Данное исследование посвящено in vivo подкожной индукции люминесцентных клеток колоректального рака на мышиной модели и последующему измерению люминесценции с помощью системы визуализации. Процедура направлена на создание воспроизводимой модели роста опухоли для мониторинга в режиме реального времени и терапевтической оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подкожная инъекция клеток колоректального рака человека обнаженным мышам для оценки противоопухолевой эффективности
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Колоректальный рак (КРР) является одной из основных причин смертности от рака во всем мире, что подчеркивает настоятельную необходимость совершенствования доклинических моделей для оценки потенциальных методов лечения. Животные модели имеют важное значение для выяснения биологии опухолей и оценки новых терапевтических вмешательств. Мышиные модели имеют ключевые преимущества по сравнению с существующими моделями, включая генетическую манипулируемость, быстрое размножение, экономическую эффективность и доступность иммунокомпетентных и иммунодефицитных штаммов, что позволяет точно моделировать рак человека.
Этот протокол направлен на подкожную индукцию биолюминесцентной клеточной линии колоректального рака HCT-116 на модели иммунодефицитной мыши с последующей неинвазивной биолюминесцентной визуализацией с использованием системы IVIS и штангенциркуля для мониторинга прогрессирования и роста опухоли. Использование люминесцентных клеток обеспечивает количественный подход в режиме реального времени для отслеживания развития опухоли и ответа на терапевтические вмешательства, снижая потребность в инвазивных процедурах. Для имплантации опухолевых клеток требуется когорта мышей (n = 12), а интенсивность люминесценции измеряется для создания стандартизированной модели для терапевтических испытаний. Объем опухоли обычно рассчитывается с использованием только измерений длины и ширины или ширины.
Современная методология обеспечивает последовательное формирование опухоли при минимизации вариабельности°, что в конечном итоге повышает надежность доклинической оценки. Результаты этого исследования будут способствовать совершенствованию моделей опухолей для тестирования лекарств и повышению трансляционного потенциала доклинических исследований в клинических приложениях. Используя передовые методы визуализации и воспроизводимый экспериментальный дизайн, это исследование направлено на повышение точности и эффективности оценки лекарств in vivo для лечения колоректального рака.
Введение
Колоректальный рак (КРР) является серьезным бременем для глобального здравоохранения, входящим в число наиболее распространенных и смертельно опасных злокачественных новообразований1. Разработка надежных доклинических моделей имеет важное значение для оценки новых терапевтических подходов, поскольку традиционные анализы in vitro не могут в полной мере охватить сложность роста опухоли и реакции на лекарственные препараты в живой системе. Модели in vivo , особенно мышиные, были использованы для получения ценной информации о биологии опухоли, что позволило исследователям оценить эффективность потенциальных методов лечения в контролируемой среде.
Использование люминесцентных клеток КРР в мышиных моделях представляет собой значительный прогресс в доклинических исследованиях, позволяющий осуществлять неинвазивный мониторингпрогрессирования опухоли в режиме реального времени. Данное исследование направлено на создание стандартизированного протокола для подкожной индукции опухоли и визуализации IVIS для отслеживания динамического роста опухоли. Модель подкожного введения была выбрана из-за ее технической простоты, воспроизводимости и легкости продольного мониторинга опухоли. Используя биолюминесцентную визуализацию, исследователи могут получить точные, поддающиеся количественной оценке данные о развитии опухоли и терапевтических реакциях без необходимости усыплять животных внескольких временных точках.
Система визуализации IVIS является мощным инструментом для оценки опухолевой нагрузки с высокой чувствительностью и специфичностью, повышая воспроизводимость и точность исследований in vivo . Это исследование послужит основой для будущих терапевтических оценок, обеспечивая стандартизированный и эффективный подход к доклиническим испытаниям лекарств для лечения колоректального рака. Совершенствуя методы индукции опухолей и внедряя передовые методы визуализации, это исследование способствует преодолению разрыва между доклиническим и клиническим применением в онкологии4.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животные содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, в соответствии с руководящими принципами, установленными этическим комитетом Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Мурсия) (No A13240502). Проверки проводились еженедельно квалифицированным персоналом в соответствии с R. D. 1201/2005.
1. Животные
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией все животные должны быть надежно и безопасно пристегнуты. При работе с мышами с иммунодефицитом (т.е. голыми мышами-атимиками, такими как Crl: NU(NCr)-Foxn1nu), важно поддерживать стерильность. В текущем исследовании использовались 12 атимических голых мышей в возрасте 5 недель (20-22 г для самок и 22-26 г для самцов) в начале эксперимента (50% самцов). Все анестезии и экспериментальные процедуры проводились в Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación центра, с одобрения комитета по институциональной этике (протокол No A13240502) и в соответствии с испанским законодательством (R.D. 1201/2005).
- Перед началом анализа акклиматизируйте мышей в возрасте 4 недель к животному центру примерно на 1 неделю. Впоследствии проведите следующие процедуры.
2. Подготовка поголовья D-люциферина
- Приготовьте рабочий раствор 15 мг/мл биолюминесцентного субстрата D-люциферина и калийной соли в предварительно подогретом фосфатно-солевом буфере (PBS) в конической пробирке внутри шкафа биобезопасности. Переверните трубку несколько раз, чтобы раствор хорошо гомогенизировался.
- Пропустите раствор через шприцевой фильтр 0,2 мкм для стерилизации.
- Стерилизованный раствор разложить по 1 мл непрозрачных микропробирок и хранить при температуре -20 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Люциферин чувствителен к свету.
3. Препарирование внеклеточного матрикса
- Разморозьте гидрогель коммерческого внеклеточного матрикса (ВКМ), не содержащий фенола-красного, на ночь на льду в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C5.
- В день инъекции держите ЭКМ на льду и с помощью предварительно охлажденной микропипетки P1000 введите 200 мкл ЭКМ в стерильные пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать микротрубки с широким отверстием. Сведите к минимуму изменения температуры и избегайте повторных циклов замерзания-оттаивания. - Перед приготовлением инъекций предварительно охладите шприцы и иглы на льду, чтобы предотвратить резкие изменения температуры ВКМ.
4. Отслоение и подсчет клеток
- Пластину биолюминесцентных клеток HCT-116 (ATCC клеточной линии CCL-247-LUC2) в колбах T75 за несколько дней до индукции опухоли для обеспечения достаточного количества клеток. Поддерживайте клеточную культуру при 37 °C, 5%CO2 и при необходимости заменяйте среду6.
- В день эксперимента тщательно отсасывайте питательную среду, чтобы не потревожить адгезивные клетки.
- Промойте клетки 8 мл стерильного PBS (предварительно подогретого при 30 °C на водяной бане) для удаления остатков сыворотки.
- Добавьте 2 мл теплого Trypsin-EDTA (0,05%) на флакон и выдерживайте при 37 °C в течение 4-5 минут. Следите за отслоением клеток под перевернутым микроскопом. Если ячейки остаются прикрепленными, осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы помочь отсоединению.
- Нейтрализуйте трипсин, добавив 10 мл полной питательной среды, содержащей фетальную бычью сыворотку (FBS).
- Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Промойте колбы еще 2 мл свежей среды, чтобы собрать оставшиеся клетки, и добавьте смывки в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугировать клеточную суспензию при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
- Аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл посевной среды для достижения однородной суспензии.
- Подсчет ячеек в камере Нейбауэра или автоматическом счетчике ячеек. Определите жизнеспособность клеток, смешав 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и подсчитав жизнеспособные клетки под инвертированным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте достаточное количество клеток для исследования: не менее 3 × 106 жизнеспособных клеток на одну мышь. - Ресуспендируйте клетки в стерильном PBS (предварительно нагретом до 30 °C на водяной бане) и модифицируйте концентрацию жизнеспособных клеток до конечной концентрации 2 ×10 7 клеток/мл с помощью PBS. Приготовьте аликвоты объемом 200 μл.
5. Настройте предметы снаряжения и обезболите животных.
- Включите систему визуализации не менее чем за 4 часа до визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям системы, чтобы разрешить этап инициализации, включая регулировку параметров интенсивности света и времени экспозиции камеры в зависимости от соотношения сигнал/шум. Эта настройка должна быть установлена вручную в зависимости от условий эксперимента. - Взвесьте животных и рассчитайте объем D-люциферина, который необходимо ввести (200 мкл раствора 15 мг/мл на 20 г животного).
- Очистите и продезинфицируйте камеры визуализации и шкаф.
- Определите и безопасно удерживайте каждую мышь для анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наденьте две пары перчаток, чтобы защитить руки от случайных уколов иглой во время подкожной инъекции. - Обезболить мышей 2% изофлураном в кислороде при расходе 1,8-2,0 л/мин. Включите аспиратор одновременно с насосом для анестезии.
6. Подготовка клеток к инъекциям
- Смешайте 200 мкл 2 × 107 биолюминесцентных клеток CRC/мл с 200 мкл ECM в криовиальной камере внутри биобезопасного шкафа. Аккуратно пипетируйте пипеткой P1000, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и диссоциации.
- Переложите смесь объемом 400 мкл в шприц объемом 1 мл, удалите пузырьки воздуха и немедленно приступайте к инъекции.
- Безопасно откупорьте иглу, всегда сохраняя стерильность иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать индивидуальные иглы для каждого животного, чтобы свести к минимуму загрязнение. Для каждой мыши используется новая игла, чтобы предотвратить заражение перекрестной мышью. - Прикрепите иглу 25 G и отрегулируйте содержимое шприца до 200 μл, удаляя любые пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции обычно делаются с 200 мкл, что приводит к получению 2 × 106 клеток за инъекцию. - Свободно вставьте иглу обратно в колпачок, не касаясь ни колпачка, ни иглы, пока животное удерживается.
7. Индукция подкожных опухолей
- Выньте мышь из камеры, как только она будет обезболиваена, и поместите морду животного в отверстие, поставляющее тот же анестетик.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае насадка была изготовлена с использованием перчатки. - Поместите животное на правый бок на ровную поверхность. Кончиками пальцев недоминантной руки аккуратно ущипните и приподнимите кожу животного в нижнем левом квадранте.
- Перед введением сначала сделайте аспирацию, чтобы убедиться в правильном размещении иглы. Вставьте иглу скошенной вверх доминирующей рукой, на две трети в подтянутую кожу, параллельно телу, стараясь очень осторожно не уколоть пальцы или не проколоть двойные перчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное размещение должно приводить к отрицательному давлению и отсутствию аспирации в ступице иглы. - Введите содержимое шприца (200 μл) в подтянутую кожу прямо между двумя пальцами. Подержите немного, прежде чем медленно вытащить иглу. Извлеките иглу после подкожной инъекции и безопасно выбросьте ее в контейнер для острых предметов.
8. Внутрибрюшинное введение D-люциферина
- Перед возвращением животного в наркозную камеру вводят D-люциферин внутрибрюшинно (ВП) в концентрации 150 мг/кг массы тела с исходным раствором 15 мг/мл в инсулиновом шприце 30 г (200 мкл на 20 г животного).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо переносится инъекция до 0,5 мл. - Вручную удерживают, спинной лежачей (брюшной стороной вверх), при этом краниальный (головной) конец животного направлен вниз. Позвольте содержимому кишечника продвинуться вниз.
- Держа иглу скошенной стороной вверх и слегка под углом 15-20°, протолкните иглу в брюшную полость так, чтобы кончик иглы как раз проникал в брюшную стенку левого нижнего брюшного квадранта животного.
- Медленно введите D-люциферин во внутрибрюшинную полость, извлеките иглу и безопасно выбросьте ее.
- Поместите мышь в анестезиологическую камеру и дайте ей стабилизироваться в течение примерно 5 минут. Через 15 минут приступайте к визуализации in vivo .
Примечание: Постройте кинетическую кривую D-люциферина для каждой новой модели животного, чтобы определить время пикового сигнала. В нашем случае световое излучение достигло пика примерно через 15 минут при визуализации in vivo .
9. Визуализирующий анализ in vivo
- Поместите животное, находящееся под полным наркозом, в камеру системы визуализации, на правом боку. Убедитесь, что животное правильно выровнено по отношению к камере и источнику света, чтобы запечатлеть область опухоли.
- Откройте связанное программное обеспечение. Выберите режим визуального или фотографического изображения , чтобы подтвердить положение животного. Сохраните данные и измените имя папки.
- Выберите режим биолюминесцентной визуализации и установите его на автоматический. Делайте биолюминесцентные снимки и следите за светом опухоли на экране компьютера.
- Как только визуализация будет завершена, верните животное в клетку и понаблюдайте за любыми осложнениями.
- Выполните постобработку, сначала масштабируйте биолюминесцентный свет так, чтобы все опухоли мышей показывали одинаковый масштаб, обычно от 1e6 до 1e8.
- Настройте область интереса (ROI) вокруг опухоли для анализа и скопируйте ее для дальнейшего анализа. Измерьте рентабельность инвестиций и экспортируйте эти результаты для дальнейшего анализа. Вставьте ранее созданные и скопированные ROI того же размера для последующих опухолей.
- Выключите систему в соответствии с инструкциями производителя и очистите камеру визуализации. Выключите насосы для экстракции и анестезии вместе с потоком кислорода.
10. Измерение объема опухоли
- Обезболивайте животных изофлураном для измерения опухоли. Поместите животное в устойчивое положение и накройте его голову. Быстро обездвижите животное.
- Измерьте длину, ширину и глубину опухоли с помощью откалиброванного цифрового штангенциркуля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте измерения быстро, так как животное начнет просыпаться примерно через 1 минуту после извлечения из анестезиологической камеры. - Повторите измерения и рассчитайте среднее значение.
- Рассчитайте объем по формуле для сферических или эллиптических опухолей:
Для сферических опухолей 7
(1)
Для опухолей эллипсоида 8
(2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму систематическую ошибку измерения, все измерения опухоли в рамках исследования должны выполняться одним и тем же оператором. Кроме того, следует отметить, что в день индукции опухоли точное измерение часто является сложной задачей, поскольку опухолевая масса еще не полностью затвердела.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол позволяет вводить человеческие клетки в модель мыши с иммунодефицитом, что позволяет выращивать эти опухолевые клетки in vivo, что всегда более физиологически актуально, чем in vitro. Крайне важно убедиться, что условия эксперимента максимально воспроизводимы, что опухоли содержат одинаковое количество жизнеспособных клеток и что они имплантируются в сопоставимое и постоянно доступное место.
Для проверки чувствительности биолюми...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол подкожной индукции люминесцентных клеток колоректального рака на атимической обнаженной модели мыши представляет собой стандартизированный и воспроизводимый подход к формированию опухолей и мониторингу в режиме реального времени. Во-первых, важно отметить, что такие исследования обычно проводятся в течение 28 дней, при этом измерения люминесценции проводятся в день индукции опухоли, а затем еженедельно. И наоборот, измерения объема опухоли с помощью штангенциркуля не проводятся ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этом исследовании.
Благодарности
ACS и CNN являются членами "Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spain" и имеют гранты на получение докторской степени от UCAM. Авторы выражают благодарность платформам Animal Facility в IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Мурсия), где проводился доклинический анализ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл непрозрачные микротрубки | Эппендорф | 30125215 | Хранение D-люциферина |
| Коническая трубка объёмом 15 мл | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Материал для клеточной культуры |
| Advanced Dulbecco' Модифицированный Eagle Medium (DMEM) | Термо Фишер Сайентифик | 1152046 | Реагент для культуры клеток |
| Athymic Nude Mouse | Река Чарльз | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Иммунодефицитная голая мышь |
| Биолюминесцентные раковые клетки человеческой толстой кишки HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 идеально подходит для биолюминесценции in vivo |
| D-люциферин Пирс | Термо Фишер Сайентифик | 15215733 | Для измерения биолюминесценции |
| Внеклеточная матрица (ECM) | Корнинг | 356231 | Матригелева матрица для клеточной инвазии |
| Сыворотка плода для быка | Термо Фишер Сайентифик | 10500064 | Реагент для культуры клеток |
| Наконечники фильтрующих пипетов | Финнтип, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Чтобы избежать образования воздушных пузырьков |
| Инсулиновый шприц 25 г 1 мл | Иберомед | JERINRAYS29 | Для имплантации клеточной линии HCT-116 |
| Инсулиновый шприц 30 г 0,5 мл | DH Material medico | 9.41652E+15 | Для управления D-люциферином |
| Система изображений IVIS с программным обеспечением Living Image | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Сканер биолюминесценции и флуоресценции |
| Гепарин Needle Sterican | VWR | 612-0153 10 | Введение D-люциферина и имплантации HCT-116 |
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) | VWR | 392-0042P | Раствор суспензии клеток для отсечения и имплантации HCT-116 |
| Trypsin-EDTA | Термо Фишер Сайентифик | 11590626 | Реагент для культуры клеток |
| Фляга T-75, обработанная TC | STARLAB | CC7682-41 | Материал для клеточной культуры |
Ссылки
- Brough, D., Amos, H., Turley, K., Murkin, J. Trends in subcutaneous tumour height and impact on measurement accuracy. Cancer Inform. 22, 11769351231165181(2023).
- Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
- Evans, J. P., et al. Development of an orthotopic syngeneic murine model of colorectal cancer for use in translational research. Lab Anim. 53 (6), 598-609 (2019).
- Song, W. -J., et al. Colorectal cancer mouse metastasis model combining bioluminescent and micro-computed tomography imaging for monitoring the effects of 5-fluorouracil treatment. Transl Cancer Res. 12 (10), 2572-2581 (2023).
- Francescone, R. A., Faibish 3rd, M., Shao, R. A. A Matrigel-based tube formation assay to assess the vasculogenic activity of tumor cells. J Vis Exp. (55), e3040(2011).
- Li, C., Lau, H. C. -H., Zhang, X., Yu, J. Mouse models for application in colorectal cancer: Understanding the pathogenesis and relevance to the human condition. Biomedicines. 10 (7), 1710(2022).
- Jensen, M. M., Jørgensen, J. T., Binderup, T., Kjær, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16(2008).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Anim. 42 (6), 217-224 (2013).
- Jensen, M. M., Jørgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16(2008).
- Vedder, A. R., et al. Effects of Corynebacterium bovis on engraftment of patient-derived chronic-myelomonocytic leukemia cells in NSGS mice. Comp Med. 69 (4), 276-282 (2019).
- Evans, M. S., et al. A synthetic luciferin improves bioluminescence imaging in live mice. Nat Methods. 11 (4), 393-395 (2014).
- Jain, S. Kinetic model for designing a cancer therapy. Cancer Cell Int. 2 (1), 13(2002).
- Chiu, W. -C., Ou, D. -L., Tan, C. -T. Mouse models for immune checkpoint blockade therapeutic research in oral cancer. Int J Mol Sci. 23 (16), 9195(2022).
- Peyton, S. R., Platt, M. O., Cukierman, E. Challenges and opportunities in modeling the dynamic tumor matrisome. BME Front. 4, 0006(2023).
- Ravoori, M. K., et al. Magnetic resonance imaging and bioluminescence imaging for evaluating tumor burden in orthotopic colon cancer. Sci Rep. 9 (1), 6100(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
