Челночное клонирование на основе CRISPR: высокопроизводительный метод клонирования

Xiaoxue Li; Yutian Peng; Wen Xue; Xuelian Liu; Si Luo; Ping Wei; Jiwu Wang

doi:10.3791/68503

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Челночное клонирование на основе CRISPR: высокопроизводительный метод клонирования

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68503

⸱

13 июня 2025 г.

Xiaoxue Li^*¹^,² , Yutian Peng^*²^,³ , Wen Xue² , Xuelian Liu² , Si Luo⁴ , Ping Wei⁴ , Jiwu Wang²

¹Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, ²Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол для высокопроизводительного метода клонирования, челночного клонирования на основе CRISPR (CRISPRshuttle cloning), который позволяет переносить интересующие фрагменты ДНК между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК.

Аннотация

Разработка полногеномных библиотек плазмид с использованием существующих геномных репозиториев служит ключевой предпосылкой для систематической функциональной характеристики генов в различных биологических процессах. Однако современные высокопроизводительные методики межвекторного переноса фрагментов ДНК требуют ПЦР-амплификации целевых последовательностей перед клонированием, что делает создание коллекций плазмид геномного масштаба технически сложным и трудоемким. Используя кассету CRISPRshuttle, мы разработали новый метод высокопроизводительного клонирования, челночное клонирование на основе CRISPR (клонирование CRISPRshuttle), который облегчает перенос многих фрагментов ДНК из донорских плазмид, имеющих идентичные последовательности основной цепи, в CRISPR-совместимый вектор без ПЦР-амплификации фрагментов ДНК. Здесь мы представляем протокол для CRISPRshuttle. Этот протокол включает в себя две последовательные реакции в пробирке перед бактериальной трансформацией. Во-первых, фрагменты ДНК-мишени вырезаются из донорских плазмид путем Cas9-опосредованного расщепления их общей векторной последовательности скелета. Во-вторых, вырезанные фрагменты ДНК встраиваются в линеаризованные CRISPR-совместимые векторы, совместимые с CRISPRshuttle, с помощью сборки Gibson. Наши результаты показывают, что эффективность CRISPRshuttle превышает 94% и что два исследователя могут создать около 300 плазмид за 7 дней с помощью CRISPRshuttle. CRISPRshuttle обеспечивает эффективный, адаптируемый и экономичный перенос фрагментов ДНК между векторами, значительно оптимизируя создание полногеномной библиотеки плазмид.

Введение

Построение полногеномных библиотек плазмид из доступных ресурсов является основой и предпосылкой для использования функциональной геномики для анализа биологических процессов. Современные методы клонирования с высокой пропускной способностью, включая системы клонирования Gateway, In-Fusion, Creator и Univector, требуют ПЦР-амплификации целевых фрагментов ДНК 1,2,3,4,5. Это предварительное условие влечет за собой рабочие процессы обработки фрагментов, охватывающие множество ....