Method Article

3D-визуализация с высоким разрешением без меток и машинное обучение для анализа кишечных органоидов с помощью низкокогерентной голотомографии

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем пошаговый протокол для получения трехмерной визуализации органоидов с высоким разрешением, без меток и с использованием низкокогерентной голотомографии. Этот протокол подробно описывает подготовку органоидных культур, получение изображений и вычислительный анализ изображений, что позволяет в режиме реального времени визуализировать структурную динамику и реакцию лекарств в живых органоидах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точная, безметочная визуализация кишечных органоидов имеет решающее значение для изучения их морфологии, динамики роста и реакции на стимулы окружающей среды. Голотомография (ГТ) обеспечивает трехмерную (3D) визуализацию живых органоидов с высоким разрешением без необходимости использования флуоресцентных маркеров, тем самым сводя к минимуму фототоксичность и сохраняя целостность образца. Фазовая визуализация в режиме реального времени позволяет непрерывно отслеживать структурные и функциональные изменения без применения меток. Используя показатель преломления в качестве собственного контраста изображения, этот метод позволяет количественно оценить биофизические свойства, такие как объем, плотность белка и содержание белка. Данные изображений далее обрабатываются с помощью сегментации на основе машинного обучения и извлечения признаков для поддержки согласованного анализа с высокой пропускной способностью. В этом протоколе подробно описан полный экспериментальный рабочий процесс для использования низкокогерентной HT в исследованиях органоидов, охватывающий подготовку органоидов, получение изображений и анализ данных на основе машинного обучения. Интегрируя вычислительную сегментацию и количественные оценки, этот подход позволяет объективно оценивать ключевые свойства органоидов, включая жизнеспособность, структурную организацию и реакцию на лекарственные препараты. Возможность фиксировать морфологические изменения в режиме реального времени с субклеточным разрешением делает этот протокол весьма применимым для исследований на основе органоидов в регенеративной медицине, моделировании заболеваний и фармацевтическом скрининге. Изложенная здесь пошаговая методология способствует воспроизводимости и широкой адаптации в различных органоидных системах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды представляют собой трехмерные (3D) миниатюрные версии органов, выращенных из стволовых клеток, способные воспроизводить ключевые структурные и функциональные особенности реальных органов in vitro1. Исследователи разработали органоидные системы для широкого спектра тканей, включая кишечник, мозг, легкие, печень и почки, каждая из которых демонстрирует самоорганизующуюся архитектуру и разнообразие типов клеток, напоминающее его аналог in vivo . Отражая архитектуру нативных органов и многоклеточную сложность, органоиды служат мощными модельными системами для изучения развития человека, регенерации тканейи механизмов заболеваний. Они стали ключевыми инструментами для моделирования заболеваний и разработки лекарств, позволяя исследователям изучать пути заболевания и тестировать новые методы лечения на специфических для пациента 3D-тканях в лаборатории2. Примечательно, что органоиды также имеют многообещающие перспективы в регенеративной медицине3: ткани, полученные из органоидов, могут быть привиты in vivo для восстановления повреждений, как это было продемонстрировано на примере органоидов кишечника и печени, что подчеркивает их потенциал для восстановления функции органов4. Эта универсальность делает органоиды незаменимыми в современных биомедицинских исследованиях и персонализированной медицине.

Учитывая их многоклеточный состав и трехмерную структурную сложность, захват и анализ динамики органоидов имеет решающее значение. Тем не менее, традиционные методы визуализации сталкиваются со значительными ограничениями в разрешении органоидных структур и динамики, часто создавая 2D-снимки, которые не могут представить их полное физиологическое состояние.

Светлопольная микроскопия является широко используемым неинвазивным методом захвата органоидов. Он удобно отслеживает рост и морфологию, но обеспечивает ограниченный контраст в неокрашенных 3D-образцах. Кроме того, в нем отсутствует оптическое сечение, что приводит к плохому разрешению внутренних структур. Органоиды кажутся в основном прозрачными, что затрудняет обнаружение мелких деталей под поверхностью6. Фазовый контраст улучшает видимость, преобразуя фазовые сдвиги в разность интенсивностей, выявляя общую архитектуру (например, центральный просвет) без окрашивания. Несмотря на свою полезность для наблюдений в реальном времени, фазовый контраст страдает от артефактов ореола, низкого разрешения и ограниченной глубины проникновения, что делает его менее эффективным для болеетолстых органоидов.

Для анализа микроструктуры органоидов и клеточного состава широко используется серийное срезирование с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) и иммуноокрашивание на основе антител8. Усовершенствованные методы обработки тканей, такие как встраивание парафина с фиксированным формалином (FFPE) и криосекция, улучшают сохранение морфологии, при этом FFPE обеспечивает превосходные результаты9. Встраивание органоидов в гидрогели, такие как агароза, и центрифугирование выравнивают несколько образцов в одном срезе, повышая эффективность анализа. Окрашенные H&E срезы опухолевых органоидов, полученных от пациента, отражают исходную гистологию опухоли, в то время как иммунофлуоресцентное окрашивание выделяет такие маркеры, как CK8для идентификации клеток. Тем не менее, эти методы не позволяют контролировать живые органоиды и могут привести к появлению таких артефактов, как сморщивание ткани или деформация во время разреза.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия широко используется для визуализации органоидов, получая оптические срезы с высоким разрешением (субмикрометровые), которые позволяют детально визуализировать органоидную архитектуру и клеточный состав11,12. Тем не менее, конфокальная визуализация 3D-органоидов обычно ограничена поверхностными слоями (глубиной до 100 мкм) и может быть трудоемкой и фототоксичной из-за лазерного излучения с точечнымсканированием13. Световая флуоресцентная микроскопия (LSFM) преодолевает некоторые из этих ограничений, освещая только плоскость изображения, достигая быстрой объемной визуализации целых органоидов с минимальным фотообесцвечиванием и фототоксичностью14,15; Однако этот метод часто требует очистки тканей для оптимальной визуализации толстых образцов. Кроме того, глубина визуализации LSFM ограничена несоответствиями рассеяния света и показателя преломления (RI), которые могут быть смягчены с помощью адаптивной оптики, многоракурсной визуализации и оптимизированных длин волн возбуждения16. Монтаж образцов также приводит к структурным деформациям, в то время как большие 3D-наборы данных создают вычислительные проблемы при хранении и анализе. Последние достижения, в том числе усовершенствованные методы генетической маркировки, новые реагенты для очистки, адаптивная оптика и анализ изображений на основе искусственного интеллекта, устраняют эти ограничения, что делает LSFM все более пригоднойдля исследований органоидов.

Несмотря на эти достижения, методы 3D-флуоресцентной визуализации создают ряд проблем для долгосрочного мониторинга живых органоидов. Во-первых, использование флуоресцентного мечения приводит к фототоксическим эффектам и нарушает биологические процессы, создавая проблемы длядлительных исследований в реальном времени. Во-вторых, мечение на основе антител страдает от ограниченного проникновения из-за диффузионных барьеров внутри плотных органоидных структур, что требует передовых методов проникновения и очистки тканей, которые требуют более 10 дней инкубации для использования первых и вторичных антител. В-третьих, трансфекция и стабильная экспрессия флуоресцентных белков в органоидах остаются неэффективными, поскольку традиционные подходы к доставке генов испытывают трудности в 3D-средах. В-четвертых, методы оптической очистки, необходимые для глубокой визуализации, часто приводят к потере флуоресцентного сигнала и искажению тканей, что требует оптимизированных протоколов очистки, которые обеспечивают баланс прозрачности и сохранения флуоресценции20.

Чтобы устранить эти ограничения, голотомография (ГТ) была представлена в качестве метода визуализации немеченых живых органоидов с высоким разрешением с течением времени. Также известная как 3D-количественная фазовая визуализация, HT представляет собой безметочный метод с высоким разрешением, который позволяет количественно визуализировать органоиды в режиме реального времени, сохраняя при этом их естественное физиологическое состояние. Принцип работы ГТ аналогичен рентгеновской компьютерной томографии; путем захвата нескольких изображений 2D оптического поля при различных условиях освещения, 3D RI-распределение немаркированного образца реконструируется с помощью обратного волнового уравнения, решающего 21,22,23. ГТ широко применяется в различных областях биологии, включая гематологию24,25, фазовую конденсацию в клеточной биологии26, микробиологию27 и гистопатологию28. В последнее время его возможности 3D-визуализации с высоким разрешением и без меток все чаще используются для исследования органоидов 21,22,23,29, предлагая неинвазивный подход к изучению их структурной и функциональной динамики.

В этом исследовании мы представляем подробный протокол использования низкокогерентной ГТ в долгосрочном мониторинге органоидов тонкого кишечника (сио) тонкого кишечника мышей без меток. Этот метод позволяет в режиме реального времени визуализировать рост органоидов и реакцию на лекарства в течение 24 часов, обеспечивая при этом количественные измерения объема органоидов, плотности белка и содержания белка, способствуя тщательному анализу поведения органоидов на основе данных. Чтобы исследовать морфологические изменения в органоидах, мы обрабатывали образцы цисплатином, химиотерапевтическим агентом на основе платины, который, как известно, индуцирует апоптоз путем формирования поперечных связей ДНК и ингибирует клеточнуюрепликацию. В то время как 3D-визуализация RI фиксирует структурные детали, систематический анализ необходим для количественной оценки динамики органоидов. Для достижения этой цели мы интегрируем ilastik, набор инструментов сегментации31 на основе машинного обучения, чтобы дифференцировать органоидные области от фона. Этот протокол описывает весь рабочий процесс, включая подготовку органоидных культур, получение 3D HT, сегментацию на основе машинного обучения и количественный анализ томограмм RI. Предлагая масштабируемую, воспроизводимую и неинвазивную среду визуализации, этот подход устанавливает новый стандарт для исследований органоидов с широким применением в моделировании заболеваний, регенеративной медицине и скрининге лекарств.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех материалах, инструментах и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, представлена в Таблице материалов. В качестве альтернативы могут использоваться аналогичные продукты от разных производителей. Схематический процесс работы всего протокола представлен на рисунке 1.

1. Подготовка образцов

  1. Приготовление питательной среды sIO
    1. Приготовьте имеющуюся в продаже питательную среду в соответствии с инструкциями производителя. Простерилизовать питательную среду путем фильтрации через фильтрующую установку 0,22 мкм.
      Примечание: Если среда полностью приготовлена в стерильных условиях в колпаке для клеточных культур и все компоненты предварительно стерилизованы (например, поставляются в стерильных флаконах и флаконах), то фильтрация через фильтр 0,22 мкм может не быть строго необходимой.
    2. Аликвоту 15 мл приготовленной среды разложить по стерильным пробиркам для хранения. Нагрейте аликвотированную среду до комнатной температуры (15 - 25 °C) перед использованием в органоидной культуре.
  2. Размораживание приклада sIO
    1. Быстро разморозьте замороженный органоидный бульон в течение 2 минут на водяной бане при температуре 37 °C. Переложите размороженную органоидную суспензию в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 150 x g в течение 3 минут, чтобы гранулировать органоиды.
    2. Осторожно удалите надосадочную жидкость, чтобы вымыть ДМСО, сводя к минимуму возможные цитотоксические эффекты.
    3. Добавьте среду и свежий внеклеточный матрикс (ВКМ) в соотношении 1:4 и аккуратно пипетируйте, чтобы обеспечить равномерную ресуспендию гранулы. Дозируйте по 15 мкл на купол в каждую лунку 48-луночного планшета. Держите ECM на льду, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
    4. Поместите планшет вверх дном в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO2 на 1 час, чтобы обеспечить полимеризацию ECM. После полимеризации осторожно добавьте в каждую лунку по 200 мкл свежей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол совместим с различными коммерческими чашками для визуализации и планшетами для лунок. Отрегулируйте объем фильтрующего материала в соответствии с типом скважины, чтобы убедиться, что купол ECM полностью погружен в воду.
  3. Пассирование sIO
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды имеют тенденцию прилипать к наконечникам пипеток. Чтобы свести к минимуму адгезию, предварительно смочите наконечники пипеток со средой.
    1. Аспират отработанная среда. Добавьте 200 μL раствора для восстановления клеток в каждую лунку и инкубируйте при 4 °C в течение 30 минут, чтобы облегчить деградацию ECM и извлечение органоидов.
    2. Соберите органоидную суспензию с помощью аккуратного пипетирования и перенесите ее в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте при 150 х г в течение 3 мин, затем осторожно удалите надосадочную жидкость.
    3. (Дополнительный) Чтобы пройти как одиночные клетки, выполните один из следующих способов диссоциации:
      1. Ферментативный метод: Добавьте в гранулу 100 μL раствора для диссоциации одиночных клеток и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в инкубаторе в течение 1-2 минут. Добавьте 150 мкл среды для нейтрализации. Выполните пипетирование или аккуратное постукивание. Центрифугируйте при 150 х г в течение 3 мин и удалите надосадочную жидкость, оставив только гранулу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной инкубации, так как длительное воздействие может быть очень вредным для клеток.
      2. Механическая диссоциация: Ресуспендировать гранулу в 200 мкл питательной среды. С помощью пипетки P200 проводите пипетку вверх и вниз в 20–30 раз, чтобы механически диссоциировать органоиды на более мелкие фрагменты или отдельные клетки. Центрифугируйте при давлении 150 x g в течение 3 минут, затем аспирируйте надосадочную жидкость и удерживайте гранулу.
    4. Добавьте фильтрующий материал и свежий ECM в соотношении 1:4 и аккуратно пипеткайте, чтобы обеспечить равномерную ресуспендию гранулы. Дозируйте по 15 мкл на купол в каждую лунку 48-луночного планшета.
    5. Поместите планшет вверх дном в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO2 на 1 ч, чтобы ЭХМ мог полимеризоваться.
    6. После полимеризации добавьте 200 μL свежей питательной среды в каждую лунку и заполните пустые внешние лунки PBS для предотвращения испарения. Заменяйте питательную среду каждые 2-3 дня и пропускайте органоиды еженедельно. Отрегулируйте интервал пассования в соответствии с желаемым размером органоида.
  4. Медикаментозное лечение
    1. Приготовьте 10 мМ стоковый раствор цисплатина, растворив 3,00 мг порошка цисплатина (МВт ≈ 300,05 г/моль) в 1 мл ДМСО. Вортсируйте ненадолго и защитите раствор от света с помощью янтарных трубок или обернув их алюминиевой фольгой.
    2. Для приготовления обрабатываемой среды разбавляют 10 мМ цисплатина в массе 1:1000 в полной культуральной среде для сио до получения конечной концентрации 10 мкМ цисплатина и 0,1% ДМСО.
    3. Для управления транспортным средством приготовьте 0,1% ДМСО в питательной среде в соответствии с конечной концентрацией ДМСО без цисплатина.
    4. Удалите отработанную среду из культур sIO и аккуратно замените ее 10 мкМ цисплатинсодержащей средой или контрольной средой, содержащей только ДМСО.
    5. После обработки перенесите образцы в инкубатор системы визуализации.

2. Низкокогерентная голотомографическая визуализация с использованием операционного программного обеспечения

  1. Подготовка образцов для визуализации
    1. Нанесите 15 мкл купола органоидной ЭКМ на чашку для визуализации #1.5 с покровным дном, следуя процедуре, описанной в шагах 1.3.1-1.3.4. Поместите каждый купол в чашку как можно ближе к центру для оптимального изображения.
    2. Перед полимеризацией инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 минуты, чтобы органоиды осядли на дно.
    3. Поместите планшет вверх дном в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 на 1 час для полимеризации ECM. Затем аккуратно добавьте достаточное количество питательной среды, чтобы полностью погрузить органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем среды, чтобы убедиться, что органоиды полностью погружены в воду в соответствии с размером чашки для визуализации с покровным дном.
    4. Через 5 дней после пассажа промойте образец в 2-3 раза PBS непосредственно перед визуализацией, чтобы удалить мусор и уменьшить оптические артефакты.
  2. Настройка образа
    1. Включите контроллер окружающей среды, чтобы сохранить жизнеспособность пробы. Блок управления камерой автоматически регулирует температуру до 37 °C и концентрациюCO2 до 5%.
    2. Нажмите кнопку «Дверца» на передней панели прибора, чтобы открыть дверцу. Добавьте воду для формирования тонкого слоя внутри камеры, чтобы предотвратить высыхание питательных сред.
    3. Поместите чашку для визуализации в подходящий держатель для сосудов, вставьте ее в камеру для визуализации и закрепите ее с помощью штифта, чтобы предотвратить движение. Убедитесь, что блюдо прочно прикреплено к держателю сосуда без опрокидывания.
    4. Закройте дверцу прибора с помощью кнопки «Дверца », чтобы заблокировать внешние световые помехи.
    5. Запустите программу TomoStudio X и авторизуйтесь. Нажмите «Пуск », чтобы открыть главное окно.
    6. Нажмите « Добавить проект » в левом верхнем углу и назначьте параметры эксперимента (например, название проекта, тип среды, тип образца и т. д.). Панель образцов будет создана автоматически. Убедитесь, что назначен правильный тип среды для использования соответствующего RI в эксперименте.
    7. Нажмите на «Нужная скважина» на панели и нажмите «Создать» вверху, чтобы зарегистрировать скважины как образцы.
    8. Нажмите «Настройка ROI » в правом верхнем углу, чтобы определить область интереса (ROI) в тарелке. После того как все параметры будут заданы, нажмите «Запустить эксперимент » в правом нижнем углу, чтобы открыть окно получения изображения.
    9. Нажмите «Загрузить судно» в правом верхнем углу. Появится светлопольное изображение. Отрегулируйте положение по оси Z с помощью кнопок +Z и -Z для фокусировки.
    10. На вкладке Одно изображение настройте размер ROI. Захват органоидов в пределах поля зрения 160 μм x 160 μм и получение осевых стеков глубиной до 140 μм. Для более крупных органоидов получите несколько томограмм RI и изображений сшивки, установив флажок « Визуализация мозаики » внизу.
    11. Перейдите на вкладку Интервальная съемка, чтобы настроить долгосрочную визуализацию. При необходимости задайте продолжительность и время интервала. В этом эксперименте покадровая визуализация проводилась с интервалом в 10 минут в течение 24 часов, а анализ проводился с интервалом в 2 часа в течение той же продолжительности.
    12. Щелкните значок Сканировать , чтобы зафиксировать текущее местоположение ROI. Вручную центрируйте купол ECM с помощью визуализации в светлом поле. Нажмите кнопку BF, чтобы настроить значения интенсивности и экспозиции для визуализации в светлом поле.
    13. Выберите ROI , переместив поле ROI, которое появится на панели «Предварительный просмотр». Как только желаемый ROI будет найден, нажмите «Добавить точку » внизу. Появится список точек визуализации.
    14. Нажмите кнопку Получить, чтобы начать создание образа. Будут получены исходные данные изображения.
  3. Получение изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс генерирует общий файл Tomocube (TCF) из необработанных данных изображения. Необработанные данные изображения должны быть обработаны в файл TCF, который содержит несколько типов изображений, таких как томограмма RI и проекция максимальной интенсивности. Томограмма RI представляет собой 3D-распределение RI образца, а проекция максимальной интенсивности показывает наибольшее значение RI для каждого бокового положения в плоскости XY.
    1. Перетащите файлы необработанных изображений на сервер обработки HTX. Нажмите кнопку «Обработать », чтобы создать файл TCF из файла необработанного изображения.
    2. Для просмотра томограмм RI, сгенерированных в файле TCF, используйте средство просмотра TomoAnalysis, MATLAB или Python. Чтобы просмотреть файл TCF в MATLAB, используйте такие функции, как h5info и h5read. Аналогично, в Python используйте пакет h5py для чтения файлов H5.

3. Анализ изображений

  1. Сегментация изображений на основе машинного обучения
    1. Экспортируйте файл изображения TCF в формат HDF5 (дополнительный файл кодирования 1), чтобы убедиться, что данные представлены в многомерном формате, совместимом с ilastik.
    2. Откройте ilastik и перейдите в раздел «Файл > новым проектом». Выберите «Классификация пикселей » в разделе «Рабочие процессы сегментации». Сохраните файл проекта в указанном каталоге.
    3. Загрузите файл HDF5, перейдя к пункту 1. Вкладка «Входные данные». Нажмите кнопку Добавить новый файл, выберите подходящий набор данных H5 и убедитесь, что назначены правильные каналы изображений.
    4. Перейдите к пункту 2. Вкладка «Выбор функций» для выбора соответствующих объектов (Цвет/Интенсивность, Грань, Текстура) для оптимизации сегментации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор функций может варьироваться в зависимости от набора данных и характеристик изображения. Для текущего анализа были выбраны следующие характеристики: Цвет/Интенсивность (σ = 1,60), Край (σ = 3,50) и Текстура (σ = 1,60). В зависимости от сложности изображения может потребоваться оптимизация на основе эвристического подхода. Кроме того, для определения оптимального набора параметров можно использовать функцию Suggest Features > Run Feature Selection в ilastik.
    5. В 3. Тренировочная вкладка, обозначьте органоидные и неорганоидные области, применяя мазки кисти разных цветов. Чтобы повысить точность сегментации, тщательно аннотируйте области вокруг границ.
    6. Нажмите кнопку Live Update, чтобы просмотреть результаты сегментации и внести необходимые уточнения.
    7. Перейдите к пункту 4. Экспорт прогнозов. В поле Выбор источника выберите Простая сегментация , чтобы экспортировать помеченные прогнозы. Нажмите кнопку Экспортировать все, убедившись, что в качестве выходного документа выбран формат .h5 или .tiff, в зависимости от требований к последующему анализу.
  2. Количественный анализ признаков
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап протокола выполняется в MATLAB, при этом каждая процедура подробно описана в Дополнительном файле кодирования 2.
    1. Объединив томограмму RI с изображением маски, создайте замаскированное изображение RI, включающее только органоидную область.
    2. Используя замаскированное изображение RI, рассчитайте количественные параметры, такие как объем органоидов, плотность белка и содержание белка.
      1. Объем: Вычислите общий объем органоида путем умножения количества пикселей в сегментированной маске на разрешение пикселей для X, Y и Z. Вычислите количество пикселей, подсчитав все значения вокселей в массиве маски, помеченной органоидом, с помощью встроенной функции MATLAB Sum.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение в пикселях определяется системой обработки изображений и может быть найдено в группе Данные > 3D атрибуты в структуре HDF5.
      2. Плотность белка: Рассчитайте плотность белка путем вычитания среднего значения RI среды из среднего органоида RI и деления его на приращение показателя преломления белка.
        1. RI среды: Перед анализом измерьте RI окружающей среды с помощью рефрактометра.
        2. Среднее значение RI: Определите среднее значение RI органоида путем усреднения значений RI вокселей, расположенных внутри маски органоида.
        3. Приращение показателя преломления белка (α): Используйте ранее сообщенную эмпирическую константу, полученную в результате исследований приращения показателя преломления.
      3. Содержание белка: Рассчитайте общее содержание белка путем умножения объема, определенного на шаге 3.2.2.1, на плотность белка, полученную на шаге 3.2.2.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан схематический рабочий процесс для 4D-визуализации и количественного анализа SIO. Этот протокол обеспечивает непрерывную визуализацию в реальном времени и всестороннюю оценку ИОО с помощью четырехэтапного процесса: культура, 4D-визуализация, обработка изображений и количественный анализ (рис. 1D).

После 5-дневного инкубационного периода зрелые сио были перенесены в чашки с покровным дном для визуализации с помощью ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Голотомография представляет собой мощный подход к визуализации живых органоидов с высоким разрешением без меток, преодолевая многие проблемы, связанные с традиционными методами визуализации. В этом протоколе мы описываем всестороннюю методологию применения низкокогерентной ГТ в исследованиях sIO, позволяющую в режиме реального времени количественно визуализировать морфологию органоидов, динамику роста и реакцию на медикаментозное лечение. Интеграция сегментации на основе машинного обучен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. и Y.K.P. имеют финансовые интересы в Tomocube Inc., компании, которая коммерциализирует голотомографию и инструменты количественной фазовой визуализации.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемым правительством Кореи (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), Корейским институтом развития технологий (KIAT) в рамках Международной программы совместных исследований и разработок (P0028463) и грантом Корейского фонда регенеративной медицины (KFRM), финансируемым правительством Кореи (Министерством науки и ИКТ и Министерством здравоохранения и социального обеспечения) (21A0101L1-12). Сбор данных осуществлялся компаниями M.J.L. и J.H.L., при этом компания J.H.L. отвечала за обработку данных, а компания J.M.C. отвечала за анализ данных. В написании рукописи принимали участие все авторы. Мы выражаем нашу благодарность Чулмин О и Чунгха Ли за ценные технические обсуждения и помощь в подготовке фигур.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48-луночный планшет Корнинг3548Блюдо из культуры
Решение для восстановления клеток Корнинг354253Разложение Матригеля
ЦисплатинSupelcoPHR1624Н/Д
Диметилсульфоксид (ДМСО)Сигма-ОлдричД2650Транспортное средство
Трубка EppendorfКорнингMCT-175-C-SН/Д
Процессинговый сервер HTXTomocube Inc., КореяН/ДСервер обработки данных
ХТ-Х1Tomocube Inc., КореяН/ДОперационное программное обеспечение
ИластикН/ДН/ДНабор инструментов для сегментации на основе машинного обучения
Держатель сосуда для посуды для визуализации Tomocube Inc., КореяН/ДДержатель для тарелки для визуализации
IntestiCult Органоидная среда для роста (мышь)Технологии стволовых клеток#06005Коммерчески доступная готовая питательная среда 
МатлабМатематические работыМатлаб 2024аПрограммное обеспечение для обработки изображений
МатригельКорнинг356231ECM для 3D органоидов
Millipore  Steritop  Вакуумный фильтр для бутылокМеркS2GPT05RE0,22 μ Фильтровальная установка M для стерилизации среды
Органоиды кишечника мышейТехнологии стволовых клеток#70931Н/Д
РефрактометрАТАГОР-5000Калькулятор показателя преломления
ТомоДишнTomocube Inc., Корея901002-02#1.5 Чашка для визуализации с покровным дном
TomoStudio XTomocube Inc., КореяН/ДПрограммное обеспечение для обработки изображений
ТриплGibco12604Диссоциация одиночных клеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles