Методическая статья

Мультимодальная система визуализации для улучшения фенотипирования живых клеток рака молочной железы без меток

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой мультимодальный подход, сочетающий рамановскую спектроскопию и томографическую фазовую микроскопию для неинвазивного фенотипирования живых клеток рака молочной железы человека без меток. Он включает в себя удобный для пользователя конвейер анализа без человеческой предвзятости для быстрого количественного морфохимического анализа, предоставляющий подробную молекулярную и структурную информацию для применения в исследованиях рака и клеточной биологии.

Аннотация

Представлены мультимодальная конфокальная рамановская микроспектроскопия (РС) и томографическая фазовая микроскопия (ТРМ) для быстрого морфохимического фенотипирования клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-231). Используя непертурбативную природу этих передовых методов микроскопии, мы собрали подробные морфо-молекулярные данные живых, безметичных клеток в их естественной физиологической среде. Разработаны несмещенные конвейеры обработки данных человека для анализа гиперспектральных комбинационных изображений комбинационного рассеяния света (охватывающих рамановские моды от 600 см-1 до 1800 см-1, которые однозначно характеризуют широкий спектр молекулярных связей и субклеточных структур), а также морфологических данных трехмерных томограмм показателя преломления (обеспечивающих измерения объема клетки, площади поверхности, занимаемой площади и сферичности при нанометровом разрешении, наряду с сухой массой и плотностью). Систематически разбивая богатые детали отдельных клеток, которые предоставляют RS и TPM, мы демонстрируем количественным образом преимущество такого метода мультимодальной микроскопии для фенотипирования опухолевых клеток рака молочной железы. Наши инструменты также обеспечивают более глубокое понимание субклеточной информации без использования каких-либо меток. Наконец, мы изучаем и обсуждаем любую уникальную или коррелированную информацию, содержащуюся в наборах данных, полученных от RS и TPM. Мы считаем, что наши инструменты и конвейеры количественного анализа данных могут революционизировать задачи фенотипирования в биомедицинских исследованиях, когда требуется быстрый и непертурбативный метод на живых клетках в культуре, с потенциалом для будущего применения в клинических и диагностических приложениях.

Введение

Характеристика клеток и фенотипирование являются ключевыми аспектами биомедицинских исследований1. Возможность охарактеризовать клетки как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях имеет первостепенное значение для понимания клеточной функции, дифференцировки и патологии 1,2,3. Это представляет особый интерес в области онкологии, где точное профилирование клеток необходимо для диагностики опухоли, определения стадии заболевания и, в конечном итоге, определения терапевтических мишеней2. Традиционные методы определения характеристик клеток не могут обеспечить временную динамику и обычно основаны на инвазивных методах, таких как окрашивание или мечение, которые могут нарушать нативное состояние клеток и вносить потенциальные смещения в данные. Поэтому все более востребованными становятся неинвазивные стратегии для обеспечения точного и тщательного фенотипирования живых клеток в их нативном, невозмутимом состоянии.

В этом контексте безмаркерные мультимодальные методы визуализации произвели революцию в исследованиях клеточной биологии, объединив комплементарные модальности для захвата как морфологической, так и молекулярной информации 2,5. Эти подходы позволяют проводить комплексную и неинвазивную характеристику клеток, которые не всегда могут обеспечить отдельные традиционные методы 2,5,6. Например, хотя методы микроскопии, такие как флуоресцентная микроскопия, широко используются в морфологической и функциональной визуализации клеток, они имеют присущие им ограничения. Флуоресцентные методы часто страдают от фотообесцвечивания, фототоксичности и малого количества молекул-мишеней, что ограничивает аналитический потенциал4. Кроме того, эти подходы часто требуют использования экзогенных меток или красителей, что может нарушить нативное состояние клетки или привести к образованиюартефактов.

Мультимодальные платформы визуализации, сочетающие в себе преимущества нескольких методов визуализации, преодолевают эти ограничения, позволяя получать различные типы данных от живых клеток без необходимости маркировки. Интеграция рамановской спектроскопии (РС) с другими методами визуализации, такими как фазово-контрастная микроскопия или томографическая фазовая микроскопия (ТРМ), является многообещающей стратегией для преодоления ограничений отдельных методов. Действительно, мультимодальная визуализация обеспечивает более глубокое понимание клеточных фенотипов, особенно при сложных биологических состояниях и патологиях, таких как рак, где молекулярные и структурные свойства имеют решающее значение для точной характеристики 2,5.

Безметочный RS хорошо подходит для химической визуализации клеток8. Обнаруживая молекулярные колебательные моды, РС обеспечивает биохимические отпечатки пальцев, которые могут раскрыть подробную информацию о молекулярном составе клеток 9,10,11. Спектры комбинационного рассеяния света, полученные из биологических образцов, содержат информацию о различных биомолекулах, таких как липиды, белки, нуклеиновые кислоты и метаболиты, которые играют важную роль в понимании молекулярной природы клеток 9,12. Одним из основных преимуществ РС является то, что он неинвазивный, что позволяет охарактеризовать живые клетки в их естественном состоянии без изменения их физиологического состояния.

Несмотря на множество преимуществ, RS также имеет некоторые ограничения. Действительно, хотя РС предоставляет подробную молекулярную информацию, она не позволяет получить количественную информацию о морфологии или структуре клеток2. Именно здесь дополнительные методы визуализации, такие как TPM, играют решающую роль.

TPM является формой количественной фазовой визуализации (QPI)13,14 и позволяет визуализировать количественную информацию о морфологии клеток с высоким разрешением, без меток 15,16. ТРМ отличается от традиционных методов микроскопии тем, что для него не требуются контрастные вещества; вместо этого он работает путем измерения фазовых сдвигов, возникающих в результате изменения показателя преломления (RI) образца17. Фазовые сдвиги дают информацию о структурных свойствах клетки, включая ее объем, площадь поверхности, форму и внутреннюю структуру 2,18. TPM может достигать высокого пространственного разрешения, вплоть до нанометрового уровня, и, следовательно, является идеальным методом для записи морфологических деталей живых клеток с высоким разрешением. Кроме того, возможность реконструкции 3D томограмм RI позволяет визуализировать субклеточные структуры в их естественной среде18, предоставляя более точную информацию по сравнению с 2D проекциями. Тем не менее, одним из основных ограничений TPM является его недостаточная химическая специфичность, поскольку он в первую очередь предоставляет информацию о морфологии клетки и распределении фаз, не имея возможности дифференцировать различные химические компоненты или идентифицировать биохимические особенности.

Комбинация РС и ТРМ в мультимодальной методике дает преимущества в клеточном фенотипировании. В то время как RS позволяет получить богатую молекулярную информацию, TPM добавляет структурный аспект, позволяя анализировать клеточную морфологию в значительных деталях. В последнее время комбинация РС с ТРМ была успешно продемонстрирована в нескольких исследованиях, посвященных изучению рака 2,19,20. Например, в предыдущей работе сообщалось, что совмещение рамановской спектроскопии с данными голографической фазовой микроскопии может предоставить дополнительную молекулярную и морфологическую информацию, позволяющую различать различные типы клетоки стадии развития опухоли. Эти исследования показали возможности мультимодальной визуализации для повышения точности клеточного фенотипирования, особенно в контексте рака, где молекулярные и структурные характеристики клеток тесно связаны с их злокачественностью и поведением.

Несмотря на достигнутый в последнее время прогресс в области мультимодальной визуализации, все еще существуют проблемы, требующие решения, особенно в области обработки и анализа данных21. Большие объемы данных, которые дают методы мультимодальной визуализации, могут быть обременительными для анализа, и для извлечения значимой информации необходимо использовать простые процедуры. Чтобы противостоять этой проблеме, необходимо создать удобные для пользователя конвейеры обработки данных, которые будут обрабатывать сложные данные и свести к минимуму человеческую предвзятость при анализе. Такие конвейеры имеют решающее значение для достижения точности и воспроизводимости результатов и возможного внедрения этих подходов в клинические и диагностические приложения.

Цель настоящей работы состоит в том, чтобы проиллюстрировать потенциал слияния RS с TPM для безметочного, высокоскоростного и непертурбативного фенотипирования живых одиночных раковых клеток. Объединив эти два надежных подхода к визуализации, мы обеспечили всестороннюю и количественную характеристику молекулярных и морфологических свойств клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-231). В работе также подчеркивается важность создания конвейеров обработки данных, свободных от человеческой предвзятости, чтобы гарантировать, что извлеченная информация из мультимодальных наборов данных является правильной и надежной. Здесь мы стремимся создать надежную платформу для фенотипирования раковых клеток, которая может быть распространена на другие типы клеток. Универсальность и чувствительность этого подхода делают его потенциальным кандидатом для широкого спектра биомедицинских приложений, от фундаментальных исследований клеточной биологии до диагностики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образцов

  1. Затравите клетки MDA-MB-231 на кварцевые чашки Петри.
    1. Пластина MDA-MB-231 клетки рака молочной железы человека на 3,5 см кварцевые стеклянные чашки Петри.
    2. Инкубируйте клетки при 37 °C в среде с 5% содержаниемCO2 до полного прикрепления к поверхности (не менее 12 ч после посева).
  2. Промойте ячейки и подготовьте к измерению.
    1. Удалите питательную среду из клеток после того, как они прилипнут к чашке Петри.
    2. Аккуратно промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления остатков среды.
    3. Добавьте свежую среду для культивирования клеток и держите клетки покрытыми средой на протяжении всей процедуры измерения, чтобы убедиться в их жизнеспособности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве питательной среды в данном исследовании использовался фенол без красных DMEM/F-12 с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и пенициллина (100 МЕ/мл)-стрептомицина (100 мкг/мл).

2. Высокопроизводительная рамановская микроскопическая система

Примечание: Технические детали самодельного рамановского микроскопа, используемого для текущей работы по визуализации живых клеток MDA-MB-231, были описаны ранее22. Вкратце, используемая специально разработанная высокопроизводительная рамановская микроскопическая система оснащена лазером Ti-Sapphire с длиной волны 785 нм и накачкой лазером с длиной волны 532 нм (рис. 1A). Рамановский лазер с длиной волны 785 нм соединен с инвертированным корпусом флуоресцентного микроскопа IX83, при этом возбуждение направляется на образец через объектив погружения в воду UPLSAPO60× 1,2 нА с помощью дихроичного зеркала с длиной волны 749 нм. Поляризатор настраивает среднюю мощность лазера на заднем порту микроскопа. Получение изображений в светлом поле обеспечивается за счет сопряжения белого света аналогичным образом. Система переключается между рамановским и светлопольным режимами, автоматически меняя дихроичные фильтры. Система сочетает в себе гальвозеркальное и сценическое сканирование для получения изображений с высокой пропускной способностью. Пользовательский скрипт MATLAB взаимодействует с программным обеспечением для управления микроскопом с открытым исходным кодом, платой сбора данных (DAQ) и системами обнаружения сигналов для автоматизации процесса сбора данных. Обратно рассеянный комбинационный свет собирается тем же объективом, в то время как видимый свет отфильтровывается дихроичным зеркалом с длиной волны 785 нм и направляется на спектрограф ближнего инфракрасного диапазона и детектор устройства с зарядовой связью (ПЗС). Эта конфигурация позволяет получать многомерные изображения, захватывая светлые поля, флуоресцентные и комбинационные сигналы в различных положениях и z-стеках 2,22.

  1. Процедура комбинационной визуализации
    1. Подготовка пробы и сохранение физиологических состояний
      1. Установите образец в инкубатор на сцене для поддержания физиологических условий. Убедитесь, что в инкубаторе установлена температура 37 °C, а также регулируйте температуру с обратной связью в режиме реального времени.
      2. Поддерживайте уровень влажности в камере на уровне >95% с помощью внутренней периферийной ванны, наполненной дистиллированной водой. Настройте газовый контроллер CO2 на смешивание 5% CO2 с 95% воздуха и подачу его в камеру инкубатора.
    2. Автоматизированное управление погружением в воду
      1. Включите самодельный автоматический погружной питатель, чтобы подавать воду к линзе объектива со скоростью потока 2 μл/мин с помощью шприцевых насосов и игл шприца, приклеенных к наконечнику объектива.
      2. Регулярно проверяйте уровень воды, чтобы избежать испарения и обеспечить стабильные условия визуализации на протяжении всех измерений.
    3. Сбор данных рамановской спектроскопии
      1. Включите лазер накачки и отрегулируйте его мощность, чтобы достичь мощности лазера в плоскости образца 75 мВт.
      2. Откройте программное обеспечение для управления микроскопом с открытым исходным кодом Micro-manager. В разделе «Параметры конфигурации» выберите BF и нажмите кнопку «Трансляция » в левой части окна программного обеспечения, чтобы визуализировать изображение в ярком поле. Выберите нужную отдельную ячейку, из которой будет получен спектр комбинационного рассеяния. Затем нажмите кнопку Стоп , чтобы завершить визуализацию яркого поля.
      3. Установите Z-координату плоскости комбинационного рассеяния света, увеличив количество сигналов на ПЗС-камере.
      4. Для этого откройте программу для управления ПЗС-камерой (LightField); на параметре Experiment (Experiment Setting) установите Время экспозиции (Exposure Time ) на 1,5 с. Затем нажмите «Выполнить » на панели инструментов «Эксперимент » и включите лазерный луч.
      5. Затем отрегулируйте положение Z, чтобы максимизировать количество сигналов в области отпечатков пальцев от 600 см-1 до 1800 см-1 , чтобы оптимизировать визуализацию пиков комбинационного рассеяния, связанных с биологическими сигнатурами. Затем выключите лазер и нажмите «Стоп » на панели экспериментов программного обеспечения ПЗС-камеры и выйдите из программы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что максимальное количество комбинационного сигнала на ПЗС-камере соответствует положению вдоль оси Z, совпадая с +8 мкм по отношению к плоскости изображения, не показывая никаких следов связанных с клетками комбинационных пиков, из-за того, что фокальное пятно попадает точно внутрь кварца. Это значение может варьироваться в зависимости от типа и состояния ячейки.
    4. Запустите процесс сбора данных с помощью скрипта MATLAB, который автоматически обработает рамановские каналы в многомерных измерениях и сохранит гиперспектральные комбинационные данные.
    5. Установите поле зрения 50 × 50 мкм2, 40 × 40 пикселей, при этом площадь каждого пикселя соответствует 1,25 × 1,25 мкм2. Установите время экспозиции для каждого спектра комбинационного рассеяния света, равное 1,5 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно выполняйте калибровку волновых чисел с использованием образцов ацетамидофенола для аннотирования известных пиков комбинационного рассеяния. Калибровка оси комбинационного сдвига с помощью квадратичной интерполяции.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с лазерами осторожно. Во время настройки и работы всегда используйте соответствующие защитные очки, рассчитанные на длину волны лазера.

3. Анализ данных ДЗЗ

  1. Постобработка гиперспектральных карт комбинационного рассеяния света с помощью веб-инструмента RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Войдите в веб-инструмент.
    2. Импортируйте гиперспектральные данные. На вкладке «Мои анализы » нажмите « Создать » и загрузите файл .mat, содержащий переменную пространственных и спектральных данных, а также переменную по оси x (т. е. значения комбинационного сдвига).
    3. Чтобы усечь спектр до указанных областей в рамановском сдвиге, в ниспадающем меню Обрезка и поворот нажмите кнопку Спектральная обрезка и определите нижнюю и верхнюю границы области рамановского смещения, равные 600 см-1 и 1800 см-1 соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этого усечения спектра широкий и высокоамплитудный пик, относящийся к кварцевому материалу чашки Петри, исключается из анализа.
    4. Чтобы скорректировать спектры комбинационного рассеяния света для космических лучей, в параметрах «Шумоподавление» нажмите « Despike», выберите Z-score в качестве метода и установите пороговое значение , равное 8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция предварительной обработки Despike помогает решить проблему пикселей, содержащих всплески в своем сигнале, которые возникают в результате воздействия космических лучей.
    5. Отметьте опцию Использовать первую разность для поиска выбросов с помощью первой дискретной разности интенсивностей по спектру, а также отметьте опцию Скорректировать спайки. Спектр каждого плохого пикселя будет заменен на медианный спектр соседних с ним пикселей.
    6. Нажмите « Выполнить », чтобы исправить пики.
    7. Чтобы удалить шум с карт, соответствующих каждому волновому числу, в параметрах « Шумоподавление » нажмите « Сгладить карту», выберите «Медианный фильтр» и установите размер стороны квадрата, которая учитывается при применении фильтра к каждому пикселю карты, равный 3 пикселям. Затем нажмите «Выполнить».
    8. Чтобы применить фильтр для сглаживания спектра каждого пикселя, нажмите « Сглаженный спектр» в настройках « Шумоподавление ». Выберите фильтр Савицкого-Голе в качестве Метода и установите длину окна фильтра равной 7 и полиномиальный порядок фильтра равным 2. Затем нажмите «Выполнить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр Савицкого-Голея требует указания длины окна фильтра (положительное нечетное целое число) и порядка полинома.
    9. Чтобы удалить средний фоновый сигнал с переднего плана, откройте панель Удаление оптической подложки и нажмите кнопку Определить подложку. Установите k-means в качестве метода и количество кластеров равным 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция сегментирует клетки («передний план») и их субстрат с помощью кластерного подхода. После этого вы сможете удалить средний фоновый сигнал с переднего плана или ограничить некоторые шаги, чтобы они работали только с пикселями переднего плана. Количество выбираемых кластеров может варьироваться в зависимости от конкретного образца.
    10. В расширенных настройках установите флажок Морфологическая очистка , чтобы удалить некоторые небольшие капли с переднего плана (например, ложные части клеток и т. д.). Затем нажмите «Выполнить».
    11. На панели Удаление оптической подложки , чтобы вычесть средний фоновый сигнал, нажмите Удалить подложку, затем выберите Глобальное среднее (среднее значение центральных 95% значений) и нажмите Запустить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: K-средние обычно быстрее, хотя и недетерминированы (однако, поскольку случайное начальное значение фиксировано, один и тот же результат будет получен при каждом прогоне, при прочих равных условиях). Количество кластеров может быть увеличено более чем до 2, если определенные части переднего плана по-прежнему распознаются как фоновые. В качестве фона определяется кластер с наименьшим средним сигналом.
    12. Чтобы скорректировать флуоресценцию базовой линии, откройте панель «Базовая линия » и нажмите кнопку «Скорректировать базовую линию». Выберите asPLS (Adaptive Smoothness PLS) и установите λ равным 5000000. Затем нажмите «Выполнить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 7 доступных методов, которые можно выбрать, 5 из которых основаны на штрафном методе наименьших квадратов (PLS). В этих методах PLS необходим параметр сглаживания (λ). Более высокое значение λ приведет к более сглаженным базовым линиям.
    13. Чтобы нормализовать каждую рамановскую гиперспектральную карту, разделив ее на норму Фробениуса, нажмите Разное и выберите опцию Нормализовать . Затем выберите Frobenius в качестве метода и нажмите кнопку Run.
      Примечание: Норма Фробениуса используется для нормализации всей матрицы данных.
    14. Чтобы получить изображение в ложных цветах, иллюстрирующее пространственное распределение субклеточного компонента, на панели Изображения справа в окне Изображение интенсивности щелкните символ меню Открыть . Затем нажмите на опцию «Редактировать изображение », чтобы открыть панель редактирования.
    15. На панели редактирования выберите «Однополосный», затем задайте спектральный диапазон (например, 715−725 см-1 для цитоплазмы). Выберите «Двойной цвет » на карте цветов, определите цвет, порог интенсивности и непрозрачность, затем нажмите «Подтвердить».
    16. Чтобы загрузить одноточечный спектр, нажмите на интересующий пиксель на изображении, чтобы выбрать его. Затем на панели Легенда о спектре в разделе Курсор нажмите кнопку Загрузить спектр. Повторите ту же процедуру для разных субклеточных компонентов.
    17. Чтобы экспортировать спектры переднего плана и подложки, на панели Легенда спектра в разделе Идентификация подложки нажмите кнопку Загрузить спектр для разделов Передний план и Подложка .
      Примечание: В ранее описанном протоколе анализа данных RS были описаны этапы предварительной обработки и одномерный анализ для получения изображений в ложных цветах, иллюстрирующих пространственное распределение ключевых субклеточных компонентов, спектры интенсивности комбинационного рассеяния света как с переднего плана, так и с субстрата, а также одноточечные спектры субклеточных структур. В то время как нисходящий анализ часто адаптирован к конкретному биологическому вопросу, в этом исследовании теперь выделяются репрезентативные многомерные и классификационные методы, доступные через раздел «Анализ карты » используемого веб-инструмента. К ним относятся кластерный анализ, анализ главных компонент (PCA), многомерное разрешение кривой (MCR), N-FINDR и спектральная аппроксимация. Спектральная аппроксимация позволяет количественно оценивать и сравнивать спектральные особенности с использованием подходов, основанных на расстоянии, таких как коэффициент корреляции Пирсона или картограф спектрального угла. Кластерный анализ может быть проведен с использованием таких алгоритмов, как k-средние, мини-пакетные k-средние или иерархическая агломеративная кластеризация, что облегчает сегментацию гиперспектральных данных на основе спектрального сходства. PCA может применяться для уменьшения размерности данных и выделения дисперсионных шаблонов, в то время как MCR позволяет разлагать смешанные сигналы на чистые спектры компонентов. Алгоритм N-FINDR помогает извлекать спектры конечных элементов путем предварительного применения PCA для уменьшения размерности, что делает его особенно подходящим для гиперспектральных наборов данных. Эти инструменты обеспечивают надежную основу для последующего исследования биологических закономерностей, закодированных в спектральных данных комбинационного рассеяния света.

4. Протокол измерения TPM

  1. Подготовьте настройку микроскопа.
    1. Капните каплю дистиллированной воды на линзу объектива микроскопа. Поместите образец на предметный столик для перемещения микроскопа. Отрегулируйте положение образца, чтобы выровнять его по объективу.
  2. Совместите объектив и линзы конденсора.
    1. Включите микроскоп и запустите программу для обработки изображений TomoStudio. Нажмите на значок микроскопа на панели инструментов. После инициализации нажмите кнопку Конфигурация. Выберите LiveCell на панели «Задание » и PBS в качестве канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение RI на панели "Средний" автоматически устанавливается на 1,337, если PBS выбран в качестве среды.
    2. Перейдите на вкладку «Калибровка » на панели управления программного обеспечения для обработки изображений. Установите осевое положение объектива и конденсорных линз, выбрав «Фокус» и «Поверхность» соответственно.
    3. Нажмите «Режим сканирования», чтобы вручную отрегулировать линзы, при этом узоры освещения будут сосредоточены в центре поля зрения и будут казаться практически неподвижными.
  3. Найдите образец.
    1. Нажмите «Обычный режим» и отрегулируйте этап перевода, чтобы расположить ячейку в поле зрения. Сфокусируйтесь на образце, регулируя осевое положение линзы объектива до тех пор, пока граница образца не станет практически невидимой на экране.
    2. Настройте этап перевода так, чтобы найти область без ячеек, обеспечивая беспрепятственный обзор.
  4. Откалибруйте систему.
    1. Выберите «Калибровка» в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы захватить несколько 2D-голограмм с различными углами освещения.
  5. Получите томограмму 3D RI.
    1. Настройте этап перевода так, чтобы ячейка находилась по центру поля зрения. Перейдите на вкладку «Получение» и выберите «3D-снимок», чтобы получить томограмму ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время сбора данных для 3D RI-томограммы одной клетки значительно короче (в нескольких секундах) по сравнению со временем, требуемым для сбора данных РС; таким образом, принятие инкубатора на сцене для TPM, как правило, не требуется. Однако, если необходимо проводить измерения на большом количестве клеток или в определенных условиях, доступны специальные коммерческие инкубационные камеры, обеспечивающие физиологические условия, которые могут быть интегрированы в систему TPM.

5. Анализ данных TPM

  1. Постобработка карт TPM с помощью программного обеспечения TomoStudio.
    1. Чтобы визуализировать голографические томограммы, выберите данные на панели «Навигация по данным », щелкните данные правой кнопкой мыши и выберите « Открыть». Вкладка « Исследования» автоматически откроется для дальнейшего анализа. На панели Data Manager нажмите на RI Tomogram.
    2. На панели «Объемная визуализация » выберите RI и нарисуйте четыре прямоугольных цветных прямоугольника на холсте RI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое цветовое поле позволяет связать на томограмме, отображаемой на панели отображения , определенный цвет с компонентами ячейки, характеризуемыми диапазоном RI, определенным рамкой на холсте RI. После рисования каждого цветового поля соответствующая информация автоматически отображается в таблице под холстом RI.
    3. На панели под холстом RI установите минимальное и максимальное значения RI Range для каждого цветового поля (т.е. первое цветовое поле: MinRI = 1.3450 и MaxRI = 1.3499, второе цветовое поле: MinRI = 1.3506 и MaxRI = 1.3571, третье цветовое поле: MinRI = 1.3586 и MaxRI = 1.3650, четвертое цветовое поле: MinRI = 1.3688 и MaxRI = 1.3866). Свяжите значение непрозрачности и цвет (дважды щелкнув по каждому полю и выбрав цвет) с каждым полем. Это позволяет визуализировать томограммы в соответствии с распределениями 3D RI.
    4. Нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить определенные диапазоны зарезервированных элементов и цветовые поля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазоны RI должны быть скорректированы в зависимости от конкретных образцов.
    5. Для получения количественных дескрипторов морфологии клетки (т.е. объема [V], площади поверхности [S], проекционной площади [A], среднего RI, плотности [D], сухой массы [DM] и сферичности [Φ]) используйте интерфейс Analysis .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробно с теоретическим расчетом количественных параметров можно ознакомиться здесь 2,23.
      1. На панели инструментов нажмите кнопку Анализ. На панели Анализ справа выберите Вручную на панели Сегментация и установите 1.3450 в качестве порога RI. Затем нажмите «Применить».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что значения RII (fl/pg) и исходного RI составляют соответственно 0,19 (приращение рефракции, которое широко установлено предыдущими исследованиями24) и 1,3370 (RI PBS, используемое для RI фоновой калибровки PBS). Программное обеспечение для визуализации выполняет объемную сегментацию клетки-мишени в соответствии с установленным порогом RI, вычисляет морфологические индексы (V, S, A, среднее RI, D, DM и Φ) и сообщает о них в выходной таблице на панели «Измерение ».
      2. Нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить рассчитанные морфологические индексы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к используемому программному обеспечению, можно использовать несколько инструментов с открытым исходным кодом для количественной оценки морфологических признаков по данным TPM. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) предоставляет инструменты для анализа изображений, включая сегментацию и извлечение признаков, которые совместимы с фазово-контрастными изображениями. Fiji (https://fiji.sc/) — программное обеспечение с открытым исходным кодом с плагинами для сегментации и вычисления морфологических параметров25. Napari (https://napari.org/) — это многомерный просмотрщик изображений с поддержкой интеграции моделей машинного обучения для сегментации и анализа. Ilastik (https://www.ilastik.org/) предлагает инструменты сегментации на основе машинного обучения, а DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) интегрирует модели глубокого обучения с ImageJ/Fiji для расширенного анализа. Кроме того, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) предоставляет инструменты для 2D и 3D морфологических операций на Фиджи. Cellpose326 — это еще один инструмент на основе глубокого обучения для сегментации клеток, который может быть применен к фазово-контрастной визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описан рабочий процесс безмаркерной морфохимической характеризации живых клеток на основе конфокальных РС и ТРМ. Мы проверили способность предложенного рабочего процесса получать молекулярный состав и морфологические параметры клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231 (рис. 1).

Ячейки MDA-MB-231 затравливали на кварцевые чашки Петри со стеклянным дном. Специально изготовленный конфокальный рамановский микроскоп (рис. 1A...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили мультимодальный подход и простой конвейер анализа, объединяющий два передовых метода визуализации без меток: RS и TPM. Описанный рабочий процесс позволил быстро и неинвазивно проводить морфохимическое фенотипирование живых одиночных клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-231) без необходимости внешней маркировки.

РС представляет собой неразрушающий метод, позволяющий охарактеризовать биохимический состав биологических образцов путем детект...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Progetto Rocca из фонда MIT-Italy, грантами NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Сеул, Южная Корея) и Национальным онкологическим центром, Корея (NCC-24H1170). Леонардо Бьянки принимает решение о присуждении стипендии Progetto Rocca Post-Doctor Fellowship для проведения совместных исследований в Массачусетском технологическом институте и Политехническом университете Милана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПЗС-камераПринстонские инструментыPIXIS 100BR eXcelonДетектор сигнала комбинационного рассеяния.
Программное обеспечение для управления ПЗС-камерамиПринстонские инструментыСветовое поле
Непрерывноволновой титановый лазер (длина волны: 785 нм)Спектрофизика3900 СИспользуется для возбуждения в рамановской микроскопии.
Дихроичное зеркалоТорЛабсDMSP750BДихроичное зеркало 749 нм, отклоняет возбуждение 785 нм комбинационного рассеяния света к выборке, отфильтровывает флуоресцентные и светлопольные сигналы.
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher ScientificA5256701
Корпус флуоресцентного микроскопаОлимпIX83
Лазер (длина волны: 532 нм)СпектрофизикаТысячелетия эВНакачка лазера для лазерной системы Ti-Sapphire 785 нм.
Программное обеспечение MATLABМатематические работы2023а
Клеточная линия MDA-MB-231АТКСХТБ-26
Спектрограф ближнего ИК-диапазонаАндрорHolospec HS-HSG-785-LFОн используется для спектрального анализа обратно рассеянного света.
Объектив (60&кратный 1,2 NA, погружение в воду)ОлимпUPLSAPO60×
Инкубационная камера на сценеТокай Хитstxg-welsx-сет
Программное обеспечение для управления микроскопом с открытым исходным кодом&микро; УправляющийМикро-Менеджер-2.0
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
Не содержит фенола DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21041025
Фосфатно-солевой буферGibco10-010-023
Кварцевые чашки Петри со стеклянным дномУэйкен Би ТехСФ-С-Д12
Программное обеспечение для анализа рамановских данныхРамАпВеб-инструмент для обработки рамановских гиперспектральных данных.
Камера sCMOSХамамацу ФотоникаOrca Flash 4.0 v2
Шприцевой насосХемиксФьюжн 720
Томографический фазовый микроскопТомокуб, Инк.ХТ-2НКоммерческая система для получения количественных фазовых изображений.
Программное обеспечение для анализа данных TPMТомокуб, Инк.ТомоСтудияПрограммное обеспечение, используемое для анализа данных томографической фазовой микроскопии (ТРМ).

Ссылки

  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи