Методическая статья

В естественных условиях Бесконтактное биотинилирование для изучения взаимодействия белков у Paramecium tetraurelia

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе представлен метод in vivo ковалентного присоединения биотина к белкам, основанный на их близости к биотин-лигазе, слитой с представляющим интерес белком. Эта модификация позволяет селективно обогащать белки с использованием гранул стрептавидина по мере необходимости в исследованиях взаимодействия белков.

Аннотация

Paramecium является основным модельным организмом для изучения молекулярных механизмов, участвующих в запрограммированных геномных перестройках и элиминации транспозонов во время мейотического размножения. Многие детали этого процесса остаются загадкой из-за сложности задействованных молекулярных механизмов и переходных белок-белковых взаимодействий. В данной работе мы представляем метод мечения белков биотином с временным разрешением, расположенным рядом с интересующим белком-мишенью. Метод может быть легко адаптирован к различным мишеням, поскольку биотинилирование достигается путем инъекции ДНК, кодирующей целевой белок, слитый с сконструированной биотин-лигазой. Слитая конструкция экспрессируется промотором эндогенного гена, что позволяет создать специфичный для стадии профиль экспрессии, аналогичный профилю экспрессии нативного белка. Примечательно, что ковалентно присоединенный биотиновый фрагмент позволяет селективно обогащать меченые белки с помощью гранул, покрытых стрептавидином. Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания мы показываем, что для эффективного мечения требуется добавление биотина в культуру. Вектор экспрессии, созданный по принципу plug-and-play, в сочетании с продемонстрированной здесь эффективной процедурой инъекции позволяет быстро генерировать линии Paramecium , экспрессирующие модифицированный белок. Продемонстрированная здесь процедура биотинилирования может быть продолжена с помощью масс-спектрометрии для идентификации обогащенных белков, которые содержат взаимодействующих партнеров целевого белка. Бесконтактное биотинилирование может упростить и ускорить открытие белок-белковых взаимодействий в Paramecium и активизировать усилия по пониманию механизма редактирования его генома.

Введение

Реснитчатый одноклеточный организм Paramecium tetraurelia содержит два различных типа ядер: ядро зародышевой линии для долгосрочного хранения генетической информации и соматическое ядро для физиологическихфункций клетки. Половое размножение в этом организме требует формирования нового соматического генома. Этот процесс включает в себя необратимое иссечение более 45 000 фрагментов ДНК из соматического генома2, которые включают транспонируемые элементы3 и другие повторы. Особенно поразительно то, что события иссечения выполняются с точностью до одной пары оснований1. Такая точность биологически необходима, поскольку вырезанные фрагменты ДНК разрушают кодирующие белки области4, и любое неправильное иссечение может вызвать мутации сдвига рамки считывания, преждевременные стоп-кодоны или изменение кодирующей белковой последовательности. Сложный механизм сравнения РНК позволяет клетке дифференцировать последовательности, которые необходимы в новом соматическом геноме. Он инициируется транскрипцией всего генома зародышевой линии5 с последующей обрезкой до размера 25.о. 6, транспортировкой в старый соматический геном7, где все комплементарные РНК отбрасываются8. Оставшиеся мРНК, у которых отсутствуют комплементарные последовательности в старом соматическом геноме, далее транспортируются в новый развивающийся соматический геном, где они выравниваются с любыми последовательностями, ограниченными зародышевой линией, и направляютих эксцизию. Этот сложный многоступенчатый процесс требует точного и своевременного взаимодействия многих клеточных компонентов, в частности, транзиторных слабых взаимодействий при переходе малых РНК между различными ядрами10,11. Ранее попытки понять молекулярную механику процесса предпринимались с использованием нокдаун-экспериментов, чтобы определить, являются ли предполагаемые компоненты существенными для процесса, с последующими подходами иммунопреципитации для раскрытия взаимодействий основных белков 12,13,14. В то время как этот метод полезен для обнаружения сильного и непрерывного связывания, которое также выдерживает нефизиологические условия во время вытягивания, обнаружение слабых и переходных взаимодействий может потребовать утомительной оптимизации. Из-за потенциально преходящего характера многих взаимодействий, участвующих в процессе редактирования генома, методы in vivo могут улучшить обнаружение таких взаимодействий. Кроме того, некоторые белки не могут быть эффективно солюбилизированы во внеклеточныхусловиях15, что представляет собой проблему, которая может быть решена с помощью модификаций белков, основанных на взаимодействии in vivo, таких как близкая маркировка биотином.

В данной статье мы описываем новый метод, который позволяет проводить специфическое биотинилирование in vivo белков, локализованных близко к желаемому белку-мишени. Ковалентная модификация биотина может быть использована для эффективного обогащения с использованием подходов на основе стрептавидина. Разработка этого метода была достигнута путем использования биотинлигазы TurboID16 для проведения исследований взаимодействия белков в Paramecium tetraurelia. Наш подход может быть легко применен к любому белку-мишени, следуя шагам, изложенным в протоколе. Таким образом, в данной статье представлена эффективная и масштабируемая стратегия бесконтактного биотинилирования, которая может быть использована для высокопроизводительных протеомных исследований на известных простейших модельных организмах.

Протокол

1. Общие методы

  1. Получите буферы, реагенты и другие материалы, как указано в таблице 1.
  2. Культивирование моноклональных линий Paramecium , как описано ранее17. Короче говоря, перенесите одну клетку в новую депрессионную лунку, содержащую бактериизированную светлую среду (0,8 мкг/мл β-ситостерин), чтобы плотность клеток оставалась ниже 500 клеток/мл, чтобы предотвратить преждевременную инициацию мейотического цикла. При 50 делениях клеток перенесите клетки в бактериизированную культуру богатой среды (с 0,8 мкг/мл β-ситостерина) и оставьте до тех пор, пока все бактерии не будут употреблены, тем самым вызывая половое размножение (аутогамию)18.
    Примечание: По завершении цикла полового размножения клетки будут оставаться в неделящемся поставтогамном состоянии до тех пор, пока не будет получен новый источник питательных веществ.
  3. Конструирование гибридных белков генов-мишеней с использованием вектора, содержащего оптимизированную для кодонов последовательность 3x HA turboID с сайтами разрезания фермента рестрикции.
    1. Проведите ПЦР-амплификацию гена-мишени и его промоторной области из геномной ДНК с использованием праймеров, разработанных с выступающими элементами, которые кодируют подходящие сайты рестрикции.
    2. Вставьте продукт с использованием стандартного рестрикционного разложения в совместимые с кадром участки разреза19 перед областями кодирования turboID.
  4. Секвенирование, верификация и амплификация сконструированной плазмидной ДНК в E.coli DH5α. Изолируйте плазмиду с помощью набора для плазмиды midiprep и линеаризируйте 100 г плазмидной ДНК путем рестрикционного расщепления.
  5. Очистите с помощью фенол-хлороформной экстракции, затем профильтруйте через центробежный фильтр12. Выполните осаждение этанола и растворите гранулу ДНК в воде до получения концентрации 5 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК может быть введена в соматические ядра клеток Paramecium с помощью следующей процедуры микроинъекции.

2. Микроинъекция в соматическое ядро (МАС)

  1. Перенесите клетку из поставтогамной культуры, полученной на этапе 1.2, на свежее депрессионное предметное стекло с бактериизированной легкой средой с 0,8 мкг/мл β-ситостерола. Инкубируйте при температуре 27 °C в течение двух дней до инъекции для восстановления клеток.
  2. С помощью стереомикроскопа перенесите клетки из восстановленной культуры на свежеприготовленное углубительное стекло, заполненное промывочной средой.
  3. Пока элементы находятся в моющем средстве, добавьте 20 μL ddH2O на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
  4. Добавьте 200 μL минерального масла на верхнюю часть покровного стекла.
  5. После этого перенесите отдельные промытые ячейки в виде капель под минеральное масло, используя как можно меньший объем жидкости. Поместите до 20 пузырьков, содержащих одну клетку, на предметное стекло, а затем поместите подготовленное предметное стекло на пьедестал инъекционного микроскопа.
  6. Прикрепите аспирационную иглу и переместите ее в нужное положение, затем запустите роботизированную руку и инъекционную машину.
  7. С помощью наконечника для пипетки микрозагрузчика добавьте в иглу для инъекций 2-3 мкл раствора ДНК, приготовленного на шаге 1,5. Прикрепите иглу к роботизированному манипулятору и переместите его в нужное положение, затем подключите к клапану давления инъекционной машины.
  8. С помощью роботизированной руки поместите иглу для инъекции в пустую каплю воды на предметном стекле. Затем нажмите Clean , чтобы продуть оставшийся воздух в игле для инъекций, пока не будет наблюдаться поток ДНК.
  9. Перейдите к капле, содержащей клетку, затем опустите аспирационную иглу. Аккуратно удалите жидкость (воду) из этой капли до тех пор, пока клетка не будет обездвижена.
  10. Поднимите аспирационную иглу и опустите инъекционную иглу, затем переключитесь на большее увеличение.
  11. Убедитесь, что соматическое ядро (МАС) теперь видно как более темная область, лишенная пищевых вакуолей (см. рисунок 1в), в которую необходимо ввести иглу для инъекции.
  12. Стремитесь полностью проникнуть в MAC с помощью инъекционной иглы и медленно втягивайте иглу в течение нескольких секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла расположена внутри МАС, ДНК будет течь в МАС из-за постоянного давления воздуха, создаваемого инъекционной машиной. Диффузная вакуоль, состоящая из введенной ДНК, может стать видимой в границах МАС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно вводить одну и ту же клетку несколько раз, чтобы обеспечить успешную инъекцию.
  13. После того, как инъекция клеток завершена, опустите аспирационную иглу, содержащую аспирированную воду, на шаге 2.9. Измените поток, чтобы вернуть достаточно воды в каплю до тех пор, пока клетка снова не начнет двигаться.
  14. Продолжайте до тех пор, пока не будут обработаны все капли, содержащие клетку.
  15. Восстановите каждую введенную клетку, собрав капли из предметного стекла и перенеся каждую из них в отдельную лунку, заполненную бактеризированной легкой средой с 0,8 мкг/мл β-ситостерола.
  16. Инкубируйте при температуре 27 °C в течение ночи, перенесите по одной ячейке из каждой лунки в новую лунку и поддерживайте исходную лунку при температуре 18 °C в качестве резервной.
  17. Культивируйте перенесенные клетки в течение ночи при 27 °C в течение 1 дня, а затем перенесите по 5 клеток из каждой моноклональной лунки в ПЦР-пробирку. Используйте конструкционно-специфичные праймеры для амплификации, чтобы проверить наличие введенной ДНК в клетках.

3. Иммунофлюоресцентное окрашивание для проверки правильности локализации белка и функции биотинлигазы

  1. Культивируют выбранные ПЦР-положительные клоны в 20 мл бактериизированной среды с 0,8 мкг/мл β-ситостерина.
  2. После того как среда станет менее мутной, соберите из культуры образец объемом 50 мкл. Добавьте 1 мкл раствора DAPI (0,1 мг/мл) и 1 мкл ЭДТА (0,5 мМ) для окрашивания ДНК, чтобы проверить начало аутогамии.
    Примечание: Аутогамия обычно начинается при плотности клеток 2000 клеток/мл.
  3. Если требуется биотинилирование, добавьте в питательную среду биотин до конечной концентрации 500 мкМ в течение не менее 1 ч перед сбором клеток.
  4. Соберите клетки на соответствующей стадии развития с помощью центрифуги для измерения масла, оснащенной грушевидными пробирками при плотности 280 x g в течение 2 минут. Выбросьте питательную среду и добавьте PBS в пробирки, затем снова центрифугируйте и удалите PBS.
  5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS и переложите в прозрачную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  6. Приготовьте 3,7% раствор PFA в PBS из 37% исходного раствора.
  7. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 0,5 мл 3,7% PFA и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре на ротаторе с трубкой.
  8. Центрифугируйте при 600 х г в течение 1 минуты до образования видимой гранулы. Выбросьте раствор PFA в специальный контейнер для отходов.
  9. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл 50 мМ глицина в PBS. Инкубировать в течение 5-10 мин на ротаторе с трубкой.
  10. Центрифугируйте при 600 x g в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 0,8 мл 1x PBS. По желанию промойте еще раз PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе элементы могут храниться при температуре 4 °C, если это необходимо.
  11. Центрифугируйте при 600 x g в течение 1 минуты, удалите PBS и добавьте 500 μL 0,5 % Triton X-100 в PBS. Инкубировать в течение 20 минут на ротаторе с трубкой.
  12. Центрифугируйте до тех пор, пока гранула не станет видимой (1000 x g в течение 2 минут), удалите раствор Triton X-100 и снова суспендируйте клетки в PBS.
  13. Приготовьте 5% раствор БСА в PBS в соответствии с требуемым объемом антител.
  14. Удалите промотер PBS с клеток и добавьте в клетки 100 мкл первичного антитела, разведенного в 5% BSA в PBS. Отрегулируйте время инкубации в соответствии с используемым антителом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства антител достаточно инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре.
  15. Центрифугируйте при 600 x g, удалите первичный разведение антител и промойте клетки 500 μл PBS.
  16. Добавьте 100 мкл вторичного антитела, разведенного в 5% BSA в PBS. Отрегулируйте время инкубации; Как правило, достаточно 1 часа при комнатной температуре. Накройте трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить флуорофор от света.
  17. Добавьте 1 мкл раствора DAPI (0,1 мг/мл) в течение последних 10 минут инкубации с вторичным антителом.
  18. Центрифугируйте при 600 x g в течение 1 минуты, удалите раствор для окрашивания и дважды промойте PBS. Оставьте в пробирке 20 мкл второй промывки и ресуспендируйте клетки.
  19. Установите 10 μL на предметное стекло для осмотра под микроскопом.

4. Селективное обогащение биотинилированными белками

  1. Соберите 1 x 106 клеток на правильной стадии развития, как описано в пункте 3.4.
  2. Ресуспендируйте гранулу в 3 мл лизисного буфера.
  3. Переложите в гомогенизатор и лизируйте клетки 100 ударами пестика.
  4. Переведите лизат в две микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте при температуре 21 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  5. Уравновесить магнитные шарики, покрытые стрептавидином, смешав 20 мкл (на образец) суспензии импульсно-вихревых суспензий гранул с 1 мл буфера для лизиса в микроцентрифужной пробирке и инкубируя в течение 2 мин.
  6. Удалите буфер для лизиса с шариков с помощью магнитной подставки и повторно суспендируйте в буфере для лизиса.
  7. Повторите шаг 4.6.
  8. Удалите буфер для лизиса и смешайте уравновешенные шарики с надосадочной жидкостью (осветленным лизатом) из шага 4.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные концентрации соли и процентное содержание моющих средств для связывания с шариками могут отличаться и должны быть проверены экспериментально. Кроме того, можно инкубировать гранулу из 4,4 в 50 мкл 2% SDS в течение 10 мин при 60 °C для извлечения белков из нерастворимой фракции с последующим центрифугированием при 21 000 х г в течение 10 мин. Добавьте этот экстракт к осветленному лизату и бусинам.
  9. Инкубировать в течение 1-2 ч при комнатной температуре на ротаторе с трубкой.
  10. Кратковременно центрифугируйте (<1 с) пробирку, чтобы собрать всю жидкость на дно пробирки, соберите шарики на магнитной подставке, а затем замените надосадочную жидкость (проточный) на промывочный буфер 1.
  11. Инкубируйте в течение 5 минут на вращателе трубок, а затем повторите, как в шаге 4.10, для второго промывки.
  12. Замените буфер промывки 1 на буфер промывки 2 на две дополнительные промывки (мойка 3 и 4).
  13. Замените буфер промывки 2 на буфер промывки 3 на две последние промывки (промывка 5 и 6).
  14. После удаления окончательной стирки храните шарики при температуре -20 °C перед последующей обработкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики могут быть элюированы буфером Laemmli для вестерн-блоттинга и представлены в службы масс-спектрометрии для получения пептидного препарата на шариках для идентификации белка.

Результаты

В нашем протоколе описан упрощенный способ введения ковалентной модификации биотина в белки, находящиеся вблизи целевого белка в Paramecium (Рисунок 1А). Эти биотинилированные белки затем могут быть дополнительно обогащены с помощью стрептавидина-пулдауна и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии20. Чтобы продемонстрировать практический вариант использования метода, мы применили протокол к белку Nowa1. Этот белок необходим для процесса геномной перестройки и имеет динамические изменения в своей локализации12. На ранних стадиях он остается в старом соматическом ядре и фрагментах, но позже располагается в новом развивающемся ядре. Примечательно, что наши предыдущие попытки опосредованного метками обогащения взаимодействующих белков Nowa1 не увенчались успехом (неопубликованные результаты). Вероятно, это было связано со сложными повторами, имеющими сходство с прионным белком PrP27, которые могли вызывать самоагрегацию в неоптимальных условиях во время процедуры вытягивания21. Мы ПЦР амплифицировали кодирующую область Nowa1 вместе с ее восходящей некодирующей областью, содержащей промотор. Затем продукт был вставлен в кадр с помощью кодон-оптимизированной последовательности кодирования turboID (Рисунок 1B). Чтобы избежать трансген-индуцированного сайленсинга, вызванного инъекцией кольцевой ДНК в Parameciumвектор был линеаризован перед инъекцией. Линеаризованную и очищенную ДНК затем микроинъецировали в соматическое ядро (МАС), как описано в данном протоколе. Дисперсная капля, ограниченная более темной областью соматического ядра, становилась видимой в некоторых успешных инъекциях (Рисунок 1С). Успешная инъекция и амплификация ДНК клетками во время деления клеток были затем проверены с помощью ПЦР. Как и ожидалось, 40-50% клеток оказались положительными на введенную ДНК конструкции Nowa1 (ожидаемый размер продукта 685.о.) (Рисунок 2). Следующим шагом была проверка наличия белка, кодируемого введенной ДНК. Поскольку вектор-реципиент содержит последовательность turboID, окруженную тройной HA-меткой, мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание для обнаружения метки. Это позволило нам проверить, экспрессируют ли введенные клетки гибридный белок и правильно ли он локализован. Мы использовали клетки поздней стадии, которые показали локализацию гибридного белка в двух новых развивающихся ядрах, как это ранее наблюдалось для белка дикого типа Nowa112. Отдельные введенные клеточные линии показали разные уровни гибридного белка (Рисунок 3). Более низкий уровень экспрессии может быть полезен для приложений, где желателен уменьшенный фон, но в этом случае мы выбрали максимальный сигнал и продолжили работу с клоном 2, который показал наибольшую экспрессию. Затем мы собрали образцы на разных стадиях развития, чтобы отследить локализацию гибридного белка. Белок был первоначально локализован в мотках, образованных из старого соматического ядра, и в отделенных ядерных фрагментах на ранних стадиях автогамии. При появлении ядерного анлагена гибридный белок перешел к этим новым развивающимся ядрам (Рисунок 4). Чтобы стимулировать биотинилирование проксимального протеома на разных стадиях, мы добавляли в культуру 500 мкМ биотина в течение 2 ч перед забором клеток на IF. Мы визуализировали меченые биотином белки с помощью окрашивания ПЧ с использованием стрептавидина с флуоресцентной меткой. Наблюдаемый сигнал соответствовал локализации меченого HA гибридного белка. Важно отметить, что удалось получить специфичную для разных стадий развития биотинилирования биотинилирование, так как для достижения значительного биотинилирования достаточно даже короткой инкубации с биотином (Рисунок 4). Кроме того, без добавления дополнительного биотина в введенных клетках было обнаружено лишь незначительное биотинилирование. В клетках дикого типа добавление дополнительного биотина не вызывало обнаруживаемого биотинилирования (Рисунок 5А). Примечательно, что биотин не просто накапливался в развивающемся ядре, так как даже в условиях денатурации он остается прикрепленным к белкам. (Рисунок 5B). С помощью магнитных шариков, покрытых стрептавидином, удалось селективно обогатить биотинилированные белки (Рисунок 6). Обогащенные белки могут быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. В этих последующих экспериментах по идентификации белков культура без добавок, а также клетки, экспрессирующие неслитый белок turboID, могут быть использованы в качестве фоновых контрольных групп.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор процедуры бесконтактного биотинилирования у P. tetraurelia. (А) Обобщенный план протокола. (B) Принцип клонирования вектора-реципиента turboID plug-and-play и результирующая конструкция для гибридного белка Nowa1. Область 3'UTR, используемая в этой плазмиде, получена из CenH3a. (В) Видимая диффузная капля, содержащаяся в более темной области, соответствующей соматическому ядру (МАС), после успешной инъекции ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: ПЦР-тест для успешной инъекции. Анализ ПЦР-реакции в агарозном геле для продукта с прямым праймером, специфичным для предшествующей области, кодирующей резистентность к ампициллину (начало ампициллина), и обратным праймером, комплементарным Nowa1. Стрелка показывает ожидаемый размер продукта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентное окрашивание для проверки правильной локализации гибридного белка turboID. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием первичного антитела кролик-анти-HA (1:100) и козьего анти-кроличьего Alexa Fluor 568 конъюгированного вторичного антитела (1:1000) моноклональных линий Paramecium с положительным сигналом ПЦР для ДНК, кодирующей гибридный белок Nowa1-HA-turboID. Масштаб 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Nowa1-специфичное биотинилирование на разных стадиях развития. Иммунофлуоресцентное окрашивание моноклональной линии 2 на прогрессирующих стадиях формирования нового соматического ядра. В питательную среду добавляли 500 мкМ биотина для оптимальной активности turboID. HA-tag детектировали, как показано на рисунке 3, а биотин детектировали с помощью стрептавидина-FITC (1:200). Масштаб 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Эффективное близчайшее мечение с помощью turboID требует дополнительного биотина в культуре. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание wt и введенных клеток на поздней стадии развития, показывающее экспрессию Nowa1-HA-turboID и наблюдаемое биотинилирование с помощью 500 мкМ дополнительного биотина. HA-tag и биотин были обнаружены, как показано на рисунке 4. Масштаб 20 мкм. (B) Вестерн-блоттинг на биотин с использованием HRP-стрептавидина wt-клеток, культивируемых с 500 мкМ биотином, и введенных клеток turboID с биотином и без него. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Обогащение биотинилированных белков магнитными шариками стрептавидина. Вестерн-блоттинг на биотин образцов из эксперимента с использованием магнитных шариков, покрытых стрептавидином. Образцы: лизат клеток Nowa1-HA-turboID (вход), несвязанная фракция (проточный), этапы промывки (промывка 1-6) и белки, связанные с гранулами (выход). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает технику присоединения биотиновой группы к белкам в непосредственной близости от представляющего интерес белка. Основываясь на сильном сродстве стрептавидина к биотину, это позволяет быстро и эффективно обогащать модифицированные белки. В сочетании с быстрой адаптивностью к различным белкам, представляющим интерес, представленный метод может облегчить изучение мультибелковых взаимодействий в Paramecium. Этот модельный организм хорошо зарекомендовал себя для исследований взаимодействий транспозона и хозяина во время мейотического размножения3. Кроме того, он может предложить новые молекулярные инструменты для точного редактирования генома, поскольку он вырезает более 45 000 последовательностей во время запрограммированных геномных перестроек. Процесс управляется сложным многокомпонентным механизмом, который позволяет проводить точное РНК-направленное иссечение этих фрагментов ДНК с воспроизводимым сайтом расщепления в каждом поколении. Представленный здесь метод предлагает два основных преимущества для изучения этого процесса. Это упрощает открытие транзиторных белок-белковых взаимодействий. Кроме того, вектор-реципиент plug-and-play позволяет быстро создавать множество функциональных гибридных белков. Поскольку на разных стадиях в процесс, вероятно, вовлечено множество факторов, адаптивность позволяет выявить интерактомы многих белков, которые могут быть частью механизма эксцизии. Важно отметить, что слитые конструкции экспрессируются промотором эндогенного гена и, следовательно, тесно согласуются с ходом нативной экспрессии во времени. Кроме того, продемонстрированное использование микроинъекций для доставки экзогенного генетического материала в этот модельный организм позволяет создавать гомогенные моноклональные популяции. Такие популяции позволяют более синхронно инициировать процесс аутогамии, в ходе которого происходит развитие нового соматического ядра.

Несмотря на то, что продемонстрированная процедура введения конструкций синтеза turboID является надежной, в последующих протоколах обогащения белков может потребоваться специфическая оптимизация из-за механизма биотинилирования. Поскольку слитый фермент turboID генерирует реактивные фрагменты биотин-АМФ, которые диффундируют от фермента, они потенциально могут реагировать с любой нуклеофильной группой поблизости. Таким образом, существенным шагом в данной методологии является идентификация истинных партнеров по взаимодействию по фоновым попаданиям и по белкам, локализованным в общей окрестности гибридного белка turboID, которые не являются фактическими партнерами по взаимодействию. Чтобы добиться этого, можно регулировать вариацию параметров, например, продолжительность инкубации с биотином16. Кроме того, экспериментальная установка, включающая контрольную группу без дополнительного биотина в среде, может указывать на фоновое связывание. Как показано, такая контрольная группа будет генетически идентична реальному эксперименту, но биотинилирование с помощью turboID сильно снижено из-за низкого содержания биотина. Дополнительными важными контрольными группами могут быть необъединенный белок turboID, а также группа дикого типа, культивируемые в среде с добавлением биотина. Кроме того, несмотря на то, что сильное сродство стрептавидина к биотину является значительным преимуществом по сравнению с антителами, различные концентрации соли и детергента, вероятно, оказывают влияние на чистоту и эффективность обогащения.

Превосходные протеомные подходы могут улучшить наше понимание уникальных молекулярных механизмов Paramecium и, возможно, других инфузорий. Молекулярные компоненты с новыми функциями обещают быть перепрофилированными в качестве инструментов в синтетической биологии и, таким образом, могут способствовать биотехнологическому развитию22,23. Сконструированные синтетические белки часто состоят из комбинаций функциональных доменов с новыми свойствами, которые позволяют применять их в ранее невозможных терапевтических целях. Сконструированные белки также могут найти применение в процессах фармацевтического производства24. Особый интерес для таких разработок представляет РНК-направленная система эксцизии генома от Paramecium. Эта система обеспечивает РНК-зависимое эксцизию тысяч фрагментов ДНК с точностью до одного нуклеотида25. Такие параметры делают интересным повышение точности редактирования генома в клетках человека. Представленный метод бесконтактного биотинилирования может быть использован для ускорения и содействия открытию новых белковых компонентов и их взаимодействий в мультибелковых молекулярных машинах.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована грантом DigiK Бернского университета и грантом Швейцарского национального научного фонда 229074 присужден B.-A.S. и грант Швейцарского национального научного фонда 214853 присужден M.N.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроскоп Axiovert 40 CFL (объективы 10x, 40x)Цейссд/о
В-ситостеролСигма Олдрич567152
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Сигма ОлдричА9647
Масло CellTramЭпендорфд/о
кодон-оптимизированная последовательность ДНК 3xHA-turboIDТвист бионаукид/оGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTATTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAACbr/ AAAAGATAATACTGTACCTatctcttaaabr/ ATTAATCGCTTATTATTAGCTAATGGbr/ TGAATTTCATTCTGGTGAACAA TTGGTGAAACTTTAGGTATCA
AGAGCTGCTATTAATAAACAT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTTTTTACCTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTATTATTATT
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCTCTTTTTtt
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTATTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGGTGCTGGTATTATTAATTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
[ TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTATTATTAGAAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPIСигма ОлдричД9542
ЭДТАНаучный ФишерAAA151610B
Советы по микрозагрузчикам epT.I.P.S.Эпендорф5242956003
ЭтанолГрогг Хеми1009832500
ФемтоДжет 4iЭпендорфд/о
Фемтотип IIНаучный калибр5242957000
Раствор формальдегидаСигма ОлдричФ8775
ГлицинАпплиХим10021259
Антитела IgG к козам против кроликов, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificА-11011
HA-tag (C29F4) кролик mABклеточные системы3724
InjectMan NI 2Эпендорфд/о
легкая средад/од/о0,2x раствор порошка ростков пшеницы в 2,5 мМ Na2HPO4
НефтепродуктСигма ОлдричМ8691
На2НПО4Сигма Олдрич71643
Фенол-хлороформ-изоамилалкохолСигма Олдрич77617
Фосфорный буферный физиологический раствор Научный Фишер10722497
Набор Plasmid plus midiprepЦягене12945
насыщенная средад/од/о1x раствор порошка ростков пшеницы в 2,5 мМ Na2HPO4
Стрептавидин-ФИТКThermo Fisher Scientific11-4317-87
Центробежный фильтр Ultrafree-MC GV EMD MiliporeUFC30GV00
моющий растворд/од/о0,1% БСА в волвинских водах 
раствор порошка ростков пшеницыПайнс интернэшнлд/оПриготовьте в 20 раз бульон из порошка, как описано ранее (0,5 г/10 мл)
Стрептавидин-HRPАБКАМАБ7403
Покрытые стрептавидином магнатические бусиныСигма ОлдричLSKMAGT02
Буфер для лизиса для пониженияд/од/о50 мМ Трис pH 8; 150 мМ NaCl; 0,5% дезоксихолат натрия; 1% Тритон Х-100; 5 мМ MgCl2; 2x ингибитор протеазы cOmplete (Roche);  
Буфер промывки 1 для промывкид/од/о50 мМ Трис pH 8; 150 мМ NaCl; 0,5% дезоксихолат натрия; 1% Тритон Х-100; 5 мМ MgCl2;
Буфер промывки 2 для промывкид/од/о10 мМ Трис pH 7,4; 150 мМ NaCl; 0,01 % NP40; 1 мМ MgCl2
Буфер промывки 3 для вытягивания внизд/од/о10 мМ Трис pH 7,4; 150 мМ NaCl;

Ссылки

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

TurboID
В естественных условиях Бесконтактное биотинилирование для изучения взаимодействия белков у Paramecium tetraurelia
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.