Методическая статья

Томография со сканирующей просвечивающей электронной микроскопией в вирусологии: 3D-визуализация замороженных под высоким давлением сублимационных образцов

DOI:

10.3791/68568

⸱

6 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот видеопротокол иллюстрирует, как выполнять сканирующую, просвечивающую электронную микроскопическую томографию вирусологических образцов. Для достижения оптимальных результатов образцы подготавливаются путем замораживания под высоким давлением и последующей замораживания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электронная микроскопия (ЭМ) и особенно трехмерные (3D) методы ЭМ стали признанными методами в структурной вирусологии. Исследование вирус-индуцированных изменений клеточной ультраструктуры, таких как индуцированные вирусом Зика (ЗИК) фабрики репликации вируса Зика (ЗИКА) или органеллы репликации коронавируса, требует 3D-визуализации. Томография с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является широко используемым методом, несмотря на его ограниченность образцами толщиной до 200 нм. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) с фокусированным ионным пучком может производить 3D-данные больших объемов с изотропным, хотя, как правило, более низким разрешением. Альтернативные методы, такие как блочная сканирующая электронная микроскопия лица (BF-SEM), SEM-матричная томография или ПЭМ-визуализация серийных срезов, используются для визуализации больших объемов. Однако, по сравнению с ранее упомянутыми методами, эти методы достигаются за счет гораздо более низкого разрешения вдоль оси Z образца. Методом, который позволяет получить 3D-информацию об образцах толщиной до 1 мкм с изотропным разрешением в несколько нанометров, является томография на основе сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM).

Здесь мы представляем протокол подготовки замороженных, сублимационных и залитых смолой вирусологических образцов под высоким давлением и их анализа с помощью STEM-томографии. Этот протокол использует преимущества визуализации при комнатной температуре, сохраняя при этом биологическую ультраструктуру в состоянии, близком к естественному. Мы покажем два показательных примера вопросов, на которые можно ответить с помощью STEM-томографии. Во-первых, мы применяем протокол изучения морфогенеза вирионов вируса рекомбинантного везикулярного стоматита (ВСВ). Томограммы STEM предоставляют информацию о рекомбинантном почковании VSV, которая в противном случае недоступна для 2D-визуализации. Во-вторых, мы показываем корреляционную световую и электронную микроскопию (CLEM) с использованием визуализации резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) и STEM-томографию (FRET-3D-CLEM) пептидных нанофибрилл EF-C. Эта недавно опубликованная комбинация дает новое представление о поглощении и разборке пептидных нанофибрилл, усиливающих инфекцию, особенно с учетом большого объема, доступного для STEM-томографии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
Рисунок 1: Сравнение различных методов 3D-микроскопии с учетом разрешения, приборов, времени сбора данных и усилий. Максимально возможный объем метода находится между технически сложной крио-ПЭМ томографией, которая предлагает молекулярное разрешение, и световой микроскопией, где разрешение ограничено дифракционным пределом света. Сокращения: ТЭМ = просвечивающая электронная микроскопия; STEM = сканирующий TEM; SEM = сканирующая электронная микроскопия; FIB = сфокусированный ионный пучок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Структуры и системы, связанные с вирусами, охватывают масштаб от субангстремового режима (например, малые молекулы для виротерапии, изолированные вирусные белки) до нескольких метров (например, целые инфицированные организмы). Вирусные частицы находятся в диапазоне 20-1000 нм и в основном исследуются в их биологическом контексте, например, в клетках-хозяевах и клеточных линиях вируса-продуцента, которые находятся в диапазоне мкм. Таким образом, визуализация конкретных структур, связанных с вирусами, зависит от выбора метода, обеспечивающего достаточное поле зрения и подходящее разрешение. Изучение инфицированных вирусом клеток и фрагментов тканей опирается на методы микроскопии (рис. 1). В то время как обзорные изображения клеток и тканей могут быть получены с помощью классической световой микроскопии, внутриклеточные структуры, участвующие в репликации вируса, часто изучаются с помощью электронной микроскопии (ЭМ). Несмотря на то, что в настоящее время ЭМ в основном используется в фундаментальных вирусологических исследованиях, он также используется в диагностике 1,2, а также нашел свое применение в биофармацевтике3.

Часто двухмерные ЭМ-подходы, такие как классическая просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), не могут дать достаточного ответа на заданный биологический вопрос. В вирусологии это особенно актуально при изучении взаимодействий вирус-хозяин-клетка, таких как прикрепление и проникновение вириона, образование вирусных фабрик или морфогенез вирионов 4,5,6,7,8,9. Поэтому ЭМ-томография используется для анализа 3D-ультраструктуры биологических образцов. В принципе, существует два способа получения томограммы определенного образца: 1) пошаговое изображение серийных срезов, которые затем объединяются в стек 3D-изображений, или 2) получение проекций с разных углов обзора образца с последующей вычислительной реконструкцией информации в виртуальный стек изображений.

К методам первого типа относятся визуализация серийных срезов с помощью ПЭМ или СЭМ (СЭМ-матричная томография), серийная блочная СЭМ лица и томография сфокусированным ионным пучком (ФИБ)-СЭМ. В СЭМ и ПЭМ визуализации последовательных срезов отсутствует разрешение в z, которое ограничено толщиной среза, но обеспечивает большое поле зрения и полагается на оборудование, которое легко доступно в большинстве ЭМ-лабораторий4. Томография FIB-SEM может дать изотропное разрешение, но затраты на оборудование и обслуживание могут быть сложными, а визуализация целых клеток с изотропным разрешением занимает много времени 9,10.

Второй тип томографии основан исключительно на прохождении электронного пучка через образец. Это можно сделать с помощью двух различных методов визуализации: ПЭМ или сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM). В то время как ПЭМ-томография более распространена и проста в применении, толщина сечения ограничена ~200 нм. Таким образом, структуры, размер которых больше толщины сечения, такие как митохондрии, везикулы или вирионы, не могут быть визуализированы в пределах одной томограммы. STEM-томография дает возможность визуализировать образцы толщиной до 1 мкм11,12. Тем не менее, для этого требуется STEM с высоким напряжением ускорения (≥200 кВ) и установкой, поддерживающей большие углы наклона, а также малый угол полусходимости13. Несмотря на то, что STEM-визуализация является распространенным методом в материаловедении, она остается редкой методикой в биологических ЭМ-лабораториях.

В этой статье мы представляем прикладной подход к использованию STEM-томографии для вирусологических образцов. В связи с высокой сложностью и трудоемкостью ЭМ-томографии качественная подготовка образцов имеет решающее значение. В то время как криогенная ПЭМ (томография), несомненно, является золотым стандартом для исследований на молекулярном уровне, визуализация при комнатной температуре замороженных под высоким давлением замороженных и замороженных клеток обеспечивает надежное сохранение и четкость клеточной ультраструктуры 7,14. Вкратце, адгезивные клетки выращиваются на сапфировом диске и заражаются или обрабатываются по желанию. Затем клетки обездвиживаются путем замораживания их под высоким давлением при очень высоких скоростях охлаждения, что приводит к остекловыванию воды внутри. Затем воду заменяют растворителем, в то время как образцы контрастируют и медленно возвращают к комнатной температуре. Затем образцы постепенно погружают в смолу.

Существует множество протоколов для замораживания под высоким давлением и замораживания, которые различаются по механизму, системе носителя и составу образца. Были опубликованы подробные протоколы для замораживания под высоким давлением, в том числе один от Walther et al.15 и видеопротокол от Steyer et al.16, в котором основное внимание уделяется подготовке тканей к FIB-SEM с использованием микроволнового контрастного усиления. Для вирусологических исследований Read et al.17 и Romero-Brey18 опубликовали подробные протоколы подготовки инфицированных вирусом клеток путем замораживания под высоким давлением с помощью сапфировых дисков с последующим анализом с помощью электронной томографии. Ультратонкие срезы также были описаны ранее15,17. Обратитесь к цитируемой литературе для получения более подробной информации об этих подходах.

Здесь мы представляем рабочий процесс, который представляет собой адаптированную и обновленную версию ранее опубликованных протоколов 15,17 в паре впервые в паре с подробным видеоруководством. Протокол обеспечивает рабочий процесс подготовки образцов с использованием замораживания под высоким давлением, замораживания и погружения в эпоксидную смолу. Участки толщиной от 800 нм до 1000 нм разрезаются с помощью ультрамикротома. Наклонная серия приобретается с помощью STEM 200 кВ с помощью программного программного обеспечения EM tools. Этот протокол оптимизирован для адгезивных клеток и обеспечивает комплексный рабочий процесс, позволяя вносить изменения для других типов образцов, таких как тканевые или суспензионные клетки. О STEM-томографии в криогенных условиях см. работу группыМайкла Элбаума 19,20.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток

  1. Подготовка сапфировых дисков
    1. Очистите сапфировые диски, промыв 3 раза в 100% этаноле в течение 20 минут. Удалите остатки этанола, натянув диски на сухую фильтровальную бумагу. Оставьте диски в сушильной камере при температуре 37 °C не менее чем на 30 минут или до полного высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе используются сапфировые диски диаметром 3 мм и толщиной 0,16 мм. Для других систем, оптимизированных для тканевых или суспензионных клеток, см. Walther et al.15. Некоторые «советы и рекомендации» для культивируемых клеток и других систем предоставлены McDonald et al.21.
    2. Нанесите углеродное покрытие на сапфировые диски, поместив около 50 сапфировых дисков на чистое стекло часов и покрыв их углеродным слоем толщиной 10-15 нм с помощью устройства для нанесения углеродного покрытия. Запекайте диски в течение ночи при температуре 120 °C для стабилизации углеродного слоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для коррелятивных электромагнитных подходов введите систему координат: поместите сетку искателя поверх сапфировых дисков перед углеродным покрытием, чтобы сетка была видна как негатив на диске21.
    3. Чтобы впоследствии определить сторону сапфирового диска с углеродным покрытием, с помощью острого инструмента (например, кончика пинцера) нацарапайте на карбоне отметку, которую можно правильно прочитать только с одной стороны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем цифру «2» или аналогичную (Рисунок 2A, B). Пропустите этот шаг для сапфировых дисков с системой координат с покрытием.
    4. Храните сапфировые диски в сушильной камере при температуре 37 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется повторно использовать сапфировые диски, так как это увеличивает вероятность их поломки при замораживании под высоким давлением.
  2. Культура клеток
    1. Незадолго до помещения в клеточную культуру тлеющую сторону дисков, покрытую углеродным покрытием, с помощью тлеющего газоразрядного устройства, чтобы сделать их гидрофильными (например, 0,26 мбар с током 20 мА в течение 40 с). Затем простерилизуйте диски, подвергая их воздействию ультрафиолетового излучения в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие ультрафиолетового излучения в течение более 30 минут может повредить углеродное покрытие.
    2. С помощью стерильного пинцета поместите диски на дно чашки для культур, содержащей питательную среду, следя за тем, чтобы диски не плавали. Аккуратно засейте ячейки сверху. В случае, если сапфировые диски плавают в клеточных культуральных средах, свечение-разряд в течение более длительного времени при повторении эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы буква «2» была правильно ориентирована, то есть сторона с углеродным покрытием обращена вверх. Желателен монослой ячеек на дисках с конечным сливом ~80%. Рост клеток на сапфировых дисках может отличаться от такового в окружающей чашке для культур. Проверьте распределение и качество клеток на дисках с помощью микроскопа с инвертированным светом, прежде чем продолжить работу с протоколом. Распределение клеток можно улучшить, осторожно покачивая пластину во время засеивания клеток.
      Для суспензионных элементов покрытие сапфировых дисков с углеродным покрытием поли-L-лизином или использование капилляров, как описано впункте 15. Не подвергайте диски, покрытые поли-L-лизином, воздействию ультрафиолетового света, так как это может повредить покрытие из поли-L-лизина.
    3. Выполняйте любое желаемое лечение клеток (например, инфекцию, медикаментозное лечение), сохраняя сапфировые диски на месте. Обращайтесь с дисками осторожно, чтобы избежать отслоения ячеек или царапин на углеродном покрытии. Инкубируйте клетки соответствующим образом. Перед транспортировкой образцов в морозильную камеру высокого давления 1,7,22 проведите химическую префиксацию, например, 2,5% глутаральдегида, 1% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,3) или 4% параформальдегида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем инфицированные образцы покинут лаборатории уровня биобезопасности, соблюдайте все местные правила биобезопасности, применимые к модельной системе.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Замораживание под высоким давлением. (A) Сапфировые диски с углеродным покрытием с цифрой «2» (слева) или системой координат для корреляционного света и электронной микроскопии (справа). (B) Схематическое изображение сэндвича SD-золота SD при его подготовке к замораживанию под высоким давлением. Клетки, выращенные на дисках, обращены друг к другу и тем самым защищены в плотной полости. (C) Держатель для замораживания под высоким давлением, содержащий сэндвич SD. (D) Материалы и приспособления для загрузки держателя HPF: (1) Нагревательная пластина, (2) Стереомикроскоп, (3) Фильтровальная бумага, (4) Реакционная трубка, содержащая 1-гексадецен, (5) Пинцет, (6) Непокрытые SD, (7) Чашка Петри с золотыми прокладками, (8) Держатель HPF. (E) Настройка системы HPF: (1) LN-бокс для переноса замороженных образцов (см. также F), (2) фен для ускорения прогрева держателя HPF после заморозки, (3) Азотный дьюар для заправки LN-бокса. (F) LN-бокс для хранения замороженных образцов после замораживания под высоким давлением с центральным желобом (пунктирный контур), в котором можно открыть держатель HPF и безопасно работать с SD. Материалы, необходимые непосредственно после замораживания под высоким давлением: (1) Держатель для шести контейнеров с образцами, (2) Изолированный пинцет, (3) Контейнеры для образцов с крышкой. Контейнеры содержат небольшие отверстия и небольшие грузы (например, винт), чтобы они погружались в жидкий азот. Сокращения: SD = сапфировый диск; HPF = морозильная камера высокого давления; LN = жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Пробоподготовка для электронной микроскопии

  1. Замораживание под высоким давлением
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает замораживание под высоким давлением с помощью указанного морозильника высокого давления (HPF, Таблица материалов). Описанные шаги не должны сильно отличаться для других машин, так как они служат той же цели.
    1. Следуйте инструкциям производителя для настройки морозильной камеры высокого давления. Обеспечьте достаточную подачу жидкого азота (Рисунок 2E), включите машину и выполните пробный запуск.
    2. Настройте рабочее пространство для загрузки дисков в держатель HPF (рисунок 2D). Подготовьте следующие предметы: нагревательную пластину (1), стереомикроскоп (2), кусочки фильтровальной бумаги (3), реакционную трубку с гексадеценом в качестве наполнителя (4), пинцет (5), пустые/непокрытые сапфировые диски для замораживания нечетного количества SD с ячейками (6), золотые распорки (7) и держатель HPF (8, подробно на рисунке 2C).
    3. Подготовьте рабочее пространство для работы с замороженными образцами (рисунок 2E, F). Перед началом замораживания под высоким давлением подготовьте следующее оборудование:
      1. Подготовьте LN-бокс и заполните его жидким азотом (Рисунок 2E, F) для подготовки к обработке и переносу замороженных сапфировых дисков из держателя HPF в капсулы для хранения.
      2. Подготовьте небольшой дьюар (3 на рисунке 2E) и заполните его жидким азотом: будьте готовы к тому, что LN-бокс будет повторно заполнен жидким азотом несколько раз в процессе заморозки.
      3. Держите изолированный пинцет (2 на рисунке 2F) наготове.
      4. Подготовьте контейнеры для образцов, в которых будут храниться сапфировые диски после замораживания под высоким давлением (капсулы для хранения, 3 на рисунке 2F). Убедитесь, что у них есть крышка и несколько отверстий для залива жидкого азота и небольшие грузы (например, маленькие винты или что-то подобное), чтобы они не плавали. Промаркируйте емкости перед использованием и предварительно охладите их в LN-боксе.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем капсулы BEEM в качестве капсул для хранения.
    4. Храните образцы в инкубаторе рядом с морозильной камерой высокого давления, если ячейки не были предварительно прикреплены или если это невозможно, на нагреваемой пластине (1 на рисунке 2D) для поддержания физиологических условий (37 °C, 5%CO2) как можно дольше.
    5. Перед началом заморозки под высоким давлением убедитесь в достаточном количестве ячеек на сапфировых дисках и хорошем качестве ячеек. Для этого осмотрите диски с помощью микроскопа с инвертированным светом.
    6. Выполните заморозку под высоким давлением.
      1. Возьмите пинцетом один сапфировый диск из чашки для культивирования и поместите его в держатель HPF (рис. 2C) стороной с углеродным покрытием вверх («2» читается). Перед этим удалите излишки среды, быстро опустив диск на фильтровальную бумагу, но следите за тем, чтобы клетки не высохли.
      2. Опустите золотую распорку в гексадецен и аккуратно положите ее поверх сапфирового диска. Возьмите второй сапфировый диск и расположите его поверх золотой прокладки стороной с углеродным покрытием вниз, образуя сэндвич сапфирового диска - золотая прокладка - сапфировый диск с ячейками, направленными друг к другу. Убедитесь, что в полости для сэндвичей не задерживается воздух.
      3. Закройте держатель HPF. Выполняйте этот шаг аккуратно, но быстро, чтобы свести к минимуму нагрузку на образец, особенно для живых клеток, которые не имеют префикса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, содержащих канцерогенные, мутагенные или репротоксические (CMR) вещества, такие как химические фиксаторы, загрузите держатель HPF под вытяжной шкаф, чтобы свести к минимуму воздействие.
      4. Запустите процесс заморозки. Быстро вставьте держатель HPF в морозильную камеру высокого давления, заблокируйте ее в соответствии с инструкциями производителя и запустите процесс замораживания.
    7. Извлеките остеклованные образцы из держателя HPF. Быстро перенесите наконечник держателя HPF, по которому передаются замороженные сапфировые диски, в предварительно охлажденный LN-бокс. Осторожно извлеките диски из держателя HPF в центральное желоб в LN-боксе (пунктирная линия на рисунке 2F). После этого прогрейте держатель HPF и удалите остатки этанола или гексадецена, прежде чем приступить к сборке следующего бутерброда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента следите за тем, чтобы все, что соприкасается с дисками, было предварительно охлаждено в жидком азоте. Быстро выполните этапы переноса в атмосфере азота и храните диски в жидком азоте, чтобы избежать оттаивания образца. Заранее потренируйтесь в переносе держателя из ВПВ в LN-бокс, чтобы обеспечить плавный и быстрый переход. Процесс нагрева держателя можно ускорить после замораживания с помощью фена (2 на рисунке 2E).
    8. После извлечения сапфировых дисков из держателя, поместите их в маркированные емкости либо для передачи в морозозамещающее устройство, либо для хранения жидкого азота до дальнейшей обработки. Если сапфировые диски плотно уложены друг на друга после HPF, используйте скальпель для разделения сапфировых дисков перед заменой замораживанием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не сломать диски и избежать сдвигающих сил. Запланируйте достаточно времени для этого шага.
  2. Замораживание-замещение
    1. Настройте устройство замораживания в соответствии с инструкциями производителя. Заполните жидкость Дьюара жидким азотом и запустите программу предварительного охлаждения камеры образца до -90 °C. Убедитесь, что жидкого азота достаточно для всего процесса замены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Задействованные химические вещества опасны. Выполняйте все действия под вытяжным шкафом и соблюдайте местные рекомендации по охране окружающей среды, здоровья и безопасности (EHS).
    2. Приготовьте замещающий раствор, содержащий 0,1% (масс./об.) уранилацетата, 0,2% (масс./об.) тетраоксида осмия (OsO4) и 5% (v/v) воды в ацетоне. Чтобы приготовить объем в 6 мл (достаточный для заполнения 24 криоциалов, что равно максимальной емкости используемого здесь устройства для замещения), выполните следующие действия:
      1. Отвесьте 6 мг уранилацетата в стеклянный сосуд с плотной крышкой.
      2. Добавьте 300 μл 4% (мас./об.) тетраоксида осмия в воду.
      3. Закройте сосуд и обрабатывайте ультразвуком в течение 5 минут, чтобы растворить уранилацетат.
      4. Добавьте 5,7 мл ацетона, перемешайте и равномерно разделите раствор на криовиалы, совместимые с устройством для замораживания.
    3. Поместите закрытые криовиалы, содержащие раствор для замещения замерзания, в предварительно охлажденное устройство для замещения замораживания при температуре -90 °C и подождите, пока раствор также остынет до -90 °C (в течение примерно 20 минут).
    4. Заполните LN-бокс жидким азотом. Для переноса сапфировых дисков в морозозамещающее устройство предварительно охладите пинцет, скальпель и плоскогубцы (или большие пинцеты) в жидком азоте.
    5. Используйте предварительно охлажденный большой пинцет для переноса капсул с замороженными образцами под высоким давлением из резервуара для хранения в LN-бокс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы предотвратить размораживание образцов. При обработке образцов сразу после замораживания под высоким давлением этот этап можно пропустить.
    6. Перенесите замороженные под высоким давлением образцы в устройство для замораживания. Отделяйте сапфировые диски один за другим, сохраняя их в жидком азоте. Быстро переносите каждый диск по отдельности в криовиал с помощью замораживающего раствора, обеспечивая полное погружение диска. Закройте криовиал и немедленно поместите его обратно в устройство для замораживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время переноса храните криовиал в атмосфере жидкого азота, чтобы предотвратить нагревание раствора заменителя, но не в жидком азоте, чтобы предотвратить его замерзание. Держите флакон пальцами близко к крышке, чтобы избежать нагревания раствора заменителя. Обращайтесь с раствором заменителя с осторожностью, так как он содержит токсичные вещества.
    7. После того как все диски будут перенесены в устройство подстановки, запустите процесс замораживания подстановки. Установите устройство на постепенное повышение температуры в течение 16 ч от -90 °C до 0 °C, с 1 ч этапом инкубации при 0 °C с последующим постепенным повышением до 20 °C в течение 1 ч.
    8. Как только образцы достигнут 20 °C, немедленно продолжайте промывку образцов в течение 3 x 30 минут 100% ацетоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания элементов на дисках. Все последующие действия выполняйте под вытяжным шкафом. Соберите все отходы в подходящий контейнер и утилизируйте их в соответствии с местными правилами EHS.
  3. Внедрение
    1. Свежеприготовленную эпоксидную смолу следует приготовить в соответствии с инструкцией производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все действия с эпоксидной смолой под вытяжным шкафом. Мы рекомендуем подготавливать свежую смолу для каждой процедуры заделки из-за более низкой вязкости и, следовательно, лучшей инфильтрации проб.
    2. Для предварительного встраивания образцов инкубируйте образцы в растворе, содержащем 1/3 эпоксидной смолы и 2/3 ацетона, в течение 1 ч. Замените раствор на 2/3 эпоксидной смолой и 1/3 ацетоном и инкубируйте в течение 3 ч. Замените раствор 100% эпоксидной смолой и дайте ему поинкубироваться в течение ночи с открытой крышкой флакона, чтобы оставшийся ацетон испарился.
    3. На следующий день переложите сапфировые диски в новые, помеченные реакционные пробирки, заполненные свежеприготовленной эпоксидной смолой. Расположите диски горизонтально, опираясь на стенку реакционной пробирки, и убедитесь, что сторона с клетками в реакционной пробирке обращена вверх (цифра «2» читается под стереомикроскопом). Поместите реакционные пробирки с открытой крышкой в духовку при температуре 60 °C и дайте эпоксидной смоле полимеризоваться не менее 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо встроить фрагмент сапфирового диска, вставьте его с помощью полимеризованного наконечника смоляного блока предыдущего эксперимента: поместите наконечник в реакционную трубку, заполните пробирку свежей смолой и положите сломанный диск поверх полимеризованного наконечника.
      Любые одноразовые расходные материалы, загрязненные эпоксидной смолой, следует поместить в духовку при температуре 60 °C, чтобы смола полностью полимеризовалась перед утилизацией. Пинцет и другие предметы можно предварительно протереть этанолом.
    4. Погрузите кончик закрытой реакционной пробирки в жидкий азот примерно на 10 с. Затем извлеките блок смолы из реакционной трубки, ударив реакционной трубкой по столу. Сапфировый диск легко отделяется от углеродного покрытия, которое остается поверх встроенных элементов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ваша закладочная среда выдерживает изменения температуры, вызванные обработкой жидким азотом.
  4. Подготовка срезов STEM-томографии
    1. Подготовьте срезы, которые намного толще, чем ультратонкие срезы для ПЭМ-визуализации, обычно от 800 нм до 1 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка срезов для STEM-томографии незначительно отличается от обычной ультрамикротомии. Подробный протокол, описывающий подготовку срезов STEM-томографии, см. в работах Walther et al.15 и Villinger et al.10.
      Прежде чем приступить к подготовке срезов STEM-томографии, убедитесь в хорошем качестве клеток. Для этого выполните ультратонкий срез (~70 нм) и анализ ПЭМ (рис. 3D,E).
    2. Соберите срезы на медных сетках с параллельными стержнями, чтобы ни один стержень сетки не блокировал электронный пучок при наклоне образца под большими углами. Для лучшего крепления секций обработайте сетки 0,01% поли-L-лизина: приготовьте небольшую аликвоту 0,01% поли-L-лизина из 0,1% исходного раствора, обмакните сетки в аликвоту, тщательно высушите их, проведя ободком сетки по фильтровальной бумаге. Накальте решетки и используйте их для сбора секций.
    3. Срезы с коллоидным золотом обрабатывайте в качестве реперных маркеров для выравнивания ряда наклонов (см. раздел 3).
    4. Нанесите на секции углеродное покрытие, чтобы стабилизировать их и сделать более проводящими.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Контроль качества с помощью ПЭМ-различных внешних проявлений клеток после встраивания, обрезки и ультратонкого среза. (A) Элементы, залитые эпоксидной смолой, после удаления SD. Углеродный слой с поцарапанной буквой «2» остается на элементах, залитых смолой, и хорошо виден. Почти прозрачные ячейки равномерно распределены по грани блока. (Б) Обрезанная поверхность блока перед микротомией. Часть поцарапанных 2 до сих пор видна на поверхности смоляного блока. (C) Секции толщиной 70 нм, установленные на сетке ПЭМ. (D) Обзор ТЕА всего ультратонкого сечения. Обратите внимание на отверстия в сечении (белые стрелки), которые образуются в результате неполного проникновения смолы и являются распространенным артефактом. (E) Увеличенное изображение выбранной ячейки, отмеченной белым прямоугольником на рисунке (D). Как и на рисунке (D), на плазматической мембране видно неполное встраивание (белые стрелки); Тем не менее, остальная часть ячейки демонстрирует хорошую сохранность и встраивание. Масштабные линейки = 100 μм (D), 10 μм (E). Сокращения: SD = сапфировый диск; ПЭМ = просвечивающая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Визуализация

  1. Приобретение серии STEM tilt
    1. Настройте микроскоп в соответствии с рекомендациями производителя. Обеспечьте правильное выравнивание луча.
    2. Аккуратно засыпьте жидкий азот дьюаром в микроскоп.
    3. Выберите правильный держатель томографа в программном обеспечении для работы с микроскопом.
    4. Вставьте сетку в держатель. Обратите внимание, что стержни сетки ориентированы перпендикулярно оси наклона, чтобы стержни не блокировали электронный луч при больших углах наклона.
    5. Вставьте держатель в микроскоп.
    6. Выровняйте балку, выполнив следующие действия:
      1. Загрузите файл выравнивания, предоставленный производителем. Откройте клапан луча и работайте пока в режиме ПЭМ . Установите увеличение примерно 20 000x и установите стандартный фокус, нажав STD Focus.
      2. Найдите отверстие в образце. Это проще сделать в режиме малого увеличения (нажмите LowMag).
      3. Убедитесь, что отверстие не вставлено. Установите размер пятна на 1 и Альфа на 3. Сведите к минимуму луч на экране просмотра, повернув кнопку яркости против часовой стрелки, и отцентрируйте ее с помощью кнопок сдвига луча.
      4. Правильное выравнивание пистолета: На панели выравнивания программного обеспечения для работы с микроскопом выберите Пистолет и анодный воблер (Gun and anode wobbler). Отрегулируйте симметрию луча с помощью кнопок DEF/STIG . Убедитесь, что движение луча на флуоресцентном экране равномерно. Переместите самое яркое пятно к центру экрана с помощью кнопок SHIFT ; Отмените выделение «Все», когда закончите.
      5. Исправление стигматоров конденсатора: На той же панели выравнивания выберите CLA и воблер HT. Регулируйте с помощью кнопок DEF/STIG для достижения равномерного движения.
      6. Установите диафрагму конденсорного объектива: Увеличьте луч на флуоресцентном экране, поворачивая кнопку яркости по часовой стрелке. Вставьте самую маленькую диафрагму линзы конденсора и убедитесь, что она правильно выровнена по лучу, чередуя яркость. Если луч движется несимметрично на экране просмотра, вручную отрегулируйте диафрагму с помощью ручных приводов диафрагмы. Если апертура на флуоресцентном экране выглядит искаженной, снова откорректируйте стигматоры конденсатора CLA с помощью DEF/STIG (предыдущий шаг 3.1.6.5).
      7. Переключитесь в режим STEM (выберите ASID).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вы можете прервать диалог расслабления объектива через 5-10 секунд.
      8. Переместите предметный столик в тонкую область образца с высоким контрастом. Нажмите STD Focus и удалите все диафрагмы. Измените увеличение на 25 000 с размером пятна 1,5 нм, установите длину камеры в диапазоне от 80 до 120 см и выберите режим пятна.
      9. Изменяйте z-значение угломера до тех пор, пока ронхиграмма не станет видимой на экране просмотра. Измените длину камеры, если ронхиграмма слабая. Если он не круглый, используйте кнопку COND Stig для его регулировки.
      10. Вставьте самую маленькую диафрагму конденсорного объектива. С помощью ручных приводов диафрагмы центрируйте диафрагму вокруг ронхиграммы.
    7. Вставьте соответствующий детектор. Исходя из исследовательского вопроса, используйте детектор светлого поля и/или детектор темного поля. Активируйте режим сканирования и получите первое тестовое изображение образца.
    8. Выберите увеличение, большее, чем желаемое для томограммы (выше 800 000x). Правильная фокусировка и астигматизм: делайте это рядом, но не прямо в области интереса (ROI), чтобы предотвратить повреждение лучом критических областей образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Золотые реперные знаки могут облегчить этот шаг.
    9. Установите высоту эуцентрика , чтобы гарантировать, что ROI остается центрированным во всем диапазоне наклона (т.е. от -72° до 72°). Выберите функцию рядом с ROI, доведите ее до центра, сфокусируйтесь, исправьте астигматизм, и наклоните сцену ступенчато до - 72°. Отрегулируйте Z-положение держателя, чтобы функция оставалась по центру, и при необходимости отрегулируйте контрастность и яркость. При необходимости повторите это, ступенчато наклоняя до +72 °.
    10. Выберите поле зрения, вернувшись к ROI, сфокусируйтесь и получите обзорное изображение (рис. 4). Установите желаемое увеличение для серийного захвата наклона.
    11. Настройте автоматическую последовательную съемку изображений с наклоном в диапазоне от -72° до +72° и каждые 1,5°.
    12. Чтобы противодействовать механическим эффектам, возникающим при изменении направления наклона рабочей области, начинайте серию наклонов с угла, большего угла, чем тот, с которого нужно было начать изображение. При съемке в диапазоне от -72° до 72° начните с наклона предметного столика от 0° до -74°, а затем начните съемку на пути к +72°, получив первое изображение под углом -72°.
    13. Запустите автоматическую последовательную съемку данных о наклоне. Обязательно включите динамическую фокусировку в программном обеспечении для сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если регистрация серии наклона прерывается преждевременно, исправьте эуцентрическую высоту. Особенно при большом увеличении это может вызвать проблемы с автоматическим захватом последовательных данных наклона из-за смещения ROI из поля зрения.
      Часто используемым программным обеспечением для STEM и TEM томографии является SerialEM. Kirchweger et al.20 опубликовали видеопротокол для крио-STEM-томографии с использованием SerialEM, который может быть легко адаптирован для STEM-томографии при комнатной температуре.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Захват серии Tilt . (A) 200 кВ STEM. (B) Обзор STEM замороженной под высоким давлением сублимационной ячейки, встроенной в эпоксидную смолу. Серия наклонов, показанная на рисунке (C-E), была получена в позиции, отмеченной белым прямоугольником. (К-Е) Выбранные снимки серии с углом наклона получены в диапазоне от -72° до +72°. Для компьютерной реконструкции томограммы используются золотые реперные знаки с обеих сторон разреза. Кластеризованные реперные точки, подобные отмеченным белыми эллипсами, не могут быть использованы для реконструкции томограммы, но хорошо узнаваемы при больших углах наклона. Эти или подобные конструкции за пределами интересующей области полезны для установки эуцентрической высоты. Масштабная линейка = 1 μм (B). Сокращение: STEM = сканирующая просвечивающая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Реконструкция и сегментация томограмм

  1. Выполнение реконструкции томограммы (например, с помощью программного обеспечения Etomo программного пакета IMOD23).
    1. Выполните первое выравнивание ряда наклонов и восстановите томограмму с помощью утяжеленной обратной проекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол можно найти на веб-сайте IMOD: IMOD Tomography Guide (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Для обработки изображений, полученных с помощью детектора темного поля, см. ранее опубликованную работу11,13.
  2. Сегментируйте клеточные структуры (например, с помощью программного обеспечения, такого как 3DMOD из пакета IMOD или решений на основе искусственного интеллекта).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM-томография дает возможность визуализировать более толстые срезы, чем ПЭМ-томография, с изотропным разрешением в нанометровом диапазоне и, по сравнению с томографией FIB-SEM, обеспечивает относительно экономичный по времени рабочий процесс визуализации. В вирусологии это особенно полезно, поскольку позволяет визуализировать большое количество ультраструктурных особенностей для статистического анализа в 3D или при поиске редких событий. Здесь мы показываем два репрезентативных результата, которые демонстрируют, как STEM-томография может быть использована в отношении этих двух аспектов.

Визуализация почковающихся рекомбинантных вирионов VSV

Существует большое разнообразие вирусов, которые образуют частицы различных форм и размеров. Для анализа формы вирионов в вирусной суспензии часто бывает достаточно простого метода, такого как отрицательное окрашивание ПЭМ. Охарактеризовать морфологию вирионов в клеточном контексте сложнее. Это особенно верно для вирусов, которые образуют частицы с анизотропной морфологией, такие как rhabdoviridae. VSV — это рабдовирус, который образует пулевидные вирионы длиной ~180 нм. В суспензионных клетках вирионы ориентированы случайным образом, что затрудняет постоянное различие формы пули на 2D-изображениях (рис. 5A-C). Чтобы правильно определить форму пули всех рекомбинантных вирионов VSV в образце, необходим 3D-метод с изотропным разрешением, который также может предоставить объемную информацию на достаточно большой площади образца. Томограмма STEM может включать в себя множество полных вирионов в одном наборе данных (рис. 5D, E). Таким образом, можно получить изображение большого количества вирионов для статистического анализа, даже если получена только одна томограмма на клетку. Для сравнения, томограмма ПЭМ среза толщиной 200 нм может захватить только несколько полных рекомбинантных вирионов VSV (как отмечено на рисунке 5E).

figure-results-1
Рисунок 5: STEM-томография рекомбинантных сайтов почкования VSV. (A-C) Детали виртуального среза томограммы STEM, полученного из среза толщиной 800 нм, показывают, что форма пули не всегда видна из-за (A,B) различной ориентации вирионов. (C) Только вирионы, ориентированные параллельно плоскости обзора, представляют собой четко определенные пули. (D) Почковающиеся участки рекомбинантного VSV напоминают большие скопления вирионов без предпочтительной ориентации. (E) Вид томограммы сбоку демонстрирует возможность захвата многих полных рекомбинантных вирионов VSV в одном срезе с помощью STEM-томографии. В этом положении стек виртуальных изображений имеет толщину примерно 600 нм. Пунктирные линии представляют приблизительную толщину среза для ПЭМ-томографии (200 нм), в который будет включено только несколько полных вирионов в форме пули. Масштабная линейка = 500 нм (D). Сокращения: STEM = сканирующая просвечивающая электронная микроскопия; VSV = вирус везикулярного стоматита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Деградация нанофибрилл пептида EF-C

В контексте генной терапии интерес представляют пептидные нанофибриллы, усиливающие трансдукцию. В недавно опубликованном исследовании24 коррелятивная визуализация с использованием резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) и STEM-томографии (FRET-3D-CLEM) была использована для изучения поглощения и разборки нанофибрилл пептида EF-C. Высокая эффективность FRET, соответствующая парам FRET, которые находятся близко друг к другу, излучает красную флуоресценцию, соответствующую собранным фибриллам. Низкая эффективность FRET, соответствующая парам FRET, которые находятся далеко друг от друга, излучают зеленую флуоресценцию, представляющую собой разобранные фибриллы. Оба сигнала появляются в клетках, когда они находятся в процессе поглощения и деградации нанофибрилл пептида EF-C. Области, в которых обнаружена высокая и низкая эффективность FRET, выделены желтым цветом (рисунок 6A).

figure-results-2
Рисунок 6: Визуализация деградации нанофибрилл пептида EF-C с помощью корреляционной визуализации FRET и томографии STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Конфокальная микроскопия клетки, инкубированной нанофибриллами EF-C, которые были помечены парой FRET. Зеленые сигналы соответствуют предположительно разобранным фибриллам. Красный цвет соответствует предположительно неповрежденным фибриллам. Желтым цветом обозначены области, в которых обнаруживается смесь красного и зеленого сигналов. Nu nucleus. (B) Обзор STEM участка толщиной 800 нм из той же ячейки. (В) Указано положение томограммы. Изображение представляет собой композицию из двух изображений, полученных на разных участках, так как ячейка была частично перекрыта сеткой столбцов на одном из участков. Ядро помечено Nu в A, B и C. (В) Виртуальный срез из томограммы. Красными стрелками обозначены области, перекрывающиеся красными флуоресцентными сигналами. STEM-томография подтверждает наличие интактных фибрилл. Зеленая стрелка указывает на область с разобранными фибриллами. (D) Сегментация томограммы. Эндоцитозированный филоподиум – это отщемление мембраны везикулы (белая стрелка). Большой объем, который можно исследовать с помощью томограммы STEM (здесь приблизительно: 7 мкм x 7 мкм x 550 нм), облегчает наблюдение за таким редким событием. (E) Виртуальные разделы 19, 24 и 29 томограммы. При размере пикселя 6,8 нм каждая секция находится на расстоянии 27,2 нм друг от друга. Рисунок воспроизведен из данных, опубликованных Rauch-Wirth et al.24 . Масштабные линейки = 5 мкм (А), 1 мкм (С). Сокращения: STEM = сканирующая просвечивающая электронная микроскопия; FRET = резонансная передача энергии Фёрстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Визуализация была выполнена с помощью этого корреляционного подхода, чтобы подтвердить, что фибриллы EF-C поглощаются клеткой и впоследствии деградируют. Световая микроскопия позволяет нам выбирать клетки для электронной микроскопии, которые подают красный и зеленый сигналы, чтобы сравнить внешний вид ультраструктуры, коррелирующий с различными флуоресцентными сигналами. STEM-томограммы из одной и той же клетки показывают, что красный сигнал может исходить либо от фибрилл, которые все еще находятся вне клетки, либо, по-видимому, только что интернализованы макропиноцитозом (рис. 6C). Кроме того, CLEM подтвердила, что зеленый сигнал действительно исходит от деградировавших фибрилл (рис. 6B, C ), которые можно найти в лизосомах (рис. 6C, самый большой везикул). Благодаря большому объему, доступному для STEM-томографии и 3D-визуализации структур, легче соотнести сигнал световой микроскопии с ультраструктурными особенностями и интерпретировать их. Кроме того, с помощью этого подхода можно обнаружить редкие события, такие как отщемление филоподий внутри лизосомы (рисунок 6D, E, белая стрелка).

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM-томография обеспечивает разрешение, сравнимое с ПЭМ-томографией, в сочетании с возможностью исследования объемов толщиной до 1 мкм. Поэтому мы считаем его идеальным для визуализации вирус-индуцированных изменений внутриклеточных структур, таких как ремоделирование мембраны 4,6,25, почкование вирионов7 или эндоцитоз5. В зависимости от исследовательского вопроса могут быть рассмотрены другие методы VolumeEM. Для метода, который обеспечивает большее поле зрения при сопоставимом разрешении, мы рекомендуем томографию FIB-SEM. Томография FIB-SEM будет медленнее, чем томография STEM, при визуализации сопоставимого объема с аналогичным разрешением, поскольку время визуализации увеличивается при увеличении разрешения. Часто это можно измерить, визуализируя меньшие поля зрения. Кроме того, z-разрешение 6,8 нм (рис. 6) было бы технически сложным при фрезеровании ионным пучком. Таким образом, FIB-SEM оптимален для визуализации более крупных структур, таких как целые клетки и ткани 9,10,26,27, хотя обычно с (изотропными) размерами пикселей в несколько десятков нанометров. Кроме того, томограммы FIB-SEM не демонстрируют эффектов «отсутствующего клина», что характерно для томограмм, реконструированных из серии наклонов. Кроме того, с развитием плазменных станков FIB в настоящее время внедряются альтернативы, которые обеспечивают более быстрое и при этом точное фрезерование.

Если высокое разрешение в z не имеет решающего значения, ПЭМ или СЭМ визуализация последовательных срезов может быть альтернативой, позволяющей исследовать очень большое поле зрения за короткое время28,29, однако, обычно с анизотропным разрешением. В томографии ПЭМ могут быть объединены различные томограммы из серийных толстых срезов30,31. То же самое возможно и при STEM-томографии; Однако, учитывая толщину срезов, которые можно исследовать, потребность в объединении нескольких томограмм меньше. В вирусологии ПЭМ-томография часто используется для характеристики вирус-индуцированного ремоделирования мембран 32,33,34,35. В то время как ПЭМ-томография сама по себе дает ценную информацию о цикле репликации вирусов, в большинстве случаев использование выиграет от возможности STEM-томографии для получения изображений более толстых объемов. Это особенно верно для вирионов с анизотропной морфологией, таких как rhabdoviridae, где ПЭМ-томография может захватить только несколько полных вирионов на одной томограмме35, или для визуализации нескольких обволакивающих вирионов в репликационном компартменте с размером цитоплазматического вирусного сборочного комплекса (cVAC) цитомегаловируса человека (HCMV)4.

STEM-томография в криогенных условиях позволяет получить дополнительные функциональные данные19 , а также доступен видеопротокол20. Наш протокол отличается рабочим процессом пробоподготовки, который вместо сохранения образца в исходном состоянии обеспечивает околородную ультраструктурную консервацию. В то время как STEM-томография замороженных под высоким давлением сублимационных образцов не может достичь ультраструктурной сохранности и атомного разрешения, наблюдаемых в криогенных ЭМ, она выигрывает от преимуществ более простого оборудования, более стабильных образцов и более высокой производительности.

Следующие шаги имеют решающее значение для успеха метода:

Во-первых, четкая цель эксперимента по визуализации. Из-за трудоемкого характера метода необходим хорошо спланированный эксперимент с четкой целью визуализации. Детальное знание модельной системы — клеточной линии и вируса — должно быть получено заранее с использованием других, менее сложных в исполнении методов. Поэтому мы рекомендуем оптимизировать показатели инфекционности в предварительных экспериментах на основе световой микроскопии и корректировать условия эксперимента в соответствии с биологической системой. Параметры оптимизации включают количество клеток, множественность инфекций (MOI) и временные точки в зависимости от вируса и события, которое должно быть изображено. Это обеспечит высокую долю оцениваемых клеток в образце.

Во-вторых, качественная подготовка образцов. Мы подчеркиваем важность качественной подготовки образцов. В настоящее время мы считаем витрификацию замораживанием под высоким давлением золотым стандартом для толстых образцов, таких как клетки. Замораживание, встраивание и последующая визуализация при комнатной температуре является надежным способом получения высококачественных результатов в сочетании с STEM-томографией. Поэтому установление стабильного режима подготовки образцов имеет решающее значение. Для этого хотелось бы выделить литературу о замерзании высоким давлением 14,21. Если необходимо использовать менее токсичный раствор для замещения замерзания, мы рекомендуем использовать перманганат калия в качестве заменителя тетраоксида осмия, как описано в Schauflinger et al.36.

Наконец, отлаженный рабочий процесс для последовательного сканирования с наклоном, включая хорошо выровненный микроскоп, должен быть организован в соответствии с инструкциями пользователя STEM и будет отличаться от микроскопа к микроскопу. Налаживание бесперебойного рабочего процесса также зависит от генератора сканирования и программного обеспечения для получения изображений.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR и MD являются сотрудниками Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, фармацевтической компании, занимающейся разработкой и производством продуктов на основе вирусов. Это никак не повлияло на дизайн газеты; Таким образом, мы не сообщаем о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данная публикация является частью Глобальной стратегии развития технологий и была поддержана Глобальным управлением технологиями компании «Берингер Ингельхайм Девелопмент CMC Biologicals». Мы благодарим Ренату Кунц и Яну Аполлони за отличную техническую помощь и полезную дискуссию по подготовке образцов. Мы благодарим Райнхарда Вайха за отличную помощь в решении технических вопросов и в обслуживании устройства. Мы благодарим Торстена Фридриха за полезную беседу и помощь в настройке микроскопа. Работа Клариссы Рид, Джулии Ларош и Яна Мюнха была профинансирована грантом Центра совместных исследований Немецкого научно-исследовательского общества (SFB1279).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-гексадеценMerck KGaA8220640500
200 медных решёток с параллельными планкамиPlano GmbHG2014C
37 градусов; Сушильная камера CBinder GmbH9010-0323
АцетонVWR international GmbH20066330
DDSAНауки об электронной микроскопии13710
Алмазный ножDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Науки об электронной микроскопии13600
Смола Embed-812Науки об электронной микроскопии14900
Электромагнитные инструментыTVIPS GmbHПрограммное обеспечение TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Этанол 100%Merck KGaA1.00983.2511
Фильтрующая бумагаVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
ФормварНауки об электронной микроскопии15830-25
Блок заморозки Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 нмРеагенты и реагенты AURION Immuno Gold Аксессуары425.011
Золотая сосновая холма и ослэш; 2000 и год; mScience Services GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Нагревательная пластинаMEDAX GmbH и Рота KG12501
Система высокой вакуумной испарения BAF 300BAL-TEC AG
Морозильник высокого давления Wohlwend HPF Compact 01Инженерный офис M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Резервуар с жидким азотомH.Erben GmbH94500
Азот (жидкость)VWR international GmbH-
NMAНауки об электронной микроскопии19000
Тетроксид осмияChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Духовка 120 градусов; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Поли-L-Лизин 0,1% с aq. РешениеTed Pella, Inc.18026
Трубы с безопасным замком 0,5 млЭппендорф SE0030 121.023
Контейнеры для образцов (капсулы BEM)Plano GmbHG360-1
Диаметр сапфирового диска 3 x 0,16 ммИнженерный офис M. Wohlwend GmbH500
Ультрамикротом Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
УранилацетатРидель де А-Эймль; n AG31697
Камера с ультрафиолетовым светомДайниELG100S

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

STEM3D

Похожие статьи