Методическая статья

Асимбиотическое проращивание и регенерация листьев находящейся под угрозой исчезновения лекарственной орхидеи Hemipilia cucullata из зрелых семян

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68541

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол для оптимизации асимбиотического прорастания семян, развития рассады и удлинения побегов у Hemipilia cucullata. Протокол также позволяет индуцировать протокормообразные тела из стерильных эксплантов листьев, способствуя эффективному размножению in vitro для сохранения и устойчивого использования этой находящейся под угрозой исчезновения лекарственной орхидеи.

Аннотация

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) — наземная орхидея, широко ценящаяся за свои лечебные свойства и декоративную привлекательность, однако ее дикие популяции находятся под угрозой исчезновения из-за деградации среды обитания, низкой жизнеспособности семян и ограниченного успеха опыления. Чтобы поддержать его сохранение и устойчивое использование, в этом исследовании был разработан оптимизированный протокол для асимбиотического прорастания зрелых семян, развития протокорма, удлинения побегов и индукции протокормообразного тела (PLB) из стерильных эксплантов листьев. Семена, культивируемые в жидкой среде 1/2 MS с добавлением 0,5 мг/л NAA, показали всхожесть 72 ± 6%, что значительно выше, чем в контрольной (46%) и твердой среде (31%), при этом в жидкой культуре всхожесть начиналась примерно на 21 день раньше. Протокормы субкультивировали на среде B5, содержащей 0,5 мг/л BA, 0,2 мг/л NAA и 100 мл/л кокосовой воды, что приводило к эффективной пролиферации. Через 5-6 недель проростки переносили в среду для удлинения побегов (В5 с добавлением 0,5 мг/л БА и 1 мг/л NAA), где они демонстрировали устойчивое удлинение побегов и здоровое листообразование. Для индукции PLB наибольшая скорость индукции (44,3 ± 5,1%) была достигнута на среде МС, содержащей БА (3 мг/л) и NAA (0,2 мг/л). Этот всеобъемлющий и воспроизводимый протокол может стать эффективной платформой для широкомасштабного размножения и сохранения ex-situ H. cucullata, предлагая ценную поддержку усилиям по восстановлению этой находящейся под угрозой исчезновения орхидеи.

Введение

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, широко известная как орхидея cucullate neottianthe orchid, является дикой наземной орхидеей родом из умеренной Евразии и широко распространена от Польшидо Японии. Первоначально классифицированный как род Neottianthe, этот вид был недавно переклассифицирован в род Hemipilia, секция Neottianthe, на основании молекулярных доказательств2. Растение вырастает из подземных клубней и достигает до 30 см в высоту, выпуская розоватые или пурпурно-красные цветки, расположенные в одностороннем колосе. Благодаря изящной форме и привлекательной окраске своих цветков, он обладает значительной декоративной ценностью. Кроме того, все растение признано лекарственным растением во многих странах, где оно широко используется для различных терапевтических целей, включая лечение сердечных заболеваний, улучшение кровообращения, облегчение ушибов и содействие заживлению переломов 3,4. Недавние фитохимические исследования выявили несколько антоцианов у этого вида, таких как цианидин 3-оксалилглюкозид, хризантемин и цианин, которые обладают антиоксидантными и вазопротекторными свойствами и могут способствовать его лечебномуэффекту.

В настоящее время дикие популяции H. cucullata сталкиваются с угрозами потери среды обитания и нарушения окружающей среды, что приводит к резкому сокращению популяции, а в некоторых районах приближает вид к исчезновению. Однако сохранение этого вида особенно сложно из-за трудностей в его естественном распространении. В дикой природе H. cucullata размножается как клонально, так и половым путем, но оба режима неэффективны. Естественное клональное размножение происходит медленно и нечасто, в то время как половое размножение ограничено из-за плохой успешности опыления и низкой жизнеспособности семян 9,10. Более того, полевые исследования выявили заметно несбалансированную возрастную структуру с нехваткой молодых особей и ограниченным естественным пополнением, особенно в условиях антропогенного или пирогенного стресса 7,8,11. Семена H. cucullata, как и многих орхидей, мелкие, лишены эндосперма и требуют специфических грибковых партнеров для прорастания, что еще больше усложняет естественную регенерацию. В результате, несмотря на широкое географическое распространение, численность популяции и возрастная структура диких популяций сокращаются, а риски локального исчезновения возрастают. Таким образом, создание эффективного метода искусственного быстрого размножения имеет важное значение как для сохранения ресурсов зародышевой плазмы, так и для устойчивого использования этого вида орхидей.

Среди доступных методов размножения симбиотическое прорастание, основанное на связи с микоризными грибами орхидей, может точно имитировать естественные процессы, но часто его трудно стандартизировать из-за его зависимости от видоспецифичныхгрибных партнеров. В противоположность этому, асимбиотическое проращивание представляет собой более простую и воспроизводимую альтернативу, которая широко используетсяв системах культивирования тканей орхидей. Несмотря на то, что протоколы асимбиотического прорастания и быстрого размножения были разработаны для нескольких лекарственных орхидей, таких как Bletilla, Dendrobium и Cypripedium 16,17,18,19, все еще требуется видоспецифичная оптимизация питательных сред и условий культивирования тканей для H. cucullata.

В этом исследовании мы использовали зрелые семена H. cucullata , полученные путем ручного перекрестного опыления диких особей (рис. 1A) на горе Тяньму в восточном Китае (30°20′ с.ш., 119°22′ в.д.), чтобы создать и оптимизировать эффективный протокол асимбиотического прорастания семян, развития рассады и удлинения побегов. Кроме того, мы разработали систему регенерации из эксплантов листьев путем индукции PLB, тем самым способствуя сохранению и выращиванию этой находящейся под угрозой исчезновения лекарственной орхидеи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента наденьте средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Выполняйте все процедуры под ламинарным проточным колпаком для стерильности. Обращайтесь с этанолом и гипохлоритом натрия с осторожностью и утилизируйте отходы в соответствии с правилами безопасности лаборатории.

1. Стерилизация капсул и экстракция семян

  1. Поместите капсулу в стакан. Добавьте 1-2 капли моющего средства и тщательно промойте водопроводной водой, чтобы удалить поверхностные загрязнения.
  2. Промойте капсулу под проточной водой в течение 5 минут. Впитайте поверхностные воды стерильной абсорбирующей бумагой.
  3. Перенесите капсулу на стерильный верстак для дальнейшей дезинфекции.
  4. Погрузите капсулу в 75% (v/v) этанол на 30 с.
  5. Стерилизуйте капсулу, погрузив ее в 50 мл 20% (v/v) раствора гипохлорита натрия (разбавленного из коммерческого отбеливателя, содержащего ~5% доступного хлора), с добавлением 2 капель неразбавленного бытового средства для мытья посуды на 10-12 мин.
  6. Пять раз промойте капсулу стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить остатки дезинфицирующего средства.
  7. С помощью стерильного скальпеля удалите примерно 1 мм как от верхушки, так и от основания (плодоножочного конца) капсулы.
  8. Сделайте небольшой надрез на верхнем конце капсулы, чтобы обнажить семена. Поместите капсулу в стерильную чашку Петри для экстракции семян.

2. Подготовка питательной среды

  1. Приготовьте жидкую среду 1/2 МС: Используйте половину концентраций макронутриентов по сравнению со стандартной средой МС, оставьте все остальные компоненты, как в среде МС, добавьте 20 г/л сахарозы и α-нафталинуксусную кислоту (NAA, 0,5 мг/л) и отрегулируйте pH до 5,8.
  2. После кипячения сразу же разложите среду по 500 мл питательных бутылок (количество бутылок можно регулировать в соответствии с желаемым масштабом распространения).
  3. Дозированную среду поместить в автоклав и стерилизовать при 121 °C в течение 15 минут. После стерилизации извлеките среду из автоклава и дайте ей остыть до комнатной температуры перед использованием.

3. Проращивание семян

  1. С помощью стерильных щипцов равномерно распределите примерно 500-600 семян в каждую бутылку со средой (приготовленной на шаге 2.3). Дайте семенам впитать воду и осесть на дно жидкой среды.
  2. Поддерживайте культуру при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота и интенсивностью света 36 моль·м-2·с-1.
  3. Наблюдайте за прорастанием семян еженедельно, фиксируйте морфологические изменения и делайте фотографии для документации.
  4. Примерно через 12 недель, когда большинство семян прорастет, подсчитайте количество пророщенных семян и рассчитайте скорость прорастания. Используйте стерильную петлю инокуляции, чтобы случайным образом собрать одну петлю жидкой среды, содержащей семена. Перенесите отобранные семена в чашку Петри или предметное стекло и наблюдайте под стереомикроскопом.
  5. Подсчитайте количество семян, образовавших протоклубнелуковицы, по мере проращивания. Рассчитайте норму всхожести по следующей формуле:
    Всхожесть (%) = (Количество пророщенных семян/Общее количество семян в образце) × 100.

4. Субкультура и распространение протокорма

  1. Приготовьте пролиферативную среду, добавив среду B5 (3,21 г/л) в кокосовую воду (100 мл/л), 6-бензиламинопурин (БА, 0,5 мг/л) и NAA (0,2 мг/л). Добавьте 20 г/л сахарозы и 7,3 г/л агара и отрегулируйте pH до 5,8.
  2. После кипячения сразу же разложите среду по бутылкам для культур объемом 150 мл (количество бутылок можно регулировать в соответствии с желаемым масштабом размножения).
  3. Дозированную среду поместить в автоклав и стерилизовать при 121 °C в течение 15 минут. Перед использованием дайте среде остыть до комнатной температуры.
  4. Асептически переложите 10-15 пророщенных протоклубков (размером 0,3-1 см) на бутылку на питательную среду, приготовленную на шаге 4.3.
  5. После 5-недельного периода культивирования оцените статус пролиферации и запишите количество вновь образованных протоклубнелуковиц на флаконе.
  6. Продолжайте культивирование разрастающихся протоклубнелуковиц еще 4-6 недель, чтобы дать возможность развиться в ростки с видимой верхушкой побега и ризоидными структурами перед переносом для удлинения побегов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте культуру при температуре 25 °C, с 12-часовым циклом свет/темнота и интенсивностью света 36 моль·м-2·с-1.

5. Удлинение побега

  1. Подготовьте среду для удлинения побегов, добавив в среду B5 (3,21 г/л) BA (0,5 мг/л) и NAA (1 мг/л). Добавьте 20 г/л сахарозы и 7,3 г/л агара и отрегулируйте pH до 5,8.
  2. После закипания разложите среду по 150 мл питательных бутылок (количество бутылок можно регулировать в соответствии с желаемой масштабностью распространения).
  3. Отбирайте здоровые саженцы (размером 1-2 см, без явного почернения или полного пожелтения) для удлинения побегов. Используя стерилизованные и охлажденные щипцы, асептически перенесите 8-12 ростков в каждую 150 мл питательную бутылочку, содержащую свежую среду, приготовленную на этапе 5.1. Следите за тем, чтобы ростки были равномерно распределены внутри каждой бутылки.
  4. После 5-недельного периода удлинения побегов выберите саженцы с полностью развитыми побегами и здоровыми листьями для отбора образцов листьев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте культуру при температуре 25 °C, с 12-часовым циклом свет/темнота и интенсивностью света 36 моль·м-2·с-1.

6. Индукция PLB из листовых эксплантов

  1. Приготовьте индукционную среду PLB, добавив базальную среду MS (4,43 г/л) с BA (3 мг/л) и NAA (0,2 мг/л). Добавьте 20 г/л сахарозы и 7,3 г/л агара и отрегулируйте pH до 5,8.
  2. После закипания разложите среду по 150 мл питательных бутылок (количество бутылок можно регулировать в соответствии с желаемой масштабностью распространения).
  3. Отбирайте здоровые саженцы после 5 недель удлинения побегов (шаг 5.4). Полностью разложенные стерильные листья вырезать, удалить верхушечную область и края и разрезать каждый лист на сегменты примерно 0,5 см × 0,5 см с помощью стерильного скальпеля в асептических условиях.
  4. Поместите 10 сегментов листа на индукционную среду PLB адаксиальной поверхностью вверх, обеспечивая плотный контакт с поверхностью среды.
  5. После 5 недель культивирования оцените количество успешно индуцированных PLB и рассчитайте частоту индукции (%). Кроме того, запишите среднюю высоту бутонов (см) и количество бутонов, образующихся на одном экспланте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте культуру при температуре 25 °C, с 12-часовым циклом свет/темнота и интенсивностью света 36 моль·м-2·с-1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этапы протокола, представленные в этом исследовании, представляют собой оптимизированную методологию, разработанную в результате серии сравнительных экспериментов, направленных на улучшение асимбиотической прорастаемости семян, пролиферации протокорма, удлинения побегов и индукции PLB у H. cucullata. Например, при отборе ГРР для стимулирования прорастания семян NAA способствует развитию эмбрионов и поглощению воды, в то время как BA способствует дифференцировке почек и делению клеток. Было показано, что их синер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Капсулы орхидей обычно содержат многочисленные семена, часто превышающие десять тысяч, но их естественное прорастание крайне ограничено из-за отсутствия эндосперма и их высокой зависимости от симбиотических грибных ассоциаций и специфических сигналов окружающей среды. Таким образом, асимбиотические протоколы проращивания получили широкое распространение, чтобы обойти эти ограничения и обеспечить эффективное размножение рассады в контролируемых условиях. Например, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1/2 MS Базовые соли с витаминамиКулаберРМ1061
6-БензиламинопуринШанхай Маклин Биохимическая Технология Ко., Лтд.1214-39-7
Сила агараПекин Химбейс Технолоджи Ко., Лтд.1400
Чистая скамейкаСучжоу Очистительное оборудование Ко., Лтд.SW-CJ-2G
Кокосовая водаХОРОШИЙ ФЕРМЕРhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
ОчищающийНаука и технология Liby6920174756784
Gamborg B5 MediumЛаборатории фитотехнологийГ398
Стеклянная бутылкаMorebetter Biotechnology Co., Ltd.ОБТ-БЛ-240
Мурасигэ и Базальные соли СкугаЛаборатории фитотехнологийМ519
ПипеткаЭппендорф3123000268
Прецизионный балансМЕТТЛЕР ТОЛЕДО30834109
СПССМеждународная корпорация «Бизнес Машины»Программное обеспечение, используемое для тестирования статистической значимости
СахарозаSinopharm химический реагент Ко., Лтд.20210802
ТидиазуронШанхай Маклин Биохимическая Технология Ко., Лтд.51707-55-2
α-Нафталинуксусная кислотаШанхай Маклин Биохимическая Технология Ко., Лтд.86-87-3

Ссылки

  1. Chen, X., et al. Flora of China. , Science Press and Missouri Botanical Garden Press. Beijing, St. Louis, MO. (2009).
  2. Tang, Y., Yukawa, T., Bateman, M., Jiang, H., Peng, H. Phylogeny and classification of the East Asia Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers. BMC Evol Biol. 15 (1), 1-32 (2015).
  3. Minarchenko, M. Threatened medicinal plants of Ukraine: An assessment of the current protection status. J Plant Dev. 24, 117-131 (2017).
  4. Pant, B., Raskoti, B. Medicinal Orchids of Nepal. , Himalayan Map House Pv Ltd. Kathmandu, Nepal. (2013).
  5. Strack, D., Busch, E., Wray, V., Grotjahn, L., Klein, E. Cyanid 3oxalylglucoside in orchids. Naturforsch C. 41 (7-8), 707-711 (1986).
  6. Strack, D., Busch, E., Klein, E. Anthocyanin patterns in European orchids and their taxonomic and phylogenetic relevance. Phytochemistry. 28 (8), 2127-2139 (1989).
  7. Ilyina, N., Kozlovskaya, O. V. Dynamics of the population structure and abundance of the rare species Neottianthe cucullata (L Schlechter under conditions of pyrogenic load in the territory adjacent to the Buzuluksky Bor National Park (Samara region). Samara J Sci. 13 (2), 35-41 (2024).
  8. Khapugin, A., Chugunov, G., Silaeva, T., Kunaeva, E. Neottianthe cucullata (L Schltr. (Orchidacea Juss.), an endangered orchid in central Russia. Wulfenia. 23, 189-202 (2016).
  9. A method for the rapid propagation of Hemipilia cucullata. using its floral bracts as explants. China patent. , CN106993535A (2017).
  10. Johnson, D., Edwards, T. The structure and function of orchid pollinaria. Plant Syst Evol. 222, 243-269 (2000).
  11. Ilyina, V., Senator, S., Mitroshenkova, A., Kozlovskaya, O. Peculiarities of the Neottianthe cucullata population structure under industrial loads (Samara Oblast). AIP Conf Proc. 3184 (1), 8(2024).
  12. Zhang, L., et al. Symbiotic culture of three closely related Dendrobium species reveals a growth bottleneck and differences in mycorrhizal specificity at early developmental stages. Diversity. 14 (12), 1119(2022).
  13. Leng, C., Hou, M., Xing, Y., Chen, J. Perspective and challenges of mycorrhizal symbiosis in orchid medicinal plants. Chin Herb Med. 16, 172-179 (2024).
  14. Zoubi, L. Complexities and innovations in orchid germination: A review of symbiotic and asymbiotic techniques. J Plant Sci. 12 (4), 90-94 (2024).
  15. Chen, J., et al. Symbiotic and asymbiotic germination of Dendrobium officinale (Orchidaceae) respond differently to exogenous gibberellins. Int J Mol Sci. 21 (17), 6104(2020).
  16. JinYing, C., Xuefeng, W., Baocai, L., Yuqing, Z. Efficient germination system in asymbiotic culture of Bletilla striata (Thunb Reichb). f. Fujian J Agric Sci. 33 (2), 131-135 (2018).
  17. Mei, H., JiJun, K., ZhenYong, X., LiMing, Z., Hong, J. Study on seedlings of nonsymbiotic germination of Paphiopedilum wenshanense. J West China For Sci. 49 (3), 56-59 (2020).
  18. Teixeirada Silva, A., Cardoso, J. C., Dobránszki, J., Zeng, S. Dendrobium micropropagation: A review. Plant Cell Rep. 34, 671-704 (2015).
  19. Zeng, S., et al. Seed biology and vitro seed germination of Cypripedium. Crit Rev Biotechnol. 34 (4), 358-371 (2014).
  20. Cozzolino, S., Widmer, A. Orchid diversity: An evolutionary consequence of deception. Trends Ecol Evol. 20 (9), 487-494 (2005).
  21. Miura, C., et al. Autoactivation of mycorrhizal symbiosis signaling through gibberellin deactivation in orchid seed germination. Plant Physiol. 194 (1), 546-563 (2023).
  22. Bustam, B., Dixon, K., Bunn, E. vitro propagation of temperate Australian terrestrial orchids: Revisiting asymbiotic compared with symbiotic germination. Bot J Linn Soc. 176 (4), 556-566 (2014).
  23. Gogoi, K., Kumaria, S., Tandon, P. Ex situ conservation of Cymbidium eburneum Lindl.: a threatened and vulnerable orchid, by asymbiotic seed germination. 3 Biotech. 2, 337-343 (2012).
  24. Robinson, E. J., Kakati, J. P., Sebastinraj, S., Suriya, K. I vitro seed germination of Cymbidium aloifolium L Sw., a potential medicinal orchid from Eastern ghats of Tamil Nadu India. J Plant Biotechnol. 44, 343-348 (2017).
  25. Hossain, M., Sharma, M., Teixeirada Silva, J. A., Pathak, P. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Lindl. Sci Hortic. 123 (4), 479-487 (2010).
  26. Ibrahim, L., Jenkinson, P. Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae. Mycol Res. 106 (6), 705-715 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PLBex situ

Похожие статьи