Method Article

Челночное клонирование на основе CRISPR: высокопроизводительный метод клонирования

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол для высокопроизводительного метода клонирования, челночного клонирования на основе CRISPR (CRISPRshuttle cloning), который позволяет переносить интересующие фрагменты ДНК между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка полногеномных библиотек плазмид с использованием существующих геномных репозиториев служит ключевой предпосылкой для систематической функциональной характеристики генов в различных биологических процессах. Однако современные высокопроизводительные методики межвекторного переноса фрагментов ДНК требуют ПЦР-амплификации целевых последовательностей перед клонированием, что делает создание коллекций плазмид геномного масштаба технически сложным и трудоемким. Используя кассету CRISPRshuttle, мы разработали новый метод высокопроизводительного клонирования, челночное клонирование на основе CRISPR (клонирование CRISPRshuttle), который облегчает перенос многих фрагментов ДНК из донорских плазмид, имеющих идентичные последовательности основной цепи, в CRISPR-совместимый вектор без ПЦР-амплификации фрагментов ДНК. Здесь мы представляем протокол для CRISPRshuttle. Этот протокол включает в себя две последовательные реакции в пробирке перед бактериальной трансформацией. Во-первых, фрагменты ДНК-мишени вырезаются из донорских плазмид путем Cas9-опосредованного расщепления их общей векторной последовательности скелета. Во-вторых, вырезанные фрагменты ДНК встраиваются в линеаризованные CRISPR-совместимые векторы, совместимые с CRISPRshuttle, с помощью сборки Gibson. Наши результаты показывают, что эффективность CRISPRshuttle превышает 94% и что два исследователя могут создать около 300 плазмид за 7 дней с помощью CRISPRshuttle. CRISPRshuttle обеспечивает эффективный, адаптируемый и экономичный перенос фрагментов ДНК между векторами, значительно оптимизируя создание полногеномной библиотеки плазмид.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Построение полногеномных библиотек плазмид из доступных ресурсов является основой и предпосылкой для использования функциональной геномики для анализа биологических процессов. Современные методы клонирования с высокой пропускной способностью, включая системы клонирования Gateway, In-Fusion, Creator и Univector, требуют ПЦР-амплификации целевых фрагментов ДНК 1,2,3,4,5. Это предварительное условие влечет за собой рабочие процессы обработки фрагментов, охватывающие множество стандартизированных операций, включая, помимо прочего, разработку олигонуклеотидного праймера, очистку геля и валидацию последовательности с помощью секвенирования. В результате, создание полногеномных библиотек плазмид (например, библиотек сверхэкспрессии кДНК/ORF) стало трудоемким и трудоемким, что препятствует развитию функциональной геномики.

Ранее мы разработали CRISPRmass, высокопроизводительный метод клонирования, предназначенный для интеграции конкретных фрагментов ДНК (например, модуля UAS) в несколько плазмид, имеющих идентичные векторные магистрали6. Используя CRISPRmass, мы создали более 5500 плазмид UAS-кДНК/ORF на основе GAL4/UAS из библиотеки кДНК/ORF дрозофилы , Золотой коллекции Ресурсного центра геномики дрозофилы (DGRC)6. Тем не менее, CRISPRmass не обладает способностью переносить фрагменты ДНК между векторами, что ограничивает его применение в клонировании с высокой пропускной способностью.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали челночное клонирование на основе CRISPR (CRISPRshuttle) — новый высокопроизводительный метод, который облегчает перенос нескольких целевых фрагментов ДНК на целевые векторы из донорских плазмид7. Этот процесс требует только двух последовательных реакций в пробирке, тем самым обходя требование к специфической для фрагментов обработке дискретных мишеней ДНК7.

Протокол CRISPRshuttle включает в себя две последовательные реакции в пробирке (рис. 1). Во-первых, общие векторные последовательности донорских плазмид расщепляются Cas9/sgRNA для высвобождения целевых фрагментов ДНК. Затем эти фрагменты переносятся на кассету CRISPRshuttle с совместимым с CRISPRshuttle вектором через сборку Gibson для генерации окончательных плазмид. Кассета CRISPRshuttle содержит векторную основную последовательность ~20-40.н., которая фланкирует 5' и 3' концы фрагментов ДНК, происходящих из донорских плазмид, и один или два уникальных сайта узнавания фермента рестрикции, расположенных между этими фланкирующими последовательностями. CRISPR-совместимый вектор конструируют путем вставки кассеты CRISPRshuttle в вектор назначения, который впоследствии линеаризуется путем расщепления сайтов рестрикции внутри кассеты. Вектор-назначение должен нести ген устойчивости к антибиотикам, отличный от генов в донорских плазмидах; Если ген устойчивости идентичен, перед использованием его необходимо заменить на другой.

В этой статье мы представляем подробный протокол с использованием CRISPRshuttle для создания библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF. Этот процесс включает в себя перенос ORF человека из библиотеки CCSB-Broad Lentiviral Expression Library в вектор трансгенеза дрозофилы pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle оптимизирует создание полногеномных библиотек плазмид, тем самым облегчая функциональные геномные исследования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определение оптимальных сайтов расщепления Cas9/sgРНК, фланкирующих кДНК/ORF

  1. Получение кДНК/ORF плазмид
    1. Получение клонов кДНК/ORF из общедоступных репозиториев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются векторные клоны ORF pLX304 из широкой библиотеки экспрессии вирусов CCSB человека8.
    2. Изолируйте плазмиду с помощью набора для мини-подготовки к плазмиде и измерьте ее концентрацию с помощью спектрофотометра.
  2. Дизайн sgRNA
    1. Посетите веб-сайт CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Вставьте область векторной магистрали pLX304 с углом 20-100.о. фланкирующую конец ORF 3', в целевое поле.
    2. Выберите Drosophila melanogaster в качестве вида и нажмите кнопку Найти целевые участки. Выбирайте кандидатов на sgРНК, эффективность которых, по прогнозам, составляет более 80%.
  3. Получение sgRNA
    1. Синтезируйте прямой праймер (5'-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3'), где (N)20 представляет последовательность-мишень sgRNA, а обратный праймер sgRNA-REV (5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать грунтовки, очищенные от PAGE.
    2. Создание матрицы ДНК для транскрипции sgRNA in vitro (IVT) с помощью ПЦР. Готовят реакцию объемом 100 мкл, содержащую по 5 мкл матричного pX330 (плазмида Addgene 42230; 0,1 нг/мкл), прямого праймера (10 мкМ) и праймера sgRNA-REV (10 мкМ); 50 μл 2x высококачественной мастер-смеси для ПЦР; и 35 мкл сверхчистой воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).
    3. Амплифицируйте в термоамплификаторе ПЦР по следующей программе: 98 °C в течение 30 с; 5 циклов при температуре 98°С в течение 8 с, 52°С в течение 15 с, 72°С в течение 5 с; 30 циклов при 98 °C в течение 8 с, 72 °C в течение 20 с; 72 °C в течение 2 мин.
    4. Разрешите продукты ПЦР на 0,8% агарозном геле. Вырежьте полосу ~120.о. и очистите с помощью набора для экстракции геля.
    5. Приготовьте реакцию IVT объемом 10 μL, содержащую 300 нг очищенного фрагмента ДНК, 3,33 μл буферной смеси NTP, 0,67 μл смеси РНК-полимеразы T7 и сверхчистую воду, обработанную DEPC. Выдерживать при 37 °C в течение 4 часов.
    6. Количественно оцените неочищенную sgРНК с помощью спектрофотометрии, разбавьте до 20 нг/мкл сверхчистой водой, обработанной DEPC, и заморозьте при -80 °C в небольших аликвотах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка ДНКазой не требуется, так как остаточная ДНК не препятствует последующим реакциям.
  4. Оценка sgRNA
    1. Расщепляют плазмиду кДНК/ORF, содержащую основу вектора pLX304, с помощью фермента рестрикции. Разрешите полученные фрагменты ДНК с помощью 0,8% агарозного геля. Очистите субстрат ДНК с помощью набора для экстракции геля.
    2. Приготовьте реакционную смесь расщепления Cas9 объемом 5 мкл, содержащую 0,2 мкл 1,22 мкл S. pyogenes Cas9, 0,5 мкл 20 нг/мкл сгРНК, 0,015 пмоль субстрата ДНК, 0,5 мкл 10-кратного буфера Cas9 и сверхчистую воду, обработанную DEPC. Инкубировать реакцию при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Разрешите проблемы декольте с помощью 0,8% агарозного геля. Включите неиспользованный субстрат ДНК в качестве отрицательного контроля.
    4. Визуализируйте паттерны расщепления с помощью цифровой системы визуализации и выберите sgРНК с минимальным остаточным разрыхленным субстратом для последующих экспериментов (рис. 2).

2. Подменка гена устойчивости к антибиотикам вектора назначения

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе мы используем пример подмены гена устойчивости к ампициллину вектора назначения pBID-UASC с геном устойчивости к хлорамфениколу, тем самым генерируя хлорамфеникол-содержащий вектор назначения pBIDC-UASC.

  1. Удалите ген устойчивости к ампициллину из pBID-UASC.
    Примечание: Ген устойчивости к ампициллину pBID-UASC был удален путем расщепления Cas9 в сочетании с двумя sgRNA, f1Ori5-G4 (целевая последовательность: 5'-GTCACGACGTTAAAACGA-3') и Amp3-G2 (целевая последовательность: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), в результате чего образовалась линейная векторная магистраль pBID-UASC длиной 7 687.н. Эти две sgРНК нацелены на 5' вверх и 3' вниз по течению гена устойчивости к ампициллину соответственно.
    1. Приготовьте реакцию расщепления объемом 10 мкл, содержащую 0,03 пмоль pBID-UASC, 0,25 мкл 1,22 мкл S. pyogenes Cas9, 20 нг f1Ori5-G4, 20 нг Amp3-G2, 1 мкл 10x Cas9 Buffer и сверхчистую воду, обработанную DEPC. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепленная Cas9 плазмида без очистки подвергается непосредственно сборке Gibson.
  2. ПЦР-амплигенизация гена резистентности к хлорамфениколу.
    Примечание: Ген устойчивости к хлорамфениколу 840.н. был амплифицирован из плазмиды pMartini-Cam6 методом ПЦР с использованием f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC)
    GTCGCGTATGTATGATACATAAGGTT-3') и amp3-cam-r (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') грунтовки.
    1. Получить ген устойчивости к хлорамфениколу методом ПЦР, амплигуя ген устойчивости к хлорамфениколу 840.о. Организуйте ПЦР-реакцию объемом 20 μл, содержащую 2 μЛ pMartini-Cam (0,1 нг/μл), 1 μL f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL 5x буфера, 0,4 μL dNTPs (10 мМ), 0,4 μL высокоточной ДНК-полимеразы (2,5 единиц/μл), 11,2 μL сверхчистой воды.
    2. Проводят ПЦР с использованием следующих условий термоциклирования: 1 цикл 95 °C в течение 1 мин; 5 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с, при 46 °C в течение 15 с, при 72 °C в течение 20 с; 30 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с, 61 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 20 с; 1 цикл 72 °C в течение 2 мин. Проведите реакцию в термоамплификаторе.
    3. Разрешите продукты расщепления с помощью 0,8% агарозного геля и очистите фрагмент ДНК размером 840.н. с помощью набора для экстракции геля.
  3. Вставить ген устойчивости к хлорамфениколу в линеаризованный векторный остов pBID-UASC, в результате чего получится pBIDC-UASC.
    1. Проведите реакцию сборки Gibson объемом 2 μL: 0,008 пмоль гена устойчивости к хлорамфениколу 840.н., 0,002 пмоль линеаризованного pBID-UASC (шаг 2.1.1), 1,0 мкл мастер-смеси сборки Gibson 2x. Проводите реакцию при 50 °C в течение 1 ч.
    2. Трансформируйте 10 мкл компетентных клеток E. coli с 1 мкл продукта реакции лигирования. Выберите трансформаторы на пластине LB с добавлением хлорамфеникола 15 мкг/мл.
    3. Выберите одну колонию и подвергните ее последующей бактериальной культуре и мини-подготовке плазмид. Верифицируйте хлорамфенолсодержащий вектор назначения pBIDC-UASC с помощью рестрикционного анализа и секвенирования ДНК.

3. Построение CRISPRshuttle-совместимого вектора назначения

Кассета CRISPRshuttle содержит около 20-40.о. векторных последовательностей магистрали, которые фланкируют как 5', так и 3' концы целевых фрагментов ДНК, с одним или двумя уникальными сайтами рестрикции, расположенными между ними.

  1. Отжиг олигонуклеотидов с помощью термоамплификатора со следующей программой: 94 °C в течение 2 мин; 70 циклов по 52 с при (95-N) °C, где N представляет номер цикла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отожженная кассета CRISPRshuttle содержит 5'-вылеты, дополняющие EcoRI и XbaI.
  2. Лигируйте отожженную кассету CRISPRshuttle в EcoRI/XbaI-расщепленный вектор назначения pBIDC-UASC для генерации совместимого с CRISPRshuttle вектора назначения pBIDC-UASC-pLXvect.
    Примечание: Это лигирование удаляет исходные сайты EcoRI и XbaI в нескольких сайтах клонирования, делая сайты EcoRI и XhoI в середине кассеты CRISPRshuttle уникальными в окончательном векторе. Уникальные сайты рестрикции в кассете CRISPRshuttle позволяют линеаризировать вектор назначения, совместимый с CRISPRshuttle.
    1. Приготовьте реакцию лигирования объемом 5 мкл, содержащую 14 нг 8,451.н. расщепленного EcoRI/XbaI-расщепленного pBIDC-UASC, 0,02 пмоль отожженной кассеты CRISPRshuttle, 0,5 мкл 10x Т4 буфера ДНК-лигазы, 0,3 мкл Т4 ДНК-лигазы. Инкубируйте реакцию в течение ночи при 16 °C.
    2. Трансформируйте 10 мкл компетентных клеток E. coli с 1 мкл продукта реакции лигирования. Выберите трансформаторы на планшете LB с добавлением 15 мкг/мл хлорамфеникола и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
    3. Выберите одну колонию и подвергните ее последующей бактериальной культуре и мини-подготовке плазмид. Верифицируйте совместимый с CRISPRshuttle вектор назначения pBIDC-UASC-pLXvect с помощью рестрикционного анализа и секвенирования ДНК.

4. Генерация плазмид UAS-кДНК/ORF с помощью CRISPRshuttle

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол CRISPRshuttle включает в себя двухступенчатые реакции в пробирке, проводимые параллельно перед бактериальной трансформацией (Рисунок 1).

  1. Реакция в пробирке шаг 1
    1. Вырезать ORF из плазмид pLX304-ORF путем расщепления векторного каркаса с помощью Cas9 в сочетании с двумя sgRNA, pLX304-CMV-G16 (целевая последовательность: 5'-GAGCTCTGGCTAACTGTC-3', локализованная в векторном скелете pLX304, фланкирующем ORF 5'-конец) и pLX304-3'-G1 (целевая последовательность: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', локализованная в векторном скеле pLX304, фланкирующем конец ORF 3').
      1. Приготовьте исходную смесь для заданного числа (N) реакций разложения следующим образом: (N+1) x 0,4 мкл 1,22 мкл S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 мкл 80 нг/мкл pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 мкл 80 нг/мкл pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 мкл 10x Cas9 буфера и (N+1) x 1,45 мкл сверхчистой воды, обработанной DEPC.
      2. Тщательно перемешайте и раскрутите мастер-микс. Аликвотируйте 3,75 мкл мастер-смеси на каждую пробирку. Добавьте 0,75 мкл 0,03 мкМ плазмиды pLX304-ORF в каждую пробирку. Тщательно перемешайте и инкубируйте реакции при 37 °C в течение 1 часа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте каждую плазмиду pLX304-ORF до концентрации 0,03 μМ сверхчистой водой, обработанной DEPC. Если концентрация меньше 0,03 мкМ, добавьте плазмидную ДНК непосредственно в реакцию. Расщепленные Cas9 плазмиды не нуждаются в очистке после реакций расщепления и могут быть непосредственно использованы для последующей сборки Gibson.
  2. Реакция в пробирке шаг 2
    1. Вставьте вырезанные ORF в совместимый с CRISPRshuttle вектор назначения pBIDC-UASC-pLXvect с помощью сборки Gibson, в результате чего получаются плазмиды UAS-cDNA/ORF.
      1. Дайджест pBIDC-UASC-pLXvect с EcoRI и XbaI. Линеаризованный pBIDC-UASC-pLXvect отделить с помощью электрофореза в агарозном геле и очистить с помощью набора для экстракции геля.
      2. Приготовьте мастер-микс для заданного числа (N) реакций сборки Gibson следующим образом: (N+1) x 0,14 мкл линеаризованных pBIDC-UASC-pLXvect 3,36 мкМ и (N+1) x 1,8 мкл мастер-микса Gibson.
      3. Тщательно перемешайте и раскрутите мастер-микс. Внесите 1,94 мкл мастер-смеси в каждую пробирку. Добавьте в каждую пробирку по 1,66 мкл расщепленной Cas9 плазмиды. Тщательно перемешайте и инкубируйте реакции при 50 °C в течение 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните основную смесь и лед в пробирках перед инкубацией при температуре 50 °C.
  3. Трансформируйте кишечную палочку с помощью сборочных изделий Gibson.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты сборки Gibson не требуют очистки перед трансформацией E. coli .
    1. Разморозьте бактериальные компетентные клетки на льду. Аликвотируйте 10 мкл клеток на каждую предварительно охлажденную 1,5 мл пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуются компетентные бактериальные клетки с эффективностью трансформации не менее 1 ×10 8 КОЕ/мкг ДНК pUC19.
    2. Аккуратно смешайте 10 мкл компетентных ячеек с 1 мкл сборочных изделий Gibson. Выложить на лед на 30 минут.
    3. Тепловой шок при температуре 42 °C в течение 1 минуты, а затем охладить на льду в течение 2 минут.
    4. Добавьте 100 μL предварительно подогретой среды SOC (37 °C) в каждую пробирку. Встряхивайте при 250 об/мин в течение 1 часа при 37 °C.
    5. Поместите клетки на LB-планшеты, содержащие 15 мкг/мл хлорамфеникола. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение этих процедур в больших масштабах обычно занимает несколько часов. Если не указано иное, держите реагенты и реакционные установки на льду.
  4. Верификация плазмид UAS-кДНК/ORF.
    1. Инокулируйте одну колонию в 4,5 мл среды LB с концентрацией хлорамфеникола 15 мкг/мл. Встряхните при 250 об/мин в течение ночи при температуре 37 °C.
    2. Выделите плазмидную ДНК с помощью мини-набора для подготовки плазмид.
    3. Приготовьте реакцию рестрикционного расщепления объемом 20 мкл для каждой плазмиды, содержащей 300-500 нг плазмидной ДНК, 0,3 мкл PvuII, 2 мкл 10-кратного буфера и сверхчистую воду. Проводите реакции при 37 °C в течение 1 ч.
    4. Растворяют фрагменты ДНК с помощью 0,8% агарозного геля. Изображение в ультрафиолетовом свете (рис. 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали CRISPRshuttle для создания коллекции плазмид UAS-кДНК/ORF, охватывающей 1397 генов человека, которые консервативны у дрозофилы7. Рестрикционный анализ показал, что CRISPRshuttle достигает эффективности 94,5% при использовании CRISPRshuttle-совместимых векторов назначения, содержащих две повторяющиеся последовательности, и 96,1% при использовании векторов назначения без повторяющихсяпоследовательностей. Наши данные показали, что в целом ~300 плазмид ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важнейшим этапом в протоколе CRISPRshuttle является подготовка линеаризованных CRISPRshuttle-совместимых векторов назначения. Чтобы обеспечить полное переваривание, используйте избыток ферментов рестрикции для переваривания переносчиков, и настоятельно рекомендуется очистка переваренных векторов гелем. Другим важным этапом является расщепление плазмид кДНК/ORF с помощью Cas9. Если построение плазмиды не удается, используйте электрофорез в агарозном геле, чтобы проверить, были ли высвобож...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом Национального фонда естественных наук Китая (32071135) и стартап-фондом от аффилированной больницы Наньхуа Медицинской школы Хэнъяна Университета Южного Китая. Мы благодарны профессору Фэн Чжану за любезное предоставление плазмиды pX330 и доктору Сяохуэй Цай за техническую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Порошок агараХимбазаКБС-001Н
АгарозаСангонA600014-0100
Автоматизированная цифровая система анализа изображений геляТанонТанон-2500Б
ХлорамфениколСангонA100230-0010
Набор для экстракции геля E.Z.N.A.ОмегаД2500-02
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IОмегаД6942-02
ЭкоРИ-ВЧКЛЮВР3101С
Gibson Assembly Master MixКЛЮВЭ2611С
HiScribe T7 Быстрый набор для синтеза высокопроизводительной РНККЛЮВЕ2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixКЛЮВЕ2621Х
Термоамплификатор ПЦРЛонгГенТ20
ДНК-полимераза Platinum SuperFi IIТермо Сайентиал12361010
PvuII-HFКЛЮВР3151Л
Q5 Hot Start Высококачественный мастер-микс 2xКЛЮВМ0494
S. pyogenes Cas9GenScriptЗ03386
Встряхивающий инкубаторЧжичуZQLY-180В
СпектрофотометрСимадзуБиоСпек-Нано
Т4 ДНК-лигазаКомпания PromegaМ1801
Химически компетентная клетка Trans 10ТрансГенКД101-02
ТриптонОксоидныйЛП0042
XbaIКЛЮВР0145С
Дрожжевой экстрактОксоидныйЛП0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles