отличие от обычных гибридизационных зондов, используемых для мгновенного обнаружения нуклеиновых кислот. Вместо этого FLAPs нековалентно связывают лиганды красителей, которые проявляют по своей природе низкую флуоресценцию в водных растворах, но становятся сильно излучающими при связывании FLAP. Этот протокол описывает алгоритм разработки расщепленных светящихся аптамерных датчиков (SLAS) с использованием DAP-10-42, самого эффективного ДНК-FLAP, о котором сообщалось до сих пор. При использовании последовательностей нуклеиновых кислот, комплементарных интересующей нуклеиновой кислоте-мишени, SLAS является многообещающим инструментом для анализа нуклеиновых кислот, позволяющим обнаруживать последовательно-специфические мишени нуклеиновых кислот с селективностью до одного нуклеотида для анализа однонуклеотидных замен (SNS). Преимущество SLAS заключается в безметочном считывании флуоресцентного сигнала, которое можно измерить с помощью обычного флуоресцентного спектрофотометра на основе кюветы, портативного флуориметра или визуально наблюдать при возбуждении с помощью ручного источника света. Подход SLAS полезен для биосенсорных приложений в диагностике заболеваний, мониторинге окружающей среды и биомолекулярных исследованиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ нуклеиновых кислот с использованием гибридизационных зондов обычно проводится для обнаружения и количественного определения конкретных последовательностей ДНК/РНК1. Одним из наиболее успешных зондов для гибридизации является зонд Molecular Beacon (MB), который представляет собой ДНК в форме шпильки
Олигонуклеотид мечен флуорофором и гасителем на противоположных концах 2,3. Он мгновенно (без необходимости отмывания комплекса зонд-мишень от избытка зонда) обнаруживает наличие последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной петлевому фрагменту зонда, и обычно используется в количественной ПЦР (кПЦР). Необходимость ковалентного присоединения двух красителей - флуорофора и гасителя - к олигонуклеотидной последовательности зонда увеличивает стоимость, особенно когда требуется новый MB-зонд, нацеленный на новую последовательность нуклеиновых кислот. Альтернативно, зонд MB может быть использован в качестве репортера сигналов в формате многокомпонентного (разделенного) гибридизационного зонда, в котором два немеченых олигонуклеотида взаимодействуют как с мишенью, так и срепортером 4 MB-зонда. Многокомпонентный зондовый подход повышает селективность к распознаванию нуклеиновых кислот и улучшает связывание зонда со структурированными мишенями 5,6,7, Этот подход, тем не менее, не устраняет необходимости ковалентного мечения репортера флуорофором8.

Флуоресцентные светящиеся аптамеры (FLAPs)9 представляют собой аптамеры, обладающие сродством к низкофлуоресцентным красителям, чувствительным к окружающей среде (флуорогенам), связывание которых с помощью FLAP усиливает флуоресценцию флюорогенного многообразия. В отличие от флуоресцентно меченых зондов и сигнальных репортеров, ЛОСКУТы не требуют ковалентной маркировки чувствительных элементов одним или несколькими красителями и, таким образом, обеспечивают преимущество безметочного флуоресцентного детектирования10. Это особенно важно на этапе оптимизации, когда необходимо протестировать десятки конструкций нуклеиновых кислот для достижения удовлетворительных результатов анализа. Кроме того, анализ FLAP может быть оптимизирован путем регулировки концентрации флюорогена и/или FLAP-сенсора, а не изменения конструкции сенсора. Эти преимущества могут быть существенными для малобюджетных научно-исследовательских и учебных лабораторий. ДНК-лоскуты особенно перспективны в качестве сигнальных репортеров многокомпонентных гибридизационных зондов, называемых сенсорами аптамеров с расщепленным светом (SLAS)11. Наиболее эффективным ДНК-лоскутом, о котором сообщалось до настоящего времени, является DAP-10-42, который первоначально был выбран для усиления флуоресценции дапоксильных сульфонильных красителей12, обладающих неразборчивой способностью связывать и усиливать флуоресценцию различных арилметановых красителей (например, аурамина O, AO; кристаллического фиолетового, CV)13. DAP-10-42 был преобразован в SLAS для использования в анализе нуклеиновых кислот 13,14,15.

Цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы обеспечить секвенс-специфичный анализ интересующих нас мишеней нуклеиновых кислот с использованием безметочных цепей SLAS и флуорогенного красителя в качестве буферного компонента. В этом протоколе описывается алгоритм разработки SLAS на основе DAP-10-42 и подчеркивается эффективность SLAS для высокоселективного обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, отличающихся всего одним нуклеотидом.

Для определения нуклеиновых кислот SLAS требуются два специально синтезированных немодифицированных олигонуклеотида ДНК, используемых в конечной концентрации 0,5-1 мкМ для достижения максимальной эффективности. В описанном здесь протоколе используется коммерчески доступный краситель аурамин О (АО) в качестве флуорогена. Конечная концентрация АО в анализе находится в диапазоне от 1 до 10 мкМ, что обеспечивает высокое усиление флуоресценции в присутствии специфической мишени нуклеиновой кислоты над бланком (отсутствие мишени; Дополнительный рисунок 1). Необходимыми компонентами буфера для анализа являются ионы калия и магния (дополнительный рисунок 2). Ионы калия (1,25-40 мМ) стабилизируют предполагаемый G-квадруплексный домен FLAP, используемого в качестве сигнального репортера. Ионы магния (2,5-50 мМ) уменьшают отталкивание отрицательно заряженных фосфатных групп при взаимодействии SLAS с мишенью. Температура анализа SLAS с использованием сообщенных последовательностей для области передачи сигнала не должна превышать 28 °C во избежание потери рабочих характеристик16.

SLAS совместима с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами-мишенями, такими как ампликоны ДНК асимметричной ПЦР или реакция изотермической амплификации ДНК (например, амплификация рекомбиназной полимеразы, RPA17), продукты РНК из транскрипционно-опосредованной амплификации (TMA) или амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA)18, а также нативные молекулы РНК, такие как микроРНК, рРНК или нРНК). Вариации в нуклеотидной последовательности мишени вплоть до одного нуклеотида могут быть обнаружены с помощью подхода SLAS13,14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование датчика аптамера с разделенным светом (SLAS) с DAP-10-42 в качестве репортера сигнала

  1. Сконструировать последовательности двух немодифицированных олигонуклеотидных нитей ДНК, составляющих SLAS. Используйте фрагмент, содержащий нуклеотиды (NTS) 4,6-39 DAP-10-42 (табл. 1, рисунок 1А).
  2. Преобразуйте последовательность стебля 1 (nts 1-8 и 36-42) в стебель 1', удалив выпуклый остаток тимина в позиции nt 5, укоротив стебель до 4 п.о. (nts 4,6-8 и 36-39) и добавив концевой C-G п.о. (рис. 1A, шаг 1). Кроме того, одна из цепей SLAS содержит nts 9-29 основной последовательности DAP-10-42, в то время как другая цепь SLAS содержит nts 30-35 последовательности.
  3. Удлините 3'-концевую последовательность фрагмента, содержащего nts 9-29, с помощью d(GGTCAT), а 5'-концевую последовательность фрагмента nts 30-35 с помощью d(ATGACC) с образованием 6-п.н. ствола 2 (рис. 1A, шаг 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пары оснований T4-A39, A6-T38, C7-G37 и G8-C36 стержня 1 в DAP-10-42 необходимы для функции подсветки аптамера. Последовательность стебля 1' может быть изменена только на терминальном уровне и может быть парой оснований G-C, A-T, T-A или расширена 1-2 парами оснований по мере необходимости. Последовательность стержня 2 произвольна и может быть изменена. Тем не менее, рекомендуется сохранять термодинамическую стабильность стержня 2, если температура анализа не поднимается выше 28 °C. Укорачивание или иное дестабилизирующее соединение стержня 2 предотвращает преждевременное связывание красителя без мишени, если наблюдается высокий фон флуоресцентного анализа на основе SLAS. Также допускается расщепление нуклеотидной последовательности DAP-10-42 между nts 28-29, 27-28 или 26-27 вместо nts 29-30 (рис. 1B).
  4. Чтобы адаптировать разработанную SLAS к мишени или интересу нуклеиновой кислоты, удлините ствол 1' последовательностями ДНК, комплементарными фрагментам (плечам), связывающим мишень-мишень (плечи) с помощью линкеров d(TT) (рис. 1A, шаг 3). В результате получаются последовательности нитей SLAS-U и SLAS-S, составляющих зонд.
  5. Сделайте плечо, связывающее мишень SLAS-S, комплементарным 7-10-нтР фрагменту мишени, содержащему сайт SNS, а мишенно-связывающее плечо SLAS-U – 15-25 нЛ фрагменту мишени, примыкающему к плечу мишени-связывания SLAS-S (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение плеча связывания мишени SLAS-S с nt 4 или nt 39 последовательности DAP-10-42 является необязательным (рис. 1, плечо 1 или плечо 2 соответственно).
  6. Оцените температуру плавления (Tm) дуплексов между исследуемой мишенью и связывающими мишенями SLAS-S и SLAS-U с помощью веб-сервера UNAFold (unafold.org)19.
    1. Нажмите на вкладку DINAMelt в верхней части веб-страницы; перейдите в раздел «Приложения» и выберите «Гибридизация плавления в двух состояниях » (дополнительный рисунок 3A). На странице «Гибридизация плавления с двумя состояниями» введите одну из взаимодействующих последовательностей в левом поле, а другую — в правом поле (дополнительный рисунок 3B). Убедитесь, что обе последовательности расположены в порядке от 5' до 3'. Вы можете ввести более одной пары взаимодействующих последовательностей, разделив их точкой с запятой.
    2. Внизу страницы укажите температуру анализа (22 °C), концентрации одновалентных и двухвалентных катионов (20 мМ и 25 мМ соответственно) для соответствия условиям анализа. Укажите концентрацию взаимодействующих последовательностей.
    3. Нажмите кнопку «Отправить» (дополнительный рисунок 3B). Наблюдайте за результатами, которые включают изменение энергии Гиббса, изменение энтальпии и изменение энтропии связывания, а также значения Tm для соответствующих дуплексов (дополнительный рисунок 3B).
    4. Убедитесь, что значения Tm для дуплексов между полностью согласованной мишенью (M) и связывающими мишень плечами SLAS-S и SLAS-U выше температуры анализа, которая составляет 22 °C в текущем протоколе. Здесь значения Tm составили 32,2 °C и 74,4 °C соответственно (дополнительный рисунок 3C).
    5. Убедитесь, что дуплекс между SLAS-S и несовпадающей мишенью (MM), содержащей SNS, имеет Tm ниже температуры анализа. Это обеспечивает высокую селективность распознавания зонд-мишень, предотвращая сигнализацию флуорогена АО о присутствии аналита нуклеиновой кислоты, если он содержит SNS в SLAS-связывающем фрагменте (рис. 2). В данном случае Tm составил 21,3 °C (дополнительный рисунок 3C), что было достаточно, чтобы отличить несоответствие от согласованного комплекса.
    6. Отрегулируйте последовательности плеч, связывающих мишень, укоротив или удлинив комплементарные фрагменты, если это необходимо, чтобы удовлетворить указанные требования к стабильности.
  7. Получите разработанные нити SLAS-S и SLAS-U у любого коммерческого поставщика, поставляющего индивидуальные олигонуклеотиды ДНК, или синтезируйте нити ДНК самостоятельно с помощью автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Преобразование флуоресцентного светового аптамера (FLAP) DAP-10-42 в датчик аптамера с разделенным светом (SLAS). (А)Вторичная структура DAP-10-4212 предсказана с помощью приложения для сворачивания ДНК веб-сервера UNAFoldWeb Server 19 при 22 °C, 20 мМ Na+, 25 мМ Mg2+. Аптамер имеет вторичную структуру-шпильку с ядром , который, предположительно, складывается в G-квадруплексный мотив, стабилизированный стеблем 1. Для того, чтобы DAP-10-42 был преобразован в SLAS, (1) ствол 1 аптамера укорачивают до 4 п.о. и фланкируют дополнительным G-C п.о., чтобы получить ствол 1'; (2) основную последовательность разделяют между NTS 29 и 30, причем 3'- и 5'-стороны сайта расщепления расширяют комплементарными последовательностями d(GGTCAT) и d(ATGACC) соответственно, чтобы получить стержень 2; (3) ствол 1' расширяется последовательностями, комплементарными смежным фрагментам представляющей интерес мишени - плечам, связывающим цель, с D(TT)-линкером между плечами, связывающими мишень, и доменом передачи сигналов зонда. (B) Ядро также может быть разделено между nts 28-29, 27-28 или 26-27 без существенной потери сигнала и/или увеличения флуоресценции в раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Механизм генерации сигналов SLAS. SLAS состоит из двух цепей - SLAS-U и SLAS-S - и флуорогенного красителя (например, Auramine O; AO). В отсутствие интересующей нас мишени нуклеиновой кислоты обе цепи находятся в диссоциированном состоянии и не могут связывать краситель; Сигнал отсутствует (в центре). В присутствии полностью совпадающей мишени М как SLAS-U, так и SLAS-S гибридизуются с соседним фрагментом M , чтобы приблизить фрагменты ядра. Это способствует образованию сайта связывания красителя. Связывание АО усиливает его флуоресценцию, которая измеряется как считывание флуоресцентного сигнала (слева). При наличии несовпадающей мишени ММ , содержащей однонуклеотидную замену (SNS) во фрагменте, взаимодействующем с SLAS-S, только SLAS-U может гибридизоваться с мишенью MM , в то время как SLAS-S находится в диссоциированном состоянии. Это предотвращает образование участка связывания красителя, и сигнал не наблюдается (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Усиление целевой последовательности

  1. Амплифицируйте фрагмент анализируемого гена с помощью анализа SLAS. Для амплификации ПЦР или RPA используйте асимметричные условия (например, с добавлением прямого праймера в 10 раз по сравнению с обратным праймером) для получения одноцепочечного ампликона. Для амплификации фрагмента 126 nt из гена NANOGP8 с помощью линейной ПЦР 20 методом Linear After The Exponential (LATE) PCR20 используют последовательности праймеров, перечисленные в таблице 2. Здесь использовалась одноцепочечная матрица ДНК (Template NANOGP8 или Template G1423C, табл. 2), соответствующая 126-нт фрагменту гена. Шаблон был специально синтезирован компанией Integrated DNA Technologies, Inc.
    1. Приготовьте 100 мкл ПЦР-реакции, смешав 10 мкл 10x стандартного реакционного буфера Taq, 2 мкл смеси dNTP 10 мМ (до конечной концентрации 0,2 мМ), 10 мкл 10 мкМ прямого праймера и 10 мкл 1 мкМ обратного праймера (для конечной концентрации 1 мкМ и 0,1 мкМ), соответственно), 0,5 мкл 5U/мкл Taq ДНК-полимеразы, матрицы ДНК и безнуклеазной воды. Для элемента управления без шаблона добавьте воду вместо шаблона.
    2. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 1 мин; 45 циклов: 1) денатурация при 95°С в течение 15 с, 2) отжиг грунтовки при 60°С в течение 30 с, 3) удлинение праймера при 68°С в течение 30 с; и окончательное продление при 68 °C в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Методы амплификации на основе транскрипции, такие как NASBA18 , могут быть использованы вместо ПЦР или RPA, особенно если для амплификации доступна РНК-матрица. NASBA генерирует одноцепочечный ампликон РНК с концентрацией конечного продукта в микромолярном диапазоне, которая достаточно высока для использования в последующем анализе SLAS без концентрации продукта.
  2. Осаждайте амплифицированные образцы этанолом путем добавления 0,1x объема 3 М ацетата натрия (pH 5,5) и 3x объема этанола. Инкубировать при -20 °C в течение 1 ч, центрифугировать при 12 000-18 000 x g в течение 5 мин и выбросить надосадочную жидкость.
  3. Промойте гранулу с 70% этанолом, повторно центрифугируйте и снова выбросьте надосадочную жидкость. Высушите гранулу на воздухе и растворите в 10 мкл воды, не содержащей нуклеаз, для использования в анализе SLAS.

3. Флуоресцентный анализ с использованием SLAS

  1. Готовьте исходные растворы AO (0,1 мМ в ДМСО, 10x), SLAS-S (10 мкМ в воде, не содержащей нуклеазы, 10x), SLAS-U (10 мкМ в воде, не содержащей нуклеазы, 10x) и буфер для анализа 4x (80 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 100 мМ MgCl2, 80 мМ KCl).
    Примечание: Ионы калия необходимы для стабилизации предполагаемого G-квадруплексного мотива аптамера, который является частью сайта связывания красителя. Всего 1 мМ KCl (при 25 мМ MgCl2) в 1x буфере для анализа достаточно для обеспечения ~14-кратного усиления флуоресценции в присутствии специфической мишени M над бланком (образцом без мишени; Дополнительный рисунок 2B). Ионы магния стабилизируют взаимодействие нитей нуклеиновых кислот (между SLAS-S, SLAS-U и мишенью). Концентрация Mg2+ в 1x Буфере для анализа должна быть не менее 5 мМ (при 20 мМ KCl; Дополнительный рисунок 2C, D). Исходный раствор АО (~1 мМ) готовят в ДМСО. Складские концентрации SLAS-S и SLAS-U произвольны и при необходимости могут быть скорректированы при условии сохранения конечных концентраций цепей (см. обоснование выбора окончательной концентрации SLAS в разделе Обсуждение).
    ВНИМАНИЕ: АО вреден при проглатывании, токсичен при контакте с кожей и подозревается в возникновении рака. Всегда надевайте перчатки при работе с решениями AO. Взвешивание АО и приготовление его исходных растворов должно производиться под химическим колпаком.
  2. Приготовьте мастер-смесь, содержащую все компоненты анализа, кроме мишени. Рассчитайте объем мастер-микса (Vmix), умножив объем образца (60 μL) на количество образцов плюс один (n+1):
    figure-protocol-3
    Число проб n должно включать необходимые отрицательные и положительные контрольные данные.
  3. Объедините 0,25x Vmix μL из 4x Assay Buffer, 0,1x Vmix μL из 0,1 мМ AO, 0,1x Vmix μL из 10 μM SLAS-S и 0,1x Vmix μL из 10 μM SLAS-S. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, к конечному объему figure-protocol-4 таким образом, чтобы она соответствовала целевому объему, добавленному на шаге 3.4. Сделайте вортекс и кратковременно центрифугируйте исходную смесь. Аликвотировать 50 мкл исходной смеси в n пробирок для проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца может быть отрегулирован в зависимости от характеристик прибора, используемого для обнаружения флуоресцентного сигнала. Объем исходной смеси, которая аликвотируется в пробирки для образцов, может быть отрегулирован в зависимости от целевого объема, добавленного на шаге 3.4. Объем безнуклеазной воды, добавляемой для приготовления исходной смеси, должен быть соответствующим образом отрегулирован. Например, если образец, содержащий мишень, добавляется в количестве 10% (V/V) от конечного объема образца, в основную смесь следует добавить воду вобъеме до 0,9x V.
  4. Используйте одну выборку в качестве нецелевого элемента управления (пустой) и одну выборку в качестве положительного контроля. Добавьте 10 мкл образца, содержащего мишень, в исходную смесь (50 мкл), чтобы окончательный объем образца составил 60 мкл, содержащий 10-1000 нМ мишени. Для заготовки используйте воду без нуклеаз (10 мкл) вместо мишени. Для положительного контроля используют синтетический олигонуклеотид ДНК, содержащий целевую последовательность (например, мишень М, табл. 1). Добавьте 10 мкл 0,6-3 мкМ контроля, чтобы получить 0,1-0,5 мкМ конечную концентрацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая флуоресценция в этом положительном контроле гарантирует, что анализ будет работать должным образом, даже если отрицательный сигнал наблюдается для испытуемых неизвестных образцов.
  5. Смешайте образцы и уменьшите с помощью микроцентрифуги. Инкубируйте образцы при температуре 22 °C в течение 10-60 минут. Сигнал увеличивается всего на <15% между 40 и 60 минутами (Рисунок 3).
  6. Измерьте флуоресценцию образцов на длине волны 540 нм при возбуждении на длине волны 475 нм с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать портативный флуориметр, который измеряет флуоресценцию в тонкостенных ПЦР-пробирках. Флуориметр должен иметь фильтры возбуждения и излучения, подходящие для обнаружения флуоресценции AO. Примером подходящего фильтра возбуждения является короткочастотный фильтр с длиной волны 495 нм. Примером подходящего фильтра эмиссии является 510-580 нм. В качестве альтернативы, сигнал может наблюдаться визуально при возбуждении флуоресценции АО в образце с помощью источника ультрафиолетового или синего света.
    ВНИМАНИЕ: Если используется УФ-лампа, наденьте защитные от ультрафиолетового излучения очки.

figure-protocol-5
Рисунок 3: Временная зависимость генерации сигнала для SLAS-29U/30S. Образец, содержащий AO, SLAS-29U и SLAS-30S, анализировали в кинетическом режиме флуоресцентного спектрофотометра (возбуждение на 475 нм, излучение на 540 нм, 5-нм возбуждение/эмиссионные щели) в течение 60 мин. Через 5 мин (указано стрелкой) к образцу добавляли мишень М . Данные усреднены из двух независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективность SLAS с использованием ядра DAP-10-42 в качестве сигнального репортера была продемонстрирована с помощью зонда, предназначенного для исследования фрагмента гена NANOGP8 , важного для прогрессирования мультиформной глиобластомы (GBM), агрессивной формы рака головного мозга21. Сообщалось, что этот фрагмент содержит SNS в ДНК-грузе экзосом, полученных из раковых клеток22. Таким образом, SLAS был адаптирован к сайту SNS гена. Синтетическая ДНК-мишени M...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В представленном протоколе важнейшие шаги включают в себя: (i) разработку SLAS; (ii) температура анализа; (iii) присутствие катионов одно- и двухвалентных металлов (K+ и Mg2+); iv) концентрации нитей SLAS.

Проектирование SLAS
При проектировании цепей SLAS важно учитывать термодинамическую устойчивость комплексов, образованных цепями SLAS-S и SLAS-U в отсутствие мишеней, а также при наличии как специфической, так и несп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы высоко ценим средства, предоставленные Управлением студенческих исследований UCF (OUR) для AK. Работа по оптимизации условий LATE-PCR для гена NANOGP8 поддерживается Флоридским фондом инноваций в области рака (грант MOABC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аурамин ОMP Biomedicals 195064Флуорогенный краситель, используемый для передачи сигналов
Флуориметр Кэри ЭклипсAgilent TechnologiesГ9800Адля измерения флуоресцентного сигнала образцов
Диметия сульфоксидMP Biomedicals 196055растворитель для приготовления стоковых растворов Аурамина О
ДНК-олигонуклеотиды (праймеры, нити SLAS, синтетическая матрица для ПЦР)IDTН/Дизготовлен по индивидуальному заказу и обессолен продавцом, используется без дополнительной очистки
смесь dNTP, 10 мМThermoFisher ScientificР0191для реакции ПОЗДНЕЙ ПЦР
Хлорид магнияИнвитрогенAM9530Gбуферная составляющая; необходим для корректной ассоциации нитей зонда с анализируемой мишенью
Микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)Фишербранд02-681-320пластик для пробоподготовки
Микропипетка (0,1-2,5 &; L)ЭппендорфK56877Gиспользуется для пробоподготовки
Микропипетки (100-1000 &; L)ЭппендорфK13160Fиспользуется для пробоподготовки
Микропипетки (20-200 &; L)ЭппендорфJ05253Mиспользуется для пробоподготовки
Микропипетки (2-20 &; L)ЭппендорфG24675Gиспользуется для пробоподготовки
Мини-центрифугаCorning 6770используется для раскрутки образцов 
Вода, не содержащая нуклеазы (не обработанная DEPC)ThermoFisher ScientificАМ9932Использование для образцов в ПЦР и SLAS анализе
ПЦР-пробирки (0,5 мл)ИнвитрогенАМ9932для измерения флуоресценции с помощью флуориметра Quantus
Наконечники Pipett (20-200 &; L)ВВР76322-150пластик для пробоподготовки
Наконечники для пипеток (1-10 мкл)ВВР76322-528пластик для пробоподготовки
Хлорид калия ИнвитрогенAM9640Gбуферная составляющая; необходим для корректного сворачивания флуоресцентного светящегося аптамерного домена зонда
Флуориметр QuantusКомпания PromegaЕ6150Портативный недорогой флуориметр, который можно использовать для измерения флуоресценции
Кварцевая кюветаСтарна16.50F-Q-10/Z15для измерения флуоресценции с помощью флуориметра Cary Eclipse
Taq ДНК-полимераза со стандартным буфером TaqБиолаборатории Новой АнглииМ0273Сдля амплификации фрагмента гена, подлежащего анализу с помощью SLAS-анализа 
Буфер Tris-HCl (pH 7,4)Бостон БиопродуктыР-314Компонент буфера
УФ-лампаУВП95-0016-14возбуждать АО для наблюдения визуального сигнала
Вихревой смесительВВР10153-838используется для смешивания образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).
  3. Kolpashchikov, D. M. An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions. Scientifica. 2012, 928783(2012).
  4. Kolpashchikov, D. M. A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition. J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).
  5. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).
  6. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  7. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  8. Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences. Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).
  9. Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications. Analyst. 145, 701-718 (2020).
  10. Du, Y., Li, B., Wang, E. "Fitting" makes "sensing" simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers. Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).
  11. Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. Binary (split) light-up aptameric sensors. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).
  12. Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors. Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).
  13. Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing. Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).
  14. Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons. Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).
  15. Wang, L., et al. MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform. Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).
  16. Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids. Methods. 197, 82-88 (2021).
  17. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clin Chem. 62, 947-958 (2016).
  18. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).
  20. Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).
  21. Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review. Cancers. 14, 2412(2022).
  22. Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker. PLoS One. 13, e0197782(2018).
  23. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).
  24. Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. Metal cations in G-quadruplex folding and stability. Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).
  25. Chen, R. F. Fluorescence of free and protein-bound auramine O. Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).
  26. Klymchenko, A. S. Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications. Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

Похожие статьи