Генерация целых бактериальных геномов из клинических образцов с помощью рабочего процесса целевого обогащения

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол, позволяющий проводить полногеномное секвенирование бактериальных инфекций, передающихся половым путем, из клинических образцов с использованием целевого обогащения. Этот новый метод, основанный на синдромных панелях, решает проблемы, связанные с большим количеством ДНК человека и низкой бактериальной нагрузкой, облегчая геномный надзор за Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum и Mycoplasma genitalium.

Аннотация

Получение полных геномов бактериальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП), непосредственно из клинических образцов является сложной задачей из-за наличия ДНК человека, микробиоты и очень низкой бактериальной патогенной нагрузки. Культивирование часто не является вариантом, так как эти виды привередливы, и большинство образцов отбирается в транспортных средах, которые лизируют микроорганизмы, делая их нежизнеспособными для культивирования. Для решения этих проблем мы использовали зондовую панель, разработанную для четырех видов, для создания полногеномных последовательностей бактериальных ИППП и выполнили целевое обогащение, двух-трехдневную процедуру гибридизации перед секвенированием генома. Наши первоначальные результаты дали отличные геномные данные с использованием образцов, для которых прямое секвенирование не увенчалось успехом. Обогащение мишенью оказалось высокоэффективным для секвенирования бактериальных геномов ИППП, особенно при высокой патогенной нагрузке (Ct < 30). Протестированные образцы, содержащие Mycoplasma genitalium , часто имели значения Ct выше 30, что приводило к более низким показателям успешного восстановления генома; Улучшения наблюдались после оптимизации температуры гибридизации с 65 °C до 62,5 °C. В дополнение к возможности геномного эпиднадзора, наличие полных геномов может дать ценную информацию об устойчивости к противомикробным препаратам, например, выявить детерминанты приобретенной устойчивости, связанные с Neisseria gonorrhoeae. Этот метод уже привел к идентификации новой линии Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum в Буэнос-Айресе, ompA-генотипа L4, что подчеркивает потенциал этого подхода для выявления нового геномного разнообразия и улучшения эпиднадзора за ИППП.

Введение

Появление методов секвенирования нового поколения (NGS) облегчило полногеномное секвенирование бактерий (WGS), что позволило секвенировать клинические изоляты многих видов бактериальных патогенов человека. Эта технология позволила провести многочисленные сравнительные исследования путем создания полных геномов в беспрецедентных масштабах. Это оказало большое влияние на клиническую микробиологию и микробиологию общественного здравоохранения, поскольку доступ к данным генома из клинических образцов через WGS позволяет проводить типирование и выявлять гены устойчивости к противомикробным препаратам. Кроме того, метагеномные подходы позволяют напрямую обнаруживать патогены, связанные с заболеванием, из клинических образцов. Такая информация создает новые возможности для персонализированных стратегий лечения пациентов. Кроме того, WGS является мощным инструментом, который дает представление об эволюции циркулирующих штаммов конкретного патогена, а также о моделях их передачи, позволяя органам общественного здравоохранения лучше понимать вспышки патогенов и реагировать на них ^1,2,3.

Для достижения достаточного качества секвенирования для WGS обычно требуется бактериальная изоляция с помощью культивирования для получения требуемого количества микробной ДНК ^4,5,6. Это представляет собой ограничивающий фактор для тех организмов, которые трудно культивировать, тех, которые не могут быть культивированы из-за нежизнеспособной обработки диагностических образцов, или тех, которые подвергаются воздействию антибиотиков во время лечения пациента. Примерами таких трудно поддающихся культивированию микроорганизмов являются бактериальные патогены, передающиеся половым путем, такие как Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum и Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Эти виды сложно культивировать из-за нескольких факторов, включая их внутриклеточную природу, хрупкость, привередливые требования к росту и медленные темпы репликации. По этим причинам разработка и внедрение методов, позволяющих проводить WGS, несмотря на низкое содержание ДНК, как это часто бывает в образцах пациентов, имеет решающее значение для проведения геномного анализа в клинических условиях.

Обогащение мишеней является наиболее перспективным методом секвенирования генома в условиях дефицита микробной ДНК¹⁰. Например, в контексте патогенов, вызывающих инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), только небольшая часть ДНК, присутствующей в образце пациента, происходит от патогена. В случае инфекций C. trachomatis было обнаружено, что ДНК патогена составляет максимум 0,6% от общего объема ДНК, но значения, как правило, намного ниже¹¹. Целевой метод обогащения заключается в селективном захвате представляющей интерес микробной ДНК до проведения NGS. Это достигается с помощью специально разработанных зондов РНК, меченных биотином, которые комплементарны целевой микробной ДНК. Лигирование адаптера выполняется для создания геномной библиотеки перед гибридизацией, в ходе которой эти зонды связываются с комплементарной микробной ДНК. Впоследствии магнитные шарики, покрытые стрептавидином, используются для захвата меченых биотином комплексов нуклеиновых кислот, используя сильное взаимодействие биотина и стрептавидина. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) амплифицирует выбранные фрагменты ДНК. Эти ключевые концептуальные шаги необходимы для понимания целевой стратегии обогащения. Тем не менее, дополнительные процедурные шаги, такие как мойка и контроль качества, также включены в полный протокол^10,12.

Прежде чем приступать к протоколу секвенирования, важно оценить количество входной ДНК и убедиться, что условия на протяжении всего рабочего процесса сохраняют ее целостность. Согласно рекомендациям производителя, по стандартному протоколу требуется 10-200 нг ДНК в объеме 7 мкл, что соответствует диапазону концентраций примерно от 1,4 до 28,6 нг/мкл. Когда концентрация ДНК ниже, рекомендуется использовать модифицированный вариант протокола с использованием 17 μЛ, допускающий концентрации от 0,6 до 11,8 нг/μл при сохранении требуемого входного количества¹². Учитывая низкие концентрации, часто получаемые из клинических образцов, мы в плановом порядке внедрили вариант протокола на 17 мкл. Производительность гибридизации и секвенирования связана с качеством ДНК, что подчеркивает важность надлежащих условий хранения и транспортировки образцов для сохранения целостности нуклеиновых кислот. Таким образом, надлежащая практика обращения, такая как стабилизация собирательной среды, быстрая обработка, поддержание условий холодовой цепи и сведение к минимуму циклов замораживания-оттаивания, являются важными мерами для оптимизации качества ДНК. Наряду с требуемой концентрацией ДНК, длина фрагмента ДНК является показателем целостности. Мы рекомендуем свести к минимуму деградацию ДНК при работе с образцами и их хранении, чтобы получить более длинные фрагменты и оптимизировать результаты секвенирования. Это особенно актуально в клинических условиях, где распространена вариабельность методов сбора, среды и обработки. Мы успешно применили этот протокол к ДНК, экстрагированной как из среды 2-SP, так и из транспортной среды NAAT, со средней длиной фрагментов до 1 тыс. т..н., как подробно описано в репрезентативных результатах. Наконец, успешное секвенирование было определено как достижение более чем 95% охвата генома со средней глубиной считывания, превышающей 10x¹⁰.

На сегодняшний день целевое обогащение успешно применяется различными исследовательскими группами к широкому спектру микроорганизмов и вирусов, включая патогены, вызывающие ИППП, норовирусы, вирусы домашнего скота и патогены растений 10,13,14,15,16. Тем не менее, до сих пор дизайн зонда, как правило, был ограничен отдельными патогенами, а не панелью, нацеленной на полные геномы нескольких синдромически сцепленных патогенов. Идеальными мишенями являются организмы с небольшими консервативными геномами, к которым относятся C. trachomatis, T. pallidum и M. genitalium. В то время как N.gonorrhoeae имеет более разнообразный геном и больший пангеном, зонды для его покрытия все еще могут быть рационализированы в дизайне с тремя другими бактериями. Существует некоторое расхождение в %G+C между этими бактериями и другими, которые могут быть синдромно связаны, что означает, что условия, возможно, нуждаются в оптимизации.

Целью данного протокола является получение полных геномов непосредственно из клинических образцов для проведения филогенетического и эпидемиологического анализа. Мы демонстрируем новую и эффективную стратегию с использованием зондовой панели, адаптированной для C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum и M. genitalium, для восстановления полных геномов с использованием извлеченной ДНК из клинических образцов, таких как мочеполовые и аноректальные мазки. Этот подход оказался успешным и был применен при описании вспышки венерической лимфогранулемы (LGV) в Буэнос-Айресе, что позволило описать новую линию C. trachomatis LGV ^10,13.

Будет описана процедура целевого обогащения, включая использование коммерчески доступного метода захвата ДНК с пулированием после захвата для секвенирования следующего поколения (NGS), используемого для получения полных геномов непосредственно из клинических образцов пациентов с диагнозами C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum и/или M. genitalium Инфекций. Для достижения оптимального успеха рекомендуется отбирать образцы со значением Ct ниже 30, так как более высокие значения Ct отражают меньшую нагрузку патогенов и с меньшей вероятностью дадут полные геномы. Экстракт ДНК для метода может быть получен из клинических образцов различных типов образцов и коллекционных сред. Процедуры экстракции ДНК могут выполняться как вручную, так и с помощью автоматизированных систем с использованием наборов, предназначенных для выделения патогенной или вирусной ДНК из образцов мазков человека (см. Таблицу материалов).

Набор зондов, используемый в процедуре обогащения мишеней (см. Таблицу материалов), был специально разработан для захвата геномного разнообразия C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum и M. genitalium. Пользовательские зонды были сгенерированы с использованием нескольких полных геномов для каждого вида, оптимизируя охват их известных пан-геномов^. Критерии проектирования включали минимальную гомологию последовательностей 90% к эталонным последовательностям и частоту мозаики 1x-2x для повышения эффективности захвата цели. Для оптимизации экономической эффективности алгоритм, используемый при проектировании зондов, минимизировал количество зондов, сохраняя при этом полное представление генома. Окончательный набор зондов состоял из 242 000 зондов для мультиплексных дизайнов, нацеленных на C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium и T. pallidum. Весь протокол целевого обогащения может быть выполнен за 2 или 3 дня. Четкие указания точек остановки предусмотрены как для двухдневного, так и для трехдневного вариантов рабочего процесса.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ЭТИКЕ
В данном исследовании предложены методологические усовершенствования на основе ранее опубликованных протоколов^10,13. Описанные процедуры включают только обезличенные образцы и не включают данные пациента; Таким образом, не требовалось специального этического одобрения методологических аспектов. Репрезентативные результаты были получены из двух наборов ранее изученных образцов: аргентинских образцов, собранных в соответствии с утвержденным протоколом Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, approval No. 201723), с письменным информированным согласием, полученным от всех участников; и обезличенные финские образцы, для которых не требовалось специального этического одобрения. Перед отправкой в базу данных любых результирующих данных секвенирования необходимо удалить данные, прочитанные человеком.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочее пространство должно быть разделено на зону до ПЦР (рабочее пространство без ампликона) и зону после ПЦР (рабочее место для работы с ампликоном) для предотвращения загрязнения. Если прямо не указано иное, все действия должны выполняться в одном из двух контролируемых рабочих пространств. Все мастер-миксы и смеси для ПЦР-реакции должны быть приготовлены в рабочем пространстве, где не используются ампликоны, в то время как все последующие этапы, связанные с ампликонной ДНК, должны быть проведены в рабочем пространстве для работы с ампликонами. Все количества в этом протоколе рассчитаны для обработки восьми образцов.

1. Фрагментация ДНК

1. Измерьте концентрацию ДНК в экстрактах ДНК из клинических образцов, содержащих ДНК целевого патогена (ДНК), с помощью чувствительного, точного метода, основанного на флуоресценции (анализ двухцепочечной ДНК [dsDNA] с использованием 1 мкл образца с диапазоном обнаружения до 120 нг/мкл; см. Таблицу материалов). Этот метод количественного определения используется последовательно во всем протоколе при измерении концентрации ДНК.
2. Разбавьте каждый образец ДНК до концентрации 10–200 нг в воде, не содержащей нуклеаз, обеспечив конечный объем 17 мкл в каждой полоске ПЦР-пробирки. Для достижения оптимальных результатов секвенирования используйте максимально возможное количество входной ДНК в рекомендуемом диапазоне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях, когда общая концентрация ДНК ниже рекомендуемого минимума в 10 нг на 17 мкл, можно использовать добавки с фоновой ДНК (например, ДНК генома человека) для удовлетворения требований к вводу, предложенным производителем. Это может помочь стабилизировать реакцию подготовки библиотеки и повысить производительность секвенирования в клинических образцах с низким уровнем ввода.
3. Разморозьте буфер фрагментации (5x), вихрь и положите на лед.
4. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с таблицей 1. Запустите программу и немедленно сделайте паузу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность стадии инкубации при температуре 37 °C может варьироваться в зависимости от исходного размера фрагмента ДНК и желаемой длины считывания NGS. Для высококачественных образцов ДНК рекомендуется время инкубации 15 мин для получения фрагментов размером от 150 до 200.о., пригодных для 2 100-кратных прочтений, и 10 мин для получения фрагментов от 180 до 250.о. для 2 150-кратных прочтений.
5. Извлеките необходимые флаконы для мастер-смеси для фрагментации из хранилища при температуре -20 °C. Приготовьте мастер-микс на основе таблицы 2. Запечатайте трубку и вихрь на высокой скорости в течение 5-10 с. Кратковременно вращайте, чтобы удалить пузырьки и держать мастер-смесь на льду.
6. Добавьте 3 мкл мастер-смеси для фрагментации в каждую лунку, содержащую 17 мкл входной ДНК. Перемешайте пипеткой вверх и вниз 20 раз, запечатайте полоску из ПЦР-пробирки, сделайте вихрь на высокой скорости в течение 5-10 секунд и коротко вращайте.
7. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в термоамплификатор (см. Таблицу материалов) и возобновите программу, проиллюстрированную в таблице 1, в начале шага 1.
8. Как только будет достигнута ступень удержания 4 °C, извлеките полоску из термоамплификатора из термоамплификатора и добавьте 30 μл воды, не содержащей нуклеаз. Положите полоску из ПЦР-пробирки на лед.

Таблица 1: Программа термоамплификатора для ферментативной фрагментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Подготовка мастер-микса для фрагментации Нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Подготовка библиотеки

1. Приготовление мастер-смеси для лигирования
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе следует приготовить мастер-смесь для лигирования, потому что ей требуется 30-45 минут, чтобы уравновеситься до комнатной температуры.
   1. Извлеките буфер для лигирования из хранилища при температуре -20°C и разморозьте на льду. Достаньте ДНК-лигазу Т4 из хранилища при температуре -20°C, перемешайте, перевернув флакон, и держите на льду.
   2. Приготовьте мастер-смесь для лигирования в соответствии с таблицей 3. Запечатайте трубку и вихрь на высокой скорости в течение 10-20 с, кратковременно открутите и выдержите при комнатной температуре 30-45 минут перед использованием.
2. Конец ремонта и фрагменты хвоста dA
   1. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с таблицей 4.
   2. Извлеките буфер хвостового управления из хранилища при температуре -20 °C и разморозьте на льду. После оттаивания сделайте вихрь на большой скорости, вращайтесь кратковременно. Достаньте конечную смесь ферментов для хвоста, перемешайте, перевернув флакон, и держите на льду.
   3. Приготовьте мастер-смесь для конечного ремонта/dA-хвостохранилища в соответствии с таблицей 5 (см. Таблицу материалов). Перемешайте, надежно запечатав трубку и вортекс на высокой скорости в течение 10-20 с, вращайте кратко и держите на льду.
   4. Пипеткой внесите 20 мкл мастер-смеси для восстановления концов/dA-хвоста в каждую лунку, содержащую 50 мкл фрагментов ДНК (с шагов 1.1-1.8). Запечатайте полоску ПЦР-пробирки, тщательно перемешайте вортексом на высокой скорости в течение 5-10 с. Коротко закрутите полоску из ПЦР-пробирки и поместите ее в термоамплификатор. Продолжим программу, изложенную в таблице 4.
3. Лигирование адаптеров с маркировкой MBC
   1. После того как программа, приведенная в таблице 4 , завершит свой заключительный этап, поместите полоску для ПЦР-пробирки на лед. Настройте термоамплификатор в соответствии с параметрами, приведенными в таблице 6. Запустите программу и сразу же поставьте ее на паузу.
   2. Добавьте 25 мкл мастер-смеси для лигирования при комнатной температуре в каждый образец, приготовленный на этапе 2.1. Запечатайте полоску из ПЦР-пробирки, сделайте вихрь в течение 5-10 секунд и коротко вращайте.
   3. Извлеките смесь олиго адаптера для библиотек с тегом MBC (см. Таблицу материалов) из хранилища при температуре -20 °C и разморозьте на льду. После оттаивания делайте вихрь с высокой скоростью в течение 5-10 с. Кратковременно вращаем и держим на льду.
   4. Добавьте в каждый образец 5 мкл олигосмеси адаптера для библиотек с меткой MBC. Запечатайте полоску ПЦР-пробирки и вихрь на высокой скорости в течение 5-10 с, кратковременно открутите. Немедленно поместите полоску из ПЦР-пробирки в термоамплификатор и продолжайте выполнение программы, как указано в таблице 6.
4. Очистка от лигирования
   1. Проведите очистку ДНК с помощью магнитных шариков. Достаньте шарики из хранилища при температуре 4 °C и дайте им нагреться до комнатной температуры перед использованием.
   2. Приготовьте 4 мл 70% этанола в воде, не содержащей нуклеаз. Хранить при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется только что приготовить раствор 70% этанола для использования на этапах очистки, чтобы обеспечить оптимальную производительность. Для получения 70% этанола используйте воду без нуклеазы непосредственно перед использованием.
   3. Тщательно окуните магнитную суспензию до тех пор, пока смесь не станет однородной, а цвет не станет однородным.
   4. Когда программа, приведенная в таблице 6 , достигнет шага удержания 4 °C, переведите полоску пробирки ПЦР из термоамплификатора в режим комнатной температуры. Добавьте в каждую лунку по 80 мкл суспензии в шариках. Запечатайте полоску ПЦР-пробирки и вортекс на 5-10 с, кратковременно отжмите.
   5. Выдержать суспензию в бусинах в течение 5 минут при комнатной температуре. Перенесите полоску из ПЦР-пробирки на магнитную подставку (см. Таблицу материалов) и подождите 5-10 минут, пока раствор не станет прозрачным.
   6. Держа полоску ПЦР-пробирки в магнитной подставке, осторожно извлекайте и выбрасывайте очищенный раствор из каждой лунки, избегая контакта с шариками.
   7. С полоской для ПЦР-пробирки в магнитной подставке выполните две промывки с 70% этанолом следующим образом: добавьте 200 мкл 70% этанола в каждый образец. Подождите 1 минуту и удалите 70% этанол. Избегайте прикосновения к шарикам во время удаления раствора.
   8. После второй промывки запечатайте полоску ПЦР-пробирки и кратковременно открутите образцы для сбора остатков этанола. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку на 30 с.
   9. Удалите собранный этанол, избегая прикасаться к бусинам. Чтобы удалить остатки этанола, снимите полоску ПЦР-пробирки с магнитной подставки и оставьте незакрытой (в идеале в колпаке) до 5 минут. Убедитесь, что бусины полностью высохли, но не потрескались; Это снизило бы эффективность процесса элюирования.
   10. Разбавьте ДНК, добавив 35 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в каждую лунку для образца. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10-15 раз, запечатайте пробирки и сделайте вихрь в течение 5-10 секунд. Убедитесь в отсутствии видимых комочков. В случае, если таковые имеются, вихрь до полного растворения.
   11. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку и подождите примерно 5 минут, пока раствор не исчезнет.
   12. Осторожно удалите очищенную надосадочную жидкость (~34 мкл) из каждой лунки и переложите в соответствующую лунку в свежей полоске для ПЦР-пробирки. Держите образцы на льду и выбросьте бусины.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для 3-дневного протокола это означает окончание Дня 1. Храните образцы при температуре 4 °C в течение ночи.
5. Усиление и двойной индекс
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящую пару индексных праймеров для каждого образца, чтобы обеспечить надлежащую идентификацию во время секвенирования. Каждая индексная последовательность состоит из метки 8.о., встроенной в праймеры, используемые для амплификации библиотек предварительного захвата.
   1. Извлеките высокоточный буфер ДНК-полимеразы с dNTP (5x) из хранилища при -20 °C и разморозьте на льду. Извлеките выбранные индексированные праймеры для секвенирования из хранилища при температуре -20 °C и держите на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы записываете определенный штрих-код, присвоенный каждому образцу, для точной идентификации и прослеживаемости на протяжении всего процесса секвенирования.
   2. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с таблицей 7. Запустите программу и немедленно сделайте паузу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель рекомендует проводить от 8 до 14 циклов ПЦР перед захватом в зависимости от качества и количества входной ДНК. В данном протоколе было реализовано 11 циклов в соответствии с рекомендациями производителя, в результате чего были получены высококачественные данные секвенирования^10,12.
   3. Извлечение высокоточного термоядерного фермента для амплификации ПЦР из хранилища при температуре -20 °C. Пипеткой передавайте фермент вверх и вниз, чтобы перемешать, избегая чрезмерного перемешивания, и нагнетайте высокоточный буфер ДНК-полимеразы для обеспечения однородности. Приготовьте реакционную смесь для предварительного захвата ПЦР (как описано в таблице 8). Вихревом получается смесь и кратковременно раскручиваем, держим на льду.
   4. Диспонируйте 11 мкл реакционной смеси для предварительного захвата ПЦР (приготовленной, как описано в таблице 8) в каждую лунку образца, содержащую очищенную библиотеку ДНК. Добавьте по 5 мкл выбранной пары индексных праймеров в каждую реакцию. Запечатайте полоску пробирки ПЦР и вихрь на 5 с, а затем быстро раскрутите.
   5. Возобновите программу термоамплификатора, как указано в таблице 7. Как только температура достигнет 98 °C, поместите полоску для ПЦР-пробирки в термоамплификатор и надежно закройте крышку.
6. Очистка библиотеки
   1. Перед использованием дайте магнитным шарикам уравновеситься до комнатной температуры не менее 30 минут. Приготовьте 4 мл 70% этанола в воде, не содержащей нуклеаз. Хранить при комнатной температуре.
   2. Тщательно окуните магнитную суспензию до тех пор, пока смесь не станет однородной, а цвет не станет однородным.
   3. Когда программа, приведенная в таблице 7 , достигнет шага удержания 4 °C, перенесите полоску из термоамплификатора в режим комнатной температуры. Добавьте в каждый образец по 50 μл суспензии в гранулах. Запечатайте полоску ПЦР-пробирки и вортекс на 5-10 с, кратковременно открутите (не гранулируя магнитные шарики).
   4. Выдержать суспензию в бусинах в течение 5 минут при комнатной температуре. Перенесите полоску из ПЦР-пробирки на магнитную подставку и подождите 5-10 минут, пока раствор не станет прозрачным.
   5. Держа полоску ПЦР-пробирки в магнитной подставке, осторожно извлеките и выбросьте прозрачный раствор из каждой лунки. Избегайте прикосновения к шарикам во время удаления раствора.
   6. С помощью полоски для ПЦР-пробирки на магнитной подставке выполните две промывки с 70% этанолом следующим образом. Добавьте 200 мкл 70% этанола в каждый образец. Подождите 1 минуту и удалите 70% этанол. Избегайте прикосновения к шарикам во время удаления раствора.
   7. После второй промывки запечатайте полоску ПЦР-пробирки и кратковременно закрутите ее, чтобы собрать остатки этанола. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку на 30 с. Удалите остатки этанола, избегая прикосновения к шарикам.
   8. Чтобы удалить остатки этанола, снимите полоску ПЦР-пробирки с магнитной подставки и оставьте незакрытой (в идеале в колпаке) до 5 минут. Убедитесь, что бусины полностью высохли, но не трескаются, так как это снизит эффективность процесса элюирования.
   9. Разбавьте библиотечную ДНК, добавив 15 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в каждую пробирку с образцом. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз 10-15 раз, запечатайте полоску ПЦР-пробирки и сделайте вихрь в течение 5-10 секунд. Убедитесь в отсутствии видимых комочков. В случае, если таковые имеются, вихрь до полного растворения.
   10. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку и подождите примерно 5 минут, пока раствор не исчезнет.
   11. Осторожно удалите очищенную надосадочную жидкость (~15 мкл) из каждой лунки и перенесите в соответствующую лунку в свежей полоске для ПЦР-пробирки. Держите образцы на льду и выбросьте бусины.
7. Контроль качества
   1. Измерьте концентрацию ДНК очищенной библиотеки ДНК. Из-за более высокой чувствительности используйте флуоресцентный метод для количественного определения ДНК в 1 μл.

Таблица 3: Приготовление мастер-смеси для лигирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Программа термоамплификатора для конечного ремонта/хвостохранилища. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Приготовление мастер-смеси для торцевого ремонта/dA хвостохранилища. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6 Программа термоамплигатора для лигирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 7: Программа термоамплификатора для предварительного захвата ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 8: Приготовление реакционной смеси для ПЦР перед захватом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

3. Гибридизация/захват образцов

1. Библиотеки гибридизации для зонда
   1. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с таблицей 9. Запустите программу и немедленно сделайте паузу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель рекомендует температуру гибридизации 65°C. Эта температура была снижена до 62,5 °C, что привело к улучшению результатов.
   2. Извлеките буфер для гибридизации из хранилища при температуре -20 °C, разморозьте на льду и храните при комнатной температуре до использования. Извлеките блокатор РНКазы и смесь блокаторов олигонуклеотидов из хранилища при температуре -20 °C и разморозьте на льду. Держите эти флаконы на льду до использования.
   3. Рассчитайте объем, необходимый для того, чтобы каждый образец содержал 500-1000 нг библиотеки ДНК, исходя из концентрации ДНК, измеренной на шаге 2.7. Перенесите рассчитанный объем в новую полоску для ПЦР-пробирки и отрегулируйте общий объем до 12 мкл с помощью воды, не содержащей нуклеаз.
   4. Закрутите и быстро закрутите смесь блокаторов олигонуклеотидов. Добавьте 5 μL в каждую пробирку с образцом. Запечатайте полоску ПЦР-пробирки и переложите в термоамплификатор. Возобновите программу термоциклирования, описанную в таблице 9 , и продолжайте до этапа 3, на котором необходимо добавить дополнительные реагенты непосредственно в лунки для проб в термоамплификаторе.
   5. Приготовьте 25% блочный раствор РНКазы в соответствии с таблицей 10. Запечатайте трубку и вортекс на высокой скорости в течение 10-20 с, кратковременно вращайте и держите на льду до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия растворов, содержащих зонд, при комнатной температуре. Держите при комнатной температуре только на этапах приготовления.
   6. Извлеките флакон с зондом из хранилища при температуре -80 °C и храните флакон в охлаждающей решетке, пока он не используется. Переложите в лед для размораживания. Щупы рекомендуется использовать в том виде, в котором они предусмотрены, но могут быть разбавлены при тестировании^10,13.
   7. После того как все реагенты, перечисленные в таблице 11 , достигнут комнатной температуры, соедините их для приготовления смеси для зондовой гибридизации. Перемешайте раствор путем вортексирования на высокой скорости в течение 5 с, кратковременно убавьте обороты и немедленно перейдите к следующему шагу.
   8. Когда термоамплификатор достигнет этапа 3 программы, описанной в таблице 9, добавьте 13 мкл гибридизационной смеси зонда комнатной температуры в каждую лунку для отбора проб, сохраняя пробирки в термоамплификаторе на протяжении всего процесса. Тщательно перемешайте, медленно пипетируя вверх и вниз 8-10 раз.
   9. Надежно запечатайте полоску ПЦР-пробирки, кратковременно закрутите ее и прокрутите вниз по пробиркам. Убедитесь в отсутствии пузырьков, затем немедленно верните полосковые трубки в термоамплификатор. Убедитесь, что трубки надлежащим образом закрыты.
   10. Возобновите программу термоциклирования с целью проведения гибридизации подготовленных библиотечных образцов ДНК с зондами. Гибридизация продолжается в одночасье
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для 2-дневного протокола это означает конец дня 1. Для 3-дневного протокола это означает конец дня 2.
2. Приготовление шариков стрептавидина
   1. Извлеките магнитные шарики, покрытые стрептавидином (шарики стрептавидина) из хранилища при температуре 4 °C. Тщательно перебейте флакон вихрем, чтобы убедиться, что шарики полностью суспензированы. Суспензия должна быть однородной.
   2. Для каждого образца для гибридизации перенесите 50 мкл полностью ресуспендированных шариков в отдельные пробирки новой полоски для ПЦР-пробирки.
   3. Промойте шарики стрептавидина следующим образом: добавьте в каждую пробирку по 200 мкл связующего буфера, перемешайте пипетированием вверх и вниз. Запечатайте трубки, сделайте вихрь на высокой скорости в течение 5-10 секунд и кратковременно поверните вниз. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку. Дайте раствору раствориться в течение 5 минут, затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторите шаги 2 раза, выполнив в общей сложности три стирки.
   4. Суспендируйте шарики в 200 мкл связующего буфера.
3. Захват гибридных библиотек
   1. После того как программа гибридизационного термоциклирования, указанная в таблице 9 , завершит свой заключительный этап, переведите полоску из ПЦР-пробирки к комнатной температуре.
   2. Переложите весь объем (~30 мкл) из каждой пробирки в соответствующие пробирки, содержащие 200 мкл предварительно промытых шариков стрептавидина. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5-8 раз, затем надежно запечатайте полосковую трубку.
   3. Поместите полосковую трубку на 96-луночный пластинчатый миксер и энергично перемешивайте при 1800 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Обеспечьте правильное перемешивание жидкости в лунках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если 96-луночный планшетный смеситель недоступен или образцы не перемешиваются эффективно, рассмотрите альтернативные методы, такие как горизонтальное закрепление полосковых трубок на верхней поверхности смесителя или использование шейкера с регулируемой температурой (с выключенной опцией нагрева) для обеспечения тщательного перемешивания образцов.
   4. В течение этого времени инкубации приготовьте шесть аликвот по 200 мкл высокотемпературного промывочного буфера для каждого образца (т.е. в данном случае 6 x 8 полосковых пробирок по 200 мкл каждая). Запечатайте пробирки и инкубируйте в термоамплификаторе при температуре 70 °C до тех пор, пока не понадобится.
   5. После завершения 30-минутной инкубации захвата кратковременно поверните полоску ПЦР-пробирки, чтобы собрать жидкость. Поместите полоску из ПЦР-пробирки в магнитную подставку для сбора шариков. Подождите, пока раствор станет прозрачным (примерно 2 минуты), затем осторожно удалите надосадочную жидкость, избегая при этом прикосновения к шарикам.
   6. Сняв полоску ПЦР-пробирки с магнитной подставки, добавьте 200 μл промывочного буфера комнатной температуры. Проводите пипеткой вверх и вниз до тех пор, пока шарики стрептавидина полностью не будут ресуспендированы (15x-20x).
   7. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку и подождите, пока суспензия исчезнет (примерно 1 минута). Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности захвата крайне важно поддерживать температуру суспензии валика при температуре 70 °C на протяжении всей процедуры стирки, описанной ниже. Поэтому перед использованием убедитесь, что высокотемпературный буфер для стирки предварительно нагрет до 70 °C.
   8. Промойте шарики стрептавидина 6 раз аликвотированным и предварительно подогретым до 70 °C высокотемпературным буфером для стирки, как описано ниже.
      1. Снимите пробирку с полоской ПЦР, содержащую шарики, с магнитной подставки. Добавьте 200 мкл предварительно нагретого при температуре 70 °C высокотемпературного промывочного буфера в каждую пробирку, содержащую шарики. Проводите пипеткой вверх и вниз до полного суспензирования шариков (15x-20x). Тщательно запечатайте полоску ПЦР-пробирки, сделайте вихрь на высокой скорости в течение 8 с и быстро закрутите, не гранулируя шарики.
      2. Поместите пробирку с полоской для образцов, содержащую ресуспензионные шарики, в блок термоамплификатора при температуре 70 °C на 5 минут. Перенесите полосовую трубку из термоамплификатора на магнитную стойку при комнатной температуре.
      3. Подождите 1 минуту, чтобы раствор рассеялся. Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите 5 раз, всего шесть мытьев.
   9. Убедитесь, что весь буфер для промывки полностью удален, затем добавьте 25 μL воды, не содержащей нуклеаз, в каждую пробирку с образцом. Медленно суспендируйте шарики, пипетируя вверх и вниз 8 раз, стараясь избежать образования пузырьков.
   10. Держите ПЦР-полоску, содержащую образцы, на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию в ПЦР-реакциях, описанных ниже.
4. Библиотеки, обогащенные усилением
   1. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с таблицей 12. Запустите программу и немедленно сделайте паузу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель рекомендует выполнять от 10 до 16 циклов ПЦР после захвата в зависимости от размера конструкции зонда. В этом протоколе было реализовано 22 цикла, в результате которых было успешно восстановлен геном патогена^10,12.
   2. Извлеките высокоточный буфер ДНК-полимеразы с dNTP (5x) и смесь праймеров после захвата (см. Таблицу материалов) из хранилища при -20 °C, разморозьте и держите на льду. Вихри на высокой скорости и быстро раскручиваются вниз перед использованием.
   3. Извлеките высокоточный термоядерный фермент для амплификации ПЦР (см. Таблицу материалов) из хранилища при температуре -20 °C. Чтобы правильно перемешать ферментный раствор, делайте пипеткой жидкость вверх и вниз, чтобы избежать чрезмерного перемешивания. Затем приготовьте реакционную смесь для ПЦР после захвата, объединив все реагенты в соответствии с таблицей 13. Вихревом получается смесь и кратковременно раскручиваем, держим на льду.
   4. Добавьте 25 мкл реакционной смеси после захвата ПЦР в каждую пробирку с образцом (каждая из которых содержит 25 мкл ДНК, обогащенной мишенью, связанной с гранулами). Пипеткой вверх и вниз перемешивайте реакции до тех пор, пока суспензия шариков не станет однородной. Надежно запечатайте полоску для ПЦР-пробирки. На этом этапе не прокручивайте полоску ПЦР-пробирки.
   5. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в термоамплификатор и возобновите программу термоамплификатора, как указано в таблице 12. Как только программа достигнет своего финального этапа, кратковременно прокрутите полоску ПЦР-пробирки. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку, подождите примерно 2 минуты, пока раствор не исчезнет.
   6. Перенесите примерно 50 мкл надосадочной жидкости из каждой полоски ПЦР-пробирки в соответствующую лунку новой полоски для ПЦР-пробирки. Полосковую трубку, содержащую шарики стрептавидина, можно выбросить.
5. Очистка финальных библиотек
   1. Перед использованием дайте магнитным шарикам уравновеситься до комнатной температуры не менее 30 минут. Приготовьте 4 мл 70% этанола в воде, не содержащей нуклеаз. Хранить при комнатной температуре.
   2. Тщательно окуните магнитную суспензию до тех пор, пока смесь не станет однородной, а цвет не станет однородным.
   3. Добавьте 50 мкл суспензии в каждую пробирку с образцом. Запечатайте трубки и вихрь на 5-10 с, кратковременно закрутите (не гранулируя магнитные шарики).
   4. Выдержать суспензию в бусинах в течение 5 минут при комнатной температуре. Перенесите полоску из ПЦР-пробирки на магнитную подставку и подождите 5-10 минут, пока раствор не станет прозрачным.
   5. Держа полоску ПЦР-пробирки в магнитной подставке, осторожно извлеките и выбросьте прозрачный раствор из каждой лунки. Избегайте прикосновения к шарикам во время удаления раствора.
      1. С полоской для ПЦР-пробирки в магнитной подставке выполните две промывки с 70% этанолом следующим образом: добавьте 200 мкл 70% этанола в каждый образец. Подождите 1 минуту, чтобы потревоженные шарики осядли, и удалите 70% этанол. Избегайте прикосновения к шарикам во время удаления раствора.
   6. После второй промывки запечатайте пробирки и кратковременно поверните полоску ПЦР-пробирки, чтобы собрать остатки этанола. Поместите полоску для ПЦР-пробирки на магнитную подставку на 30 с.
   7. Чтобы удалить остатки этанола, снимите полоску с ПЦР-пробирки с магнитной подставки и держите незакрытой (в идеале в колпаке) не более 5 минут. Убедитесь, что бусины полностью высохли, но не трескаются на вид, это снизит эффективность процесса элюирования.
   8. Разбавьте библиотечную ДНК, добавив 25 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в каждую пробирку с образцом. Тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз 10-15 раз, запечатайте полоску ПЦР-пробирки и сделайте вихрь в течение 5-10 секунд. Убедитесь в отсутствии видимых комочков.
   9. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите полоску для ПЦР-пробирки в магнитную подставку и подождите примерно 5 минут, пока раствор не исчезнет.
   10. Осторожно удалите очищенную надосадочную жидкость (примерно 25 мкл) из каждой лунки и перенесите в соответствующую лунку в свежей полоске для ПЦР-пробирки. Держите образцы на льду и выбросьте бусины.
6. Контроль качества
   1. Измерьте концентрацию ДНК очищенной библиотеки ДНК. Для достижения лучшей чувствительности используйте флуоресцентный метод для количественного определения ДНК в 1 мкл.
7. Секвенирование нового поколения
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от емкости используемой платформы и объема данных секвенирования, необходимых для каждой выборки, индексированные библиотеки из нескольких партий могут быть мультиплексированы за один прогон секвенирования.
   1. Перед объединением образцов отрегулируйте концентрацию ДНК каждого образца до 5 нг/мкл. Объедините библиотеки в эквимолярных количествах для поддержания сбалансированного представления.
   2. Секвенируйте подготовленные библиотеки с помощью высокопроизводительной системы секвенирования коротких считываний, например, с конфигурацией парного чтения со скоростью 150 бит на.о. (см. Таблицу материалов).

Таблица 9: Программа термоамплификатора для гибридизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 10: Приготовление блочного раствора РНКазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 11: Приготовление смеси для зондовой гибридизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 12: Программа термоамплификатора после захвата ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 13: Приготовление реакционной смеси для ПЦР после захвата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Результаты

Исследование, посвященное вспышке ВЛГ C. trachomatis в Буэнос-Айресе, Аргентина, показало некоторые новые особенности образцов, а именно: 10 нуклеотидных замен в гене ompA по сравнению с ompA-генотипом L1 и необычную последовательность мультилокусного типирования последовательности (MLST) типа 2 17,18,19. Мы стремились исследовать геномы этих клинических образцов, поместив их в контекст глобальных данных. Для достижения этой цели мы сравнили эффективность целевого подхода к обогащению с прямым метагеномным секвенированием WGS бактериальных ИППП из клинических образцов, пытаясь преодолеть проблемы, связанные с низкой бактериальной нагрузкой и большим количеством ДНК человека и микроорганизмов.

Использовалась ДНК либо из образцов ректального мазка, собранных в период с 2017 по 2023 год в Буэнос-Айресе, Аргентина, помещенных в среду 2-SP (сахароза-фосфатная среда) с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и антибиотиков (гентамицин 25 мкг/мл, ванкомицин 0,5 мг/мл и амфотерицин B 2,5 мкг/мл) и хранившихся при температуре −80 °C, либо объединенный уретральный, аноректальный, и мазки из глотки, собранные в Университетской клинике Цюриха (USZ) в буфере NAAT (тесты на амплификацию нуклеиновых кислот). ДНК из образцов из Буэнос-Айреса была выделена с помощью набора для ручной экстракции на основе диоксида кремния, в то время как ДНК из образцов USZ была выделена с помощью автоматизированной системы на основе магнитных шариков.

Положительный результат всех клинических образцов, включенных в это исследование, был подтвержден с помощью мультиплексного анализа ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалов) с пороговыми значениями цикла кПЦР (Ct) в следующих диапазонах: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 и M. genitalium:  30-37. Концентрацию ДНК количественно определяли с помощью высокочувствительного флуориметрического анализа перед секвенированием для характеристики исходного материала клинических образцов (см. Таблицу материалов).

Для сравнения прямого метагеномного секвенирования с обогащением мишени мы использовали 32 образца, из которых 29 были положительными на C. trachomatis, девять на N. gonorrhoeae, пять на T. pallidum и три на M. genitalium. Прямое метагеномное секвенирование не привело к получению полных геномов и едва ли достигло целевых данных выше исходного уровня, наблюдаемого в отрицательных образцах. Обогащение мишеней с помощью гибридизации при 65 °C привело к значительно лучшим результатам для каждого патогена, и во многих случаях с помощью этого метода были получены успешные геномы (рис. 1).

Чтобы оценить оптимальный выбор образца для обогащения мишени, мы оценили взаимосвязь между диагностическими значениями qPCR Ct и эффективностью восстановления генома, измеряемой процентом прочтений на мишени (%OTR). Этот показатель отражает долю прочтений секвенирования, которые соответствуют геному целевого организма и обычно используется для оценки эффективности обогащения. Была обнаружена значимая корреляция между патогенной нагрузкой и успешностью секвенирования C. trachomatis, при этом пороговое значение Ct для успеха составляет около Ct30. Несмотря на то, что данные по другим патогенам-мишеням были ограничены, наблюдалась аналогичная тенденция, когда успешное секвенирование генома происходило преимущественно в образцах с патогенной нагрузкой ниже Ct30 (Рисунок 2).

Этот эксперимент с температурой гибридизации 65 °C показал успешность секвенирования генома с целевым обогащением 75%-80% для C. trachomatis, N. gonorrhoeae и T. pallidum на основе образцов со значениями Ct ниже 30. Три положительных образца M. genitalium имели значения Ct 30-37 и достигли более низкого покрытия генома и средней глубины считывания. Чтобы улучшить эти результаты, мы экспериментировали со снижением температуры гибридизации, что улучшает гибридизацию благодаря низкому содержанию %G+C в геноме M. genitalium . Используя более низкие температуры гибридизации, такие как рекомендуемая в настоящее время температура 62,5 °C, мы можем улучшить восстановление геномов M. genitalium без ущерба для восстановления других геномов (рис. 3). Эти результаты демонстрируют, что целевое обогащение является эффективным подходом к получению ценной геномной информации из клинических образцов и может быть адаптировано к широкому спектру геномов, в том числе в рамках панельного дизайна.

Филогенетический анализ успешно обогащенных геномов C. trachomatis показал, что большинство образцов из Буэнос-Айреса кластеризуются в пределах клады ompA-генотипа L2b, что позволяет предположить успешную линию с глобальной циркуляцией. Анализ также выявил наличие в Аргентине новой, отдельной линии, вызывающей ВЛГ. Образцы из этой клады отличаются примерно на 600 SNP от других линий LGV, и эта линия предлагается как ompA-генотип L4 (рис. 4). Подробное описание образцов, использованных на рисунках 1, 2 и 4, представлено в дополнительной таблице 1.

Эти результаты подчеркивают ценность обогащения мишеней в изучении разнообразия патогенов и демонстрируют высокую степень успешности секвенирования генома на основе клинических образцов.

Рисунок 1: Обогащение геномов с использованием целевого обогащения по сравнению с прямым метагеномным секвенированием. Процент целевых прочтений (%OTR), определяемый как процент сопоставления прочтений секвенирования с геномом целевого организма, показывает степень обогащения, достигнутого с помощью целевого обогащения. Линия представляет медиану всех точек данных, а рамка указывает 50% межквартильный диапазон (IQR). Цвета точек данных соответствуют источнику выборки: бледно-голубой для Аргентины и красный для Швейцарии. Успех секвенирования генома, определяемый как охват >95% и средняя глубина считывания >10, обозначается большими точками, в то время как неудача обозначается малыми точками. Обратите внимание на разные масштабы по оси y. Сокращения: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Эта цифра была изменена с¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Корреляция %OTR от целевого обогащения с диагностическими значениями Ct qPCR. Цвета точек данных представляют источник выборки: бледно-голубой для Аргентины и красный для Швейцарии. Успех секвенирования генома, определяемый как охват >95% и средняя глубина считывания >10, обозначается большими точками, в то время как неудача представлена малыми точками. Обратите внимание на разные масштабы по оси y. Сокращения: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Эта цифра была изменена с¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Влияние температуры гибридизации на восстановление полных геномов всех бактериальных патогенов ИППП в десяти образцах. ДНК человека в диапазоне таковой в клинических образцах была спайзирована известными концентрациями целевой бактериальной ДНК по отдельности (одиночно), а также в целом для представления образца с множественными инфекциями (объединена). Были проведены два эксперимента, каждый с пятью патогенами/комбинациями: 0,01% и 0,03%, чтобы представить приблизительное процентное содержание ДНК каждого микроорганизма по отношению к общей ДНК в образце (оставшаяся ДНК соответствует ДНК человека). Восстановление M. genitalium улучшается при более низких температурах. С. trachomatis ДНК добавляли в низкой концентрации; дальнейшие эксперименты показывают, что температуры не влияли на восстановление геномов C. trachomatis (данные не показаны). Сокращения: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Скорректированная на рекомбинацию филогения штаммов LGV из Аргентины. Анализ включает в себя все доступные геномы LGV с опубликованными данными. Метаданные, отображаемые справа от филогенеза, включают дубликаты образцов пациентов, байесовский анализ структуры популяции (BAPS; кластер = клада, где полифилетический кластер BAPS 6 представляет генетическое разнообразие популяции), метод секвенирования генома (данные этого исследования), генотип ompA , страну и год, как указано в ключе в верхнем левом углу. Недостающие данные отображаются белым цветом. Названия геномов из этого исследования выделены светло-голубым цветом для Аргентины и темно-синим для Финляндии (не получено путем целевого обогащения). Эти цвета используются исключительно для различения геномов, полученных в этом исследовании. Значения bootstrap из 1000 сверхбыстрых bootstrap отображаются в процентах по основным веткам. Эта цифра была изменена с¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Описание материалов, реагентов, инструментов и оборудования, использованных в исследовании. Таблица содержит подробную информацию о коммерческом наименовании, производителе и каталожном номере компонентов, используемых для экстракции ДНК, подготовки библиотеки, обогащения мишеней и секвенирования. Он также включает в себя предметы, используемые для внутренних анализов количественной ПЦР и процедур общей молекулярной биологии. Эквивалентные альтернативы могут быть использованы для товаров, отмеченных звездочкой (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Получение полных данных бактериального генома из клинических образцов является особенно сложной задачей. Тем не менее, нам нужны эти данные, чтобы получить информацию об циркулирующих клонах и исследовать профили устойчивости к противомикробным препаратам, особенно у привередливых и трудно поддающихся культивированию бактерий. Используя альтернативные методы, такие как глубокое секвенирование или адаптивное секвенирование с Oxford Nanopore Technologies, невозможно получить достаточные данные для анализа полногеномных последовательностей. В таких случаях, как образцы ИППП, обогащение мишенью является оптимальным методом для доступа к полному геному, и этот метод может быть использован на панели бактериальных патогенов ИППП. Несмотря на то, что это не дешевая процедура, результаты, которые она может предложить, не могут быть получены никаким^{другим способом.}

Подходящие образцы должны быть тщательно отобраны, в идеале отвечать на актуальные и важные вопросы в диагностике и исследованиях. Среда, используемая для сбора, не обязательно играет решающую роль, при этом успешные последовательности получаются как из 2-SP, так и из NAAT-сред. Хранение образцов имеет важное значение с целью сохранения целостности ДНК. Было установлено, что наиболее важным фактором является диагностическая нагрузка, направленная на приближенные значения Ct ниже Ct30. Для образцов со значениями Ct более 30 успех полного секвенирования генома менее вероятен, но в некоторых случаях частичные данные могут предоставить актуальную информацию.

Процедура не тривиальна, она включает в себя множество этапов, включая циклы ПЦР, гибридизацию и множество промывок шариками. Для достижения оптимальных результатов требуется тщательное внимание к процедуре. Важнейшие этапы протокола — фрагментация ДНК, гибридизация с помощью зондов захвата и захват на основе магнитных шариков с промывкой — требуют тщательного выполнения и надлежащего обращения. Протокол может быть изучен исследователями и техниками после пары попыток. В первых раундах, во время обучения, 3-дневный протокол может быть преимуществом; С более опытными пользователями 2-дневный протокол может ускорить результаты. Поскольку реагенты дорогие, может быть целесообразно провести тестовый прогон без дорогостоящих компонентов, например, зондов. Для альтернативных наборов приманок температуру гибридизации можно регулировать, что может улучшить чувствительность или специфичность обогащения. Если получено достаточное количество данных и наблюдается значительная доля дубликатов ПЦР, количество циклов ПЦР до и после захвата также может быть скорректировано.

Данные, полученные в результате этих экспериментов, могут быть использованы для типирования с выделением MLST и других соответствующих целей. В дальнейшем его можно анализировать в эпидемиологическом контексте, глобальном или локальном, сравнивая с соответствующими геномами для современных исследований. Рекомбинация и анализ подвижных элементов в геноме также позволяют сделать вывод об изменениях с течением времени и под давлением селекции, а также о возможных сопутствующих инфекциях. При наличии достаточного количества данных и связанных с ними метаданных можно проводить временные расчеты и делать выводы о предках конкретных характеристик и линий, а также о возможных путях и механизмах передачи. Все эти достижения в наших знаниях о важной группе патогенов могут служить основой для разработки стратегий общественного здравоохранения. Наш протокол и репрезентативные результаты показывают использование наборов целевых зондов с синдромной панелью, которые эффективны в образцах бактериальных ИППП и могут быть распространены на дополнительные типы образцов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
8-канальный пипетка 0,5-10 &; L	Эппендорф	3125000010	Eppendorf Research  плюс, 8-канальный, 0,5-10 & микро; L, средне-серый, переменный объем.
8-канальный пипетка 10-100 &; L	Эппендорф	3125000036	Eppendorf Research  плюс, 8-канальный, 10-100 и микро; L, желтый, переменный объем.
Adapter Oligo Mix для библиотек с тегами MBC	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Автоматизированная система экстракции нуклеиновых кислот с использованием набора для экстракции вирусных/патогенных ДНК	Цягэн	937036 (Комплект) / 9001297 (Инструмент)	Прибор QIAsymphony SP/AS используется с набором QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit для автоматизированного извлечения ДНК.
Буфер привязки	Agilent Technologies	5190-9687	Входит в состав набора для обогащения мишеней SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
Набор для экстракции ДНК и автоматизированный прибор	Исследовательская корпорация Zymo	Д3024/Д3025	Набор Quick-DNA Miniprep Kit используется для полного извлечения ДНК из клинических образцов. Совместимость с ручным или автоматизированным рабочим процессом.
End Repair - смесь ферментов хвоста	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Конечный ремонтный хвостовой буфер	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Этанол	VWR Chemicals BDH	20816.298	Абсолют этанола ≥ 99.5% Ph. Eur., USP
Флуориметр с высокочувствительным анализом дцДНК / флуоресцентным методом для количественного определения ДНК	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	В33238, В33231	Флуориметр Qubit 4 с набором для высокочувствительного анализа (HS) дцДНК 1X.
Буфер фрагментации	Agilent Technologies	5191-4080	Входит в состав набора SureSelect для ферментной фрагментации под названием ''5X Fragmentation Buffer''.
Фермент фрагментации	Agilent Technologies	5191-4080	Входит в состав набора для ферментной фрагментации SureSelect.
Высокоточный буфер ДНК-полимеразы	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 для ILM (Pre PCR) под названием ''Herculase II Buffer''.
Высокоточный буфер ДНК-полимеразы с dNTP (5X)	Agilent Technologies	5190-9687	Входит в состав набора SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) под названием ''Herculase II Buffer''.
Высокоточный фьюжн-фермент для амплификации ПЦР	Agilent Technologies	5191-5688	Входит в состав SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) под названием ''Herculase II''.
Высокотемпературный буфер для стирки	Agilent Technologies	5190-9687	Входит в состав набора SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) с названием ''Wash buffer 2''.
Буфер для гибридизации	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Индексированные праймеры для секвенирования	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав SureSelect XT HS2 Index Primer Pairs 1-96 для ILM (Pre PCR).
Собственный мультиплексный ПЦР-анализ в реальном времени	Тиб Молбиол	Н/Д	Собственная разработка и аккредитация анализа на основе наборов Lightmix для выявления ИППП
Буфер для лигирования	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Магнитные бусины для очистки	Agilent Technologies	5191-5740	Бусины SureSelect DNA AMPure XP.
Магнитная подставка	Лабораторная посуда Permagen	MSRLV08	0,2 мл ПЦР 8-полосковый магнитный сепаратор 5 и микро; Л ~0,2 мл Объем.
Секвенирование нового поколения (NGS): высокопроизводительная система секвенирования коротких считываний	Illumina, Inc.	Н/Д	Парное секвенирование 150.о. (PE150) проводилось на платформах Illumina, NextSeq1000 и MiSeq.
Вода без нуклеаз	БиоКонцепт	3-07Ф04-Х	Вода для молекулярной биологии, без ДНК/ДНКазы/РНКазы, стерильная, без ингибиторов ПЦР.
Смесь блокаторов олигонуклеотидов	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Стрип для ПЦР-пробирки	avantor, поставляемый компанией VWR	732-3608	Стрипы для ПЦР-пробирок с прикрепленными плоскими колпачками.
Смесь грунтовок после захвата	Agilent Technologies	5190-9687	Входит в состав набора для обогащения мишеней SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
РНК-зонд	Agilent Technologies	5191-6916	SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb Probe, например, Design ID S3465164).
Блокатор РНКазы	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 к ILM (Pre PCR).
Буфер для стирки при комнатной температуре	Agilent Technologies	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) с названием ''Wash buffer 1''.
Бусины стрептавидина	Agilent Technologies	5191-5742	SureSelect Streptavidin Beads.
Т4 ДНК-лигаза	Agilent Technologies	5500-0147	Входит в состав набора для подготовки библиотеки SureSelect XT HS2 для ILM (Pre PCR).
Метод обогащения мишеней / метод захвата ДНК	Agilent Technologies	Г9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA Kit с подготовкой библиотеки, быстрым обогащением мишеней Hyb и рабочим процессом пула после захвата. Версия протокола F0, май 2023 г. Для платформы Illumina NGS
Набор целевых зондов для обогащения C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum и M. genitalium	Agilent Technologies / Лаборатория обогащающей микробиологии (IMM, UZH)	ID проекта S3465164	Специально разработанный набор зондов (~242 000 зондов) для мультиплексного захвата четырех патогенов ИППП. Дизайн основан на нескольких референсных геномах.
Термоамплификатор	Термофишер	4375305	96-луночный термоамплификатор Veriti.