Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Первичный пигментный эпителий сетчатки мыши, трансфицированный Alu RNA: патологически актуальная in vitro модель возрастной макулярной дегенерации

562 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе мы описываем полный процесс создания патологически релевантной модели возрастной макулярной дегенерации (ВМД) в первичных клетках пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) мыши с использованием трансфекции РНК Alu.

Аннотация

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), особенно неэкссудативная ВМД, требует экспериментальных моделей, которые лучше воспроизводят патологию человека. Современные модели in vivo остаются технически сложными и трудоемкими, в то время как обычные системы in vitro не могут повторить патологические триггеры, специфичные для заболевания. В данной работе мы представляем метод создания модели дегенерации пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) с использованием первичных мышиных клеток РПЭ, трансфицированных РНК Alu, ретротранспозоном, непосредственно участвующим в патологии географической атрофии.

В этом протоколе подробно описывается ферментативное выделение первичных мышиных клеток RPE с последующей трансфекцией Alu RNA для индуцирования дегенерации RPE. Валидация объединяет морфологический (гексагональная архитектура), функциональный (потеря полярности и нарушение ZO-1 белка мыши) и молекулярный анализ (количественная ПЦР). В результате наблюдались многофакторные изменения, вызванные трансфекцией Alu RNA: секреция воспалительных цитокинов (гены мышей Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) и клеточное старение (активация генов p21 и p53 у мышей; p < 0,05). По сравнению с традиционными моделями острого стресса, эта система воспроизводит хронические воспалительно-дегенеративные каскады ВМД с помощью стандартизированных методов, обеспечивая воспроизводимость. Сочетая аспекты упрощенных анализов in vitro и сложных моделей in vivo , этот подход может послужить предварительной платформой для изучения механизмов, управляемых ретротранспозонами, и скрининга потенциальных терапевтических кандидатов.

Введение

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является преобладающей причиной глобальных нарушений зрения. Тем не менее, эффективные методы лечения неэкссудативной ВМД остаются ограниченными. Таким образом, существует острая потребность в воспроизводимых и эффективных исследовательских моделях для раскрытия механизмов заболевания и определения терапевтических мишеней 1,2. Центральное место в этой работе занимает пигментный эпителий сетчатки (РПЭ), монослой, расположенный между мембраной Бруха (сосудистая оболочка) и фоторецепторами (сетчатка), который играет ключевую роль в поддержании гомеостаза сетчатки, поддерживая функцию фоторецепторов, регулируя гемато-ретинальный барьер и способствуя выведению отходов 3,4.

Дисфункция или потеря клеток РПЭ является характерной чертой многих дегенеративных заболеваний сетчатки, особенно при ВМД, где дисфункция РПЭ представляет собой раннюю и критическую стадию в ее прогрессировании 2,4,5. Примечательно, что у пациентов с географической атрофией (ГА), прогрессирующей фазой ВМД, снижение уровня фермента, процессирующего микроРНК Dicer 1 рибонуклеазы III (DICER1), приводит к токсическому накоплению РНК Alu, ретротранспозона, непосредственно связанного с дегенерацией РПЭ и участвующего в патологии человека6.

Традиционные модели in vivo, такие как модель йодата натрия (NaIO3) и модель амилоидного β (Aβ), сохраняют сложность системного заболевания, но сталкиваются с критическими ограничениями. Модель NaIO3 быстро индуцирует окислительный стресс сетчатки и повреждение РПЭ, однако ее острая токсичность разрушает как РПЭ, так и фоторецепторы, не имитируя прогрессирование ВМД, связанное с хронической патологией, и затрудняя терапевтическую оценку тонкой дисфункции РПЭ7. Аналогичным образом, модель Aβ вводит стрессоры, специфичные для конкретного заболевания, но требует обширных технических знаний и более длительных временных рамок по сравнению с подходами in vitro 8,9. С другой стороны, традиционные модели РПЭ in vitro, такие как модели воздействия H2O2 и гидрохинона, не имеют патологической значимости, поскольку в них не учтены специфические для заболевания стрессоры, такие как агрегаты токсичных белков иливоспалительные триггеры.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для создания модели дегенерации RPE в первичных клетках RPE мыши с использованием Alu RNA, некодирующей РНК, полученной из ретротранспозона, непосредственно участвующей в патогенезе GA6. РНК Alu активирует воспалительные пути и нарушает целостность барьера РПЭ10,11, тем самым имитируя патологические особенности, связанные с неэкссудативной ВМД. В этом методе используется ферментативное выделение и культивирование клеток RPE с последующей индукцией дегенерации RPE с помощью Alu RNA. Кроме того, мы предоставляем комплексную систему валидации, сочетающую морфологические (гексагональная архитектура), функциональные (целостность барьера и потеря полярности) и молекулярные (маркеры воспаления и старения) показания для оценки этой модели дегенерации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике животных Шанхайской больницы общего профиля при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяотун. Настоящий протокол строго соответствует Положению об управлении делами подопытных животных (издано Государственной комиссией по науке и технике) и Руководству по этичному использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения, установленным Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Более подробную информацию о материалах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Выделение первичных клеток RPE мыши

  1. Подготовка пластин с покрытием
    1. Разведите Матригель в соотношении 150 мкл Матригеля к 13 мл DMEM/F12 (конечная концентрация примерно 1,14%).
    2. Равномерно покройте дно планшета разбавленным Матригелем (примерно 150 мкл для 48-луночного планшета). Инкубировать в течение ночи при 37 °C до образования геля.
  2. Приготовление раствора
    1. Приготовьте полную питательную среду RPE с использованием модифицированной смеси питательных веществ F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином.
    2. Приготовьте смесь папаина, добавив 4,5 мл сбалансированного солевого раствора Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) во флакон с папаином (100 единиц/флакон).
    3. Приготовьте смесь DNase I, добавив 500 μL EBSS в флакон DNase I (1 000 единиц/флакон).
    4. Приготовьте раствор для разложения папаина, добавив 250 мкл DNase I Mix к 4,5 мл Papain Mix (отрегулируйте протокол, предоставленный поставщиком, для достижения конечной концентрации папаина 22 МЕ/мл), доведя конечный объем до 4,75 мл.
  3. Эвтаназия и забор тканей
    1. Усыпляйте мышей в возрасте 2-3 недель путем внутрибрюшинной инъекции 5% пентобарбитала натрия в дозе 150-200 мг/кг массы тела. Подтвердите глубокую анестезию и смерть путем подтверждения остановки сердцебиения и дыхания.
    2. Перед энуклеацией тщательно опрыскайте область глаза 70% этанолом для устранения поверхностных загрязнений 12,13,14. Аккуратно надавите на периорбитальный край, чтобы выпячивать шар. Затем используйте щипцы для извлечения глазного яблока, сохраняя зрительный нерв для более легкого рассечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты (например, щипцы, ножницы) автоклавируются, а процедуры выполняются под ламинарным колпаком для поддержания стерильности.
    3. Немедленно погрузите глазные яблоки в стерильную полную питательную среду РПЭ, предварительно подогретую до 37 °С.
  4. Ферментативное сбраживание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, включая ферментативное разложение и последующие процедуры, должны выполняться под ламинарным колпаком для поддержания стерильности.
    1. Перенесите глазное яблоко в чашку и с помощью щипцов удалите прилипшую соединительную ткань и остаточные экстраокулярные мышцы под стереомикроскопом.
    2. Осторожно промойте глаза 2 раза предварительно охлажденным фосфатным солевым раствором Дульбекко (D-PBS; без Ca2+/Mg2+; при 4 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточная питательная среда для полного РПЭ может нарушить ферментативную активность папаина.
    3. Полностью погрузите глаза в 1 мл раствора для разложения папаина и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 45 минут.
  5. Разделение ячеек СИЗД
    1. После разложения нейтрализовать ферментативную активность с помощью полной питательной среды РПЭ.
    2. Перенесите глазное яблоко в чашку и под стереомикроскопом иссеките роговицу, радужную оболочку и хрусталик, сохранив задний наглазник.
      Примечание: Клетки РПЭ были изолированы и поддерживались в виде неповрежденных листов (а не диссоциировались на отдельные клетки) в течение всего процесса.
    3. Отделите комплекс сетчатка-РПЭ от сосудистой оболочки, затем отклейте слой РПЭ от сетчатки в виде непрерывных листов в полной культуральной среде РПЭ. Равномерно соберите отделившиеся слои РПЭ в свежую питательную среду для СИЗД в виде смеси и затем культивируйте их на поверхностях, покрытых Матригелем.
  6. Культура клеток
    1. Засейте смесь в 24-луночный планшет с покрытием Matrigel (8-10 глазных яблок на покровное стекло для иммуноокрашивания), 48-луночный планшет с покрытием Matrigel (6-8 глазных яблок на лунку для количественной ПЦР) или 96-луночный планшет с покрытием Matrigel (5-6 глазных яблок на лунку).
    2. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2. Первую смену среды проводят через 48 ч с использованием полной питательной среды РПЭ. Меняйте среду каждые 48 часов после первой замены.
      Примечание: Чтобы максимально сохранить полярность клеток RPE, по возможности избегайте их пассирования, так как повторное субкультивирование может привести к потере дифференцировки и функциональной целостности.
  7. Мониторинг морфологии клеток
    1. Позволяют клеткам образовывать монослой с характерной гексагональной морфологией. Мониторинг морфологии под микроскопом инвертированной клеточной культуры.

2. Индукция модели вырождения РПЭ

  1. Синтез и верификация РНК алюминия
    1. Синтезируйте РНК Alu с помощью системы транскрипции in vitro .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез РНК Alu, использованный в нашем исследовании, был основан на протоколе, описанном в Ambati Lab6.
    2. Очистите РНК и подтвердите ее качество с помощью микроспектрофотометра.
  2. Трансфекция РНК алюминия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обозначили день первичного посева ячеек СИЗД как день 0. На 5-й день адгезивные первичные клетки RPE продемонстрировали однородную морфологию и достигли более чем 50% клеточного слияния, после чего трансфекцию Alu RNA проводили с использованием реагента для трансфекции на основе катионных липидов в соответствии с рекомендациями производителя.
    Для подтверждения результатов были включены две контрольные группы: i) отрицательный контроль (НК), в котором не добавлялась ни РНК Alu, ни реагент для трансфекции, а в качестве заменителя использовалась среда с низким содержанием сыворотки; ii) контроль липосом, при котором РНК Alu опускалась, но такое же количество реагента для трансфекции смешивали со средой с низким содержанием сыворотки и наносили на клетки для контроля эффектов, связанных с липофекцией. Ниже описана процедура трансфекции РНК Alu.
    1. Перед процедурой трансфекции замените существующую среду на 300 мкл полной питательной среды РПЭ на лунку (48-луночный планшет).
    2. Готовят трансфекционные комплексы с РНК Alu и реагентом на основе катионных липидов в среде с низким содержанием сыворотки.
      1. Готовь: Смесь 1 с 1,2 мкл реагента на основе катионных липидов и 18,8 мкл среды с низким содержанием сыворотки. Аккуратно перемешайте (не завивайте) и выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Приготовьте смесь 2 с 6 μL Alu RNA (100 μг/мл) и 14 μL среды с низким содержанием сыворотки.
      3. Приготовьте трансфекционные комплексы, добавив по каплям 20 μл Смеси 2 в 20 μл Смеси 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: РНК алюминия трансфицировали в конечной концентрации 0,6 мкг на лунку с использованием 1,2 мкл реагента на основе катионных липидов на лунку (соотношение 1,2 мкл реагента: 0,6 мкг РНК).
      4. Аккуратно перемешайте. Затем оставьте при комнатной температуре на 20 минут.
    3. Добавьте 40 мкл/лунку трансфекционных комплексов в каждую лунку 24-луночного планшета. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C / 5%CO2 на 48 часов.
    4. Проведите кПЦР, иммуноокрашивание и другие экспериментальные процедуры через 48 ч после трансфекции.

3. Валидация модели вырождения

ПРИМЕЧАНИЕ: Комплексные эксперименты по проверке модели были проведены на 7-й день.

  1. Иммунофлуоресцентное окрашивание для оценки полярности и целостности барьера
    1. Зафиксируйте культивируемые клетки РПЭ 4% формальдегидом, не содержащим метанола, в течение 20 мин при комнатной температуре. Стирайте 3 x 10 мин с 1x PBS.
    2. Блокируйте неспецифическое связывание с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 1 ч.
    3. Инкубировать с первичными антителами anti-ZO1 (разведение 1:1000 в 3% BSA) и фаллоидином 488 (1:1000 в разведении 3% BSA) в течение ночи при 4 °C, избегая света.
    4. Аккуратно промойте ячейки 3 x 10 мин PBS.
    5. Инкубировать со вторичными антителами (разведение 1:1000 в 3% БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    6. Промойте образцы 3 x 10 мин 1x PBS.
    7. Противопятить DAPI (разведение 1:1,000 в PBS) в течение 10 минут.
    8. Промойте образцы в течение 3 x 10 минут с помощью 1x PBS.
    9. Осторожно снимите покровное стекло с 24-луночного планшета и поместите его на предметное стекло, предварительно загруженное каплей монтажного материала. Захватывайте конфокальные изображения с помощью объектива 40x/0,95.
  2. Количественная ПЦР (кПЦР) для определения маркеров старения и воспаления
    Примечание: Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (мышиный ген Gapdh) была использована в качестве внутреннего референсного гена для нормализации значений порогового цикла (Ct). Все реакции количественной ПЦР (кПЦР) включали три биологические репликации на опытную группу. Последовательности праймеров приведены в Дополнительной таблице S1.
    1. Экстракция РНК
      1. Добавьте в культуральный планшет буфер для лизиса (Total RNA Kit) (1 мл на 10 см² поверхности поверхности) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Центрифуга при 13 400 × г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость в новую трубку, свободную от РНКазы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг, если образцы не содержат мусора (например, лизата прозрачных клеток).
      3. Добавьте 200 мкл хлороформа в надосадочную жидкость, сделайте вихрь в течение 15 с и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 минут.
      4. Центрифугируйте при 13 400 × г в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите верхнюю водную фазу (~500 μL) в новую пробирку.
      5. Добавьте 0,5 объема этанола в водную фазу. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
      6. Загрузите смесь на колонку с кварцевой мембраной (входит в комплект Total RNA Kit). Центрифуга при 13 400 × г в течение 30 с. Откажитесь от проточной части.
      7. Добавьте в колонку 500 мкл буфера для удаления белка (Total RNA Kit). Центрифуга при 13 400 × г в течение 30 с. Откажитесь от проточной части.
      8. Добавьте в колонку 500 μL промывочного буфера (Total RNA Kit). Центрифуга при 13 400 × г в течение 30 с. Откажитесь от проточной части.
      9. Повторите предыдущий шаг 3.2.
      10. Центрифугируйте пустую колонку при давлении 13 400 × г в течение 2 минут, чтобы мембрана высохла.
      11. Элюируйте РНК путем добавления в мембрану 30-100 мкл воды, не содержащей РНКазы. Выдерживать при комнатной температуре в течение 2 минут. Центрифугируйте при 13 400 × г в течение 2 мин.
    2. Синтез комплементарной ДНК (кДНК)
      1. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра на длинах волн 260 нм и 280 нм.
        Примечание: Считается, что соотношение A260/A280 между 1,8 и 2,0 связано с приемлемой чистотой РНК.
      2. Приготовьте реакционную смесь в пробирке, не содержащей РНКазы: РНК-матрица (500-1 000 нг): X μL (в зависимости от ее концентрации), 5x буфер для обратной транскрипции: 4 μL, вода без РНКазы: до 20 μL.
      3. Инкубируйте реакционную смесь в термоамплификаторе по следующей программе: 37 °C в течение 15 мин, 85 °C в течение 5 с и неограниченное удержание при 4 °C.
    3. количественной ПЦР
      1. Приготовьте мастер-смесь для количественной ПЦР для каждой реакции (всего 10 μл): TB Green (входит в состав Premix Taq): 5 μл, краситель ROX (входит в состав Premix Taq): 0,2 μл, Forward primer (1 μM): 0,2 μL, Reverse primer (1 μM): 0,2 μL, Вода без РНКазы: 3,4 μL, матрица кДНК: 1 μL.
      2. Добавьте по 10 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
      3. Запечатайте пластину клейкой оптической крышкой. Центрифугируйте при 300 × г в течение 1 мин.
      4. Запустите следующую программу на системе ПЦР в реальном времени: Этап 1: 95 °C в течение 30 с; Ступень 2: 40 циклов: 95 °C в течение 5 с, 60 °C в течение 30 с; Этап 3: Анализ кривой плавления.
      5. Рассчитайте относительные уровни экспрессии мРНК-мишеней с помощью метода 2−ΔΔCt 15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первичные клетки RPE мыши до трансфекции Alu RNA
На 0-й день (рис. 1) были выделены первичные мышиные клетки RPE, которые продемонстрировали характерную гексагональную морфологию, которая типична для здоровых клеток RPE. Эти клетки поддерживали хорошо организованный монослой. Клетки культивировали таким образом, чтобы обеспечить первоначальную структурную организацию и образование плотных соединений, о чем свидетельствует гексагональная форма и четко определенные границы....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша цель состояла в том, чтобы создать воспроизводимую и доступную модель травмы СИЗОД, которая позволяет получать изображения с высоким разрешением и проводить механистический анализ с минимальными ограничениями ресурсов. Этот подход обеспечил четкую визуализацию структурного разрушения, вызванного Alu RNA, по сравнению с контрольной группой, включая фрагментацию апикального плотного соединения и базальную цитоскелетную дезорганизацию с помощью конфокальной визуализации Z-стека (размер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Специальным проектом по исследованиям в области медицинских инноваций в рамках Плана действий в области науки и технологий (23Y11901300), Национальным фондом естественных наук Китая (82171076) и Шанхайской муниципальной комиссией по образованию (2023ZKZD18). Благодарим профессора Л.З. за любезный подарок в виде Alu RNA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шкаф биологической безопасности серии 1300 класса II, тип A2Термо Сайентиал
37 ° C/5% CO2 инкубаторТермо Сайентиал
4% параформальдегид (PFA)СервисбиоG1101-500МЛ
РНК Alu человекаПодаренный Л.З.
Вторичное антитело против кролика, Alexa Fluor 568 (козлятник)Инвитроген Термо СайентиалА11011
Примененный клейкий оптический чехол Biosystems MicroAmpThermo Fisher Scientific
Прикладные 96-луночные реакционные планшеты Biosystems MicroAmp OpticalThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems ViiA 7 Система для ПЦР в реальном времениThermo Fisher ScientificСистема ПЦР в реальном времени для количественного анализа экспрессии генов
Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (BSA, фракция V)БейотинСТ023-50г
Инвертированный микроскоп для клеточных культур Carl Zeiss PrimovertЦейссДля мониторинга морфологии клеток
Центрифуга 5424 RЭппендорф
ХлороформСигмаРазделение фаз при экстракции РНК.
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (LSM900+Cell Discover 7)ЦейссВизуализация иммунофлуоресцентных маркеров с высоким разрешением (например, ZO-1 и F-актина).
Планшет для лунок Costar 24/48/96Корнинг
покровный листThermo Fisher ScientificИспользуется на 24-луночном планшете для иммунофлуоресцентной визуализации.
DAPIТермо62248
Цифровая сухая ваннаМулаб
DMEM/F12ГИБКОСреды для выращивания клеток РПЭ 
Фосфатно-буферный буфер Дульбекко (D-PBS)Поделиться БиографиейСБ-CR017
Эрл s Сбалансированный солевой раствор (EBSS)ГИБКОСбалансированный солевой раствор используется для разведения папаина и ДНКазы I при выделении РПЭ.
Этанол (Абсолют)СигмаОсаждение РНК и промывка колонны.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)СигмаДля полных сред для культивирования клеток RPE
щипцыДля вскрытия
Липофектамин 3000 (реагент для трансфекции на основе катионных липидов)Термо ФишерL300015Для трансфекции РНК Alu в клетки RPE
МатригельКорнинг356234Матрица (разбавление 1,14%) для покрытия пластин для поддержки адгезии и поляризации РПЭ.
Формальдегид без метанолаТермо СайентиалАльтернативный фиксатор (4%) для сохранения эпитопов при иммунофлюоресценции
МикропипеткаЭппендорф
Спектрофотометр Nanodrop 2000Термо СайентиалИзмеряет концентрацию и чистоту РНК
Nikon ECLIPSE Ti-S Флуоресцентный инвертированный микроскопКомпания NikonФлуоресцентная визуализация окрашенных образцов
Стереомикроскоп Olympus SZX16ОлимпДля рассечения глазных яблок мышей и выделения РПЭ
Opti-MEMГИБКОСреда с низким содержанием сыворотки крови для приготовления трансфекционного комплекса
Система диссоциации папаинаУортингтонLK003150Для работы фермента
Пенициллин-стрептомицин ГИБКОДля полных сред для культивирования клеток RPE
Пентобарбитала натриевая сольСигмаСредство для эвтаназии
Фаллоидин 488 Абкам176753Для оценки полярности
Набор реагентов PrimeScript RTТакараРР037АНабор для обратной транскрипции для синтеза кДНК (подготовка матриц для количественной ПЦР)
RNAsimple Total RNA KitТЯНЬГЕНДП419Для извлечения РНК
ТБ Грин  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)ТакараРР420АДля количественной ПЦР
ZO-1 Кроличье поликлональное антителоПротеинтек21773Для морфологической оценки

Ссылки

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансфекция РНК Aluпервичные клетки РПЭ мышидегенерация РПЭферментативное выделениесекреция воспалительных цитокиновклеточное старениеколичественная ПЦРхроническое воспаление

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.