Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Многоуровневая микродиссекция и функционально-структурное профилирование ветвей почечных артерий человека

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен пошаговый протокол выделения и функциональной оценки почечных артериальных ветвей человека, облегчающий проведение доклинических исследований для фармацевтической разработки.

Аннотация

Почечно-сосудистая дисфункция играет решающую роль в патогенезе множественных клинических состояний, включая острое повреждение почек, ишемию почек и гипертензию, представляя значительные трудности в клиническом ведении и отрицательно влияя на исходы лечения пациентов. Выделение и функциональная характеристика внутрипочечных артерий имеют решающее значение для выяснения механизмов, лежащих в основе почечной сосудистой дисфункции, особенно связанной с повреждением почек, и для направления целенаправленной терапевтической разработки. Несмотря на клиническую значимость, стандартизированные подходы к выделению и функциональной оценке внутрипочечных артерий человека на разных уровнях ветвления остаются недостаточно разработанными. Этот протокол обеспечивает всестороннюю основу для систематической изоляции и мультимодальной оценки внутрипочечных артериальных ветвей, включая функциональные и структурные оценки как при физиологических, так и при патологических состояниях. Методология включает в себя три ключевых компонента: (1) точная анатомическая идентификация и микродиссекция внутрипочечных артерий из донорских почек, сопровождающаяся окрашиванием гематоксилин-эозином (H&E) для структурного подтверждения; (2) строгие процедуры нормализации в проволочной миографии для повышения воспроизводимости и надежности измерений; и (3) количественный анализ вазомоторных реакций с использованием методов прецизионной проволочной миографии. Нормализация основана на соотношении длины мышц и напряжения, при котором постепенное растяжение артериальных сегментов создает оптимальное напряжение в состоянии покоя для максимального перекрытия актина и миозина, тем самым вызывая пиковые сократительные реакции. При проволочной миографии изолированные сегменты сосудов подвешиваются между двумя параллельными проводами, что позволяет точно измерить сосудистое натяжение. Применяя строгие протоколы нормализации, этот метод позволяет воспроизводить и надежно количественно оценивать сосудистую реактивность при различных патофизиологических состояниях и фармакологических вмешательствах.

Введение

Почки являются жизненно важным органом, отвечающим за поддержание гомеостаза человека за счет выведения метаболических отходов, электролитного баланса и регуляции жидкости - функций, которые требуют исключительно высокого кровотока. В физиологических условиях почки получают примерно 25% от общего объема крови, перекачиваемой сердцем каждую минуту (сердечный выброс), что подчеркивает их существенную роль в системном кровотоке и критическую важность почечной перфузии для поддержания общего физиологическогобаланса. Почечная артериальная система точно регулирует эту массивную доставку крови для поддержания СКФ и адаптации к системным гемодинамическим изменениям. Следовательно, нарушение почечной перфузии представляет собой критический патологический механизм, способствующий снижению скорости клубочковой фильтрации (СКФ) при таких состояниях, как острое повреждение почек и ишемия почек. Кроме того, он часто возникает на фоне системных нарушений, которые нарушают почечный кровоток, включая шок, сердечную дисфункцию и сепсис 2,3,4,5. Почечная артерия подвергается последовательному разветвлению внутри почки, сначала разделяясь на междолевые артерии, которые проходят через почечные столбы между медуллярными пирамидами. Достигнув кортикомедуллярного соединения, эти сосуды дают начало дугообразным артериям, которые изгибаются вдоль границы между корой и мозговым веществом. Из этих криволинейных сосудов выходят междольковые артерии, которые проникают радиально в кортикальную паренхиму, в конечном итоге доставляя кровь к клубочковым капиллярам через афферентные артериолы для перфузирования отдельных нефронов 1,6,7. Междолевая, дугообразная и междольковая артерии составляют ключевую сосудистую сеть сопротивления в почке, выступая в качестве первичных регуляторов внутрипочечной гемодинамики и контроля давления 1,8. Точная изоляция и характеристика этих сосудов имеют решающее значение для выяснения фундаментальных механизмов, управляющих почечным перфузионным гомеостазом9. Кроме того, их гетерогенная сосудистая реактивность при различных патофизиологических условиях обеспечивает стратегическую основу для разработки новых сосудорасширяющих агентов с протекторным потенциалом почек10,11.

В настоящее время методы клинической визуализации (например, ультразвук) обычно используются для мониторинга изменений почечного кровотока; Тем не менее, экспериментальные методологии в фундаментальных исследованиях для непосредственной оценки почечного сосудистого напряжения, ключевого фактора, определяющего почечную перфузию, остаются ограниченными 12,13,14,15. Система проволочной миографии представляет собой хорошо зарекомендовавшую себя экспериментальную платформу, которая измеряет изменения напряжения в небольших биологических тканях in vitro, включая кровеносные сосуды, трахею 16,17,18, диаметрами от 50 мкм до 10 мм 16,19,20. Несмотря на то, что проволочная миография широко применяется в исследованиях на животных, межвидовые различия в структуре и функции сосудов ограничивают степень, в которой сосуды грызунов могут представлять физиологию сосудов человека. Таким образом, точная идентификация и изоляция внутрипочечных артерий человека на различных анатомических уровнях (междолевом, дугообразном и междольковом) имеют решающее значение для проведения всесторонних исследований in vitro их физиологических свойств, а также связанных с заболеванием функциональных изменений и механизмов патологического повреждения. В сочетании с фармакологическими вмешательствами с использованием различных вазоактивных соединений эта система позволяет проводить динамическую оценку и количественную регистрацию реакций вазоконстрикции/вазодилатации в изолированных артериальных кольцах, обеспечивая мощный инструмент для исследования сосудистой реактивности в контролируемых экспериментальных условиях 19,22,23.

В этом протоколе подробно описана комплексная методология точной анатомической локализации и микродиссекции ветвей интарной артерии человека (междолевой, дугообразной и междольковой артерий) с последующей функциональной характеристикой с использованием системы мониторинга сосудистого напряжения in vitro для оценки их дифференциальной реактивности к вазоактивным препаратам, тем самым устанавливая как структурные, так и функциональные различия между этими сосудистыми сегментами. Сочетая анатомическую локализацию с профилированием фармакологической реактивности и гистопатологическим анализом, мы создаем платформу ex vivo , которая позволяет всесторонне оценивать региони-специфичные сосудистые реакции на вазоактивные агенты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол и примеры, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены урологическим отделением Первой больницы Пекинского университета (одобрение No 2023yan500-002) и проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все участники предоставили письменное информированное согласие до начала участия.

1. Приготовление раствора

  1. Готовят раствор Кребса-Рингера (Кребса), содержащий 119,0 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl2, 1,0 мМ MgCl2, 25,0 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2PO4 и 11,0 мМ D-глюкозы при pH 7,4.
  2. Приготовьте раствор соли с высоким содержанием калия (60K+), содержащий 64,0 мМ NaCl, 60 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl2, 1,0 мМ MgCl2, 25,0 мМ NaHCO3, 1,2 мМ KH2PO4 и 11,0 мМ D-глюкозы при pH 7,4.

2. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните лекарства в соответствии с данными, указанными в Паспорте безопасности материала (MSDS) сразу после их получения.

  1. Приготовьте фенилэфрин (Phe, 10-1 М в запасе), растворив 167,21 мг фенилэфрина в 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Хранить стоковый раствор при температуре -80 °С, разбавить до 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 М в качестве рабочей концентрации в день применения.
  2. Приготовьте ацетилхолин (АЧ, 10-2 М в запасе), растворив 18,166 мг ацетилхолина в 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Хранить стоковый раствор при температуре -80 °С, разбавлять до 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 М в качестве рабочей концентрации в день применения.

3. Забор почечной ткани и выделение внутрипочечной артерии

  1. Набирайте взрослых пациентов с диагнозом почечно-клеточной карциномы, что гистологически подтверждено предоперационной пункционной биопсией или интраоперационным замороженным срезом.
    Пациенты, которым запланирована радикальная нефрэктомия, специально отбираются, потому что их хирургические образцы обеспечивают доступ к интактным внутрипочечным артериальным сегментам, расположенным дистальнее краев опухоли. Эти сегменты могут быть точно препарированы и изолированы, что позволяет детально изучить физиологию почечных сосудов человека без вмешательства со стороны злокачественных тканей. Гистологическое подтверждение обеспечивает точную идентификацию карциномы и четкое очерчивание границ опухоли, облегчая выбор нормальных, свободных от опухоли артериальных сегментов для экспериментальных исследований.
    1. Исключите пациентов со значительными сопутствующими заболеваниями (гипертония, сахарный диабет или другие системные заболевания), чтобы избежать смешанного влияния на сосудистую функцию, тем самым повышая надежность и актуальность физиологических оценок.
      Примечание: Образцы для этого эксперимента были собраны у пациентов, которым была назначена радикальная нефрэктомия в Первой больнице Пекинского университета.
  2. Во время радикальной нефрэктомии соберите свежеиссеченные образцы почек человека и немедленно погрузите их в ледяной раствор Кребса для сохранения жизнеспособности тканей. Для артериальной диссекции сохраняются только макроскопически нормально выглядящие области, расположенные дистальнее краев опухоли (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной изоляции внутрипочечной артерии соседние здоровые ткани должны быть собраны в виде кортикомедуллярного клина на всю толщину во время радикальной нефрэктомии, тем самым сохраняя полное артериальное дерево от кортикальной до медуллярной сосудистой сети.
    1. Немедленно храните иссеченную ткань в 200 мл холодного раствора Кребса. Поместите контейнер на лед и транспортируйте его в изолированной сумке-холодильнике в лабораторию в течение 2 часов после сбора. Убедитесь, что ткань остается полностью погруженной в воду на протяжении всей транспортировки, чтобы сохранить жизнеспособность и структурную целостность для последующей диссекции и функционального анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания жизнеспособности тканей и физиологической функции весь процесс выделения и последующего хранения в растворе Кребса при 4 °C должен быть завершен в течение 6 ч 24,25,26,27. Раствор следует регулярно заменять во время процедур для поддержания оксигенации и жизнеспособности тканей, способствуя при этом выведению компонентов крови из просвета сосудов.
  3. Визуально определите корональную плоскость, определив расположение ворот почки и выровняв разрез так, чтобы он проходил как через почечную лоханку, так и через латеральную выпуклую границу. С помощью стерильного скальпеля рассеките почку пополам вдоль корональной плоскости, чтобы получить две симметричные половинки. Этот подход позволяет обнажить внутреннюю архитектуру, включая почечные пирамиды и колонны, что способствует точной идентификации и последующей диссекции внутрипочечных артерий (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить разделение почечных артерий, сначала следует удалить часть почечной лоханки, почечные пирамиды и жир на поверхности поперечного сечения, чтобы обнажить больше кровеносных сосудов (Рисунок 1B). Будьте осторожны, чтобы не перерезать кровеносные сосуды.
  4. Под стереомикроскопом тщательно разделите междолевые, дугообразные и междольковые артерии с помощью ножниц и щипцов для микродиссекции в чашке для культуры с черным дном диаметром 10 см (рис. 1C).
    Примечание: В почках человека междольковая артерия проходит через почечные пирамиды, характеризующиеся самой толстой сосудистой стенкой среди трех артериальных ветвей 1,8, со средним диаметром около 1-2 мм. В кортикомедуллярном соединении междолевая артерия переходит в дугообразную артерию, образуя полукруговую дугу вдоль кортикомедуллярной границы, со средним диаметром около 500 мкм. Кровеносные сосуды далее разветвляются в почечную кору, которая является междольковой артерией, с самой тонкой сосудистой стенкой и наименьшим диаметром среди трех, около 200 мкм (рис. 1C). Кроме того, при дифференцировке трех сосудистых ветвей анатомическая локализация дает более важную информацию, чем измерения абсолютного диаметра сосуда 1,8.
    1. Аккуратно удалите все окружающие ткани и жир с артерий, тщательно очистив их в 10-сантиметровой чашке для культуры с черным дном (рис. 1B).
  5. Используйте изолированные почечные артерии (междольчатую, дугообразную и междолевую артерии) для проведения следующих экспериментов:
    1. Подготавливают артериальные сегменты к гистологической обработке путем тщательной обрезки изолированных тканей до стандартизированной длины примерно 3 мм, которая подходит для закладки парафина и гистологического среза. Зафиксируйте каждый образец в 2 мл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 1 ч для сохранения морфологии ткани. После фиксации проводят обработку со стандартными протоколами обезвоживания, очистки и заделки парафина для последующего окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) в соответствии с установленными гистологическими протоколами (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для потенциальной гистологической оценки образцы могут быть подвергнуты трихромному окрашиванию Массона для оценки отложения коллагена или окрашиванию по методу Верхуффа-Ван Гисона (EVG) для визуализации эластичных волокон, в соответствии с установленными гистологическими протоколами28,29.
    2. Для исследования функции сосудов храните внутрипочечные кольца в ледяном растворе Кребса до тестирования. Артериальные кольца должны быть полностью погружены в воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих молекулярных анализов, таких как вестерн-блоттинг/кПЦР, свежие образцы сразу же замораживают в жидком азоте после вскрытия, а затем хранят при температуре -80 °C в соответствии с ранее опубликованными процедурами для сохранения целостности РНК и предотвращения деградации белка30,31.

4. Монтаж артериального кольца

  1. Определите междолевую, дугообразную и междольковую артерии по их четкому анатомическому положению (Рисунок 1C) и диапазону диаметров (Рисунок 2), затем осторожно разделите их на кольца длиной примерно 2 мм с помощью ножниц для микродиссекции для исследования функции сосудов (Рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно храните каждое изолированное артериальное кольцо отдельно в 5 мл ледяного раствора Кребса до функционального тестирования. Для функционального тестирования выбирают неразветвленные сосудистые кольца длиной 1,5-2,0 мм с чистыми перпендикулярными надрезами. Исключите кольца более 2,0 мм, чтобы избежать трудностей с монтажом, или кольца менее 1,5 мм, чтобы избежать нестабильной записи натяжения.
  2. Подготовьте все артериальные кольца (из междолевой, дугообразной и междольковой артерий отдельно), как указано в шаге 4.1, и доведите растворы Кребса и 60K+ до комнатной температуры. Затем включите подключенный компьютер, а затем систему проводного миографа, убедившись, что все компоненты правильно инициализированы, прежде чем приступать к экспериментам.
  3. Перед установкой артериальных колец в камеры проволочного миографа дважды промойте каждую камеру 5 мл раствора Кребса для обеспечения чистоты и удаления остатков веществ, затем добавьте 5 мл раствора Кребса в каждую камеру.
    1. Нагрейте раствор до 37 °C с помощью встроенной в миограф системы контроля температуры. Одновременно непрерывно аэрируйте раствор газом (смесью 95%O2 и 5%CO2) через подключенную газовую линию для поддержания соответствующего баланса оксигенации и pH во время эксперимента.
  4. Подготовьте два направляющих провода длиной 3 см диаметром 40 мкм для каждого артериального кольца и осторожно перенесите изолированные артериальные кольца в другую 10-сантиметровую чашку для культуры с черным дном, содержащую раствор Кребса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для кровеносных сосудов разного диаметра следует подбирать разные диаметры направляющих проводов. Для артериального кольца диаметром около 100 мкм и менее требуется направляющий провод длиной 15 мкм; Если диаметр составляет от 100 мкм до 200 мкм, используется направляющий провод длиной 25 мкм; Если диаметр превышает 200 мкм, можно использовать направляющий провод длиной 40 мкм. Для согласованности эксперимента рекомендуется использовать один и тот же диаметр для всех сосудов одного типа в рамках одного эксперимента. 19.
  5. Осторожно вставьте первую направляющую проволоку в артериальное кольцо внутри чашки, согните одну сторону направляющей проволоки на 90°, а затем перенесите ее в камеру для фиксации на держателе образца зажимного типа с помощью специальных винтов, предусмотренных прибором, для затяжки винтов по часовой стрелке (рис. 3В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющий провод вставлен для обеспечения структурной поддержки во время переноса артериального кольца при его установке на держатель образца, сводя к минимуму повреждения или искажения, вызванные обращением.
  6. Перед фиксацией артериального кольца на держателе запишите длину и ширину сосуда. Поместите артериальное кольцо между двумя держателями (рис. 3C) и считайте показания микрометровой шкалы, где 1 шкала соответствует 10 мкм. Вычтите значение шкалы, измеренное, когда держатели едва соприкасаются друг с другом (рисунок 3D), чтобы определить длину и ширину артериального кольца.
  7. Проденьте еще одну направляющую проволоку через кровеносный сосуд и окончательно зафиксируйте ее с другой стороны. Намотайте направляющую проволоку по часовой стрелке вокруг крепежных винтов с обеих сторон и убедитесь, что она плотно прикреплена к поверхности держателя образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего процесса фиксации необходимо избегать вытягивания кровеносного сосуда или царапин внутренней стенки кровеносного сосуда с помощью направляющей проволоки, чтобы не повредить эндотелий сосудов. Направляющая проволока должна быть обернута вокруг крепежного винта в один слой без наложения внахлест. Два направляющих провода должны находиться в одной горизонтальной плоскости, параллельно друг другу, и не пересекаться друг с другом. Кроме того, после фиксации направляющего провода отрегулируйте держатель образца с обеих сторон ближе; однако они должны находиться близко друг к другу, не соприкасаясь, чтобы избежать силы, как показано на рисунках 3E и 3F.
  8. Установите камеру обратно в проволочную систему миографа. Затем накройте крышкой и проветрите газ. Подключите датчик и откройте программное обеспечение для сбора данных для измерения сосудистого натяжения.

5. Нормализация для конкретного сосуда для оптимального определения начального напряжения

ПРИМЕЧАНИЕ: Установление стабильных исходных условий, определяемых как оптимальное напряжение покоя для максимальной сократительной реакции, имеет решающее значение для воспроизводимых функциональных измерений. Тем не менее, из-за врожденных межиндивидуальных физиологических различий, кровеносные сосуды человека демонстрируют большую вариабельность исходных механических свойств по сравнению с кровеносными сосудами животных 32,33,34,35,36. Эти факторы в сочетании с внутренней неоднородностью сосудов (например, структурными и функциональными различиями в диаметре, толщине стенки и сократительных свойствах) в совокупности приводят к значительным изменениям исходного напряжения. Поэтому для обеспечения экспериментальной воспроизводимости рекомендуется нормализовать каждый кровеносный сосуд в отдельности. Система проволочного миографа включает в себя специальный модуль нормализации, который позволяет точно определять базовое напряжение для каждого сосуда.

  1. Установите артериальные кольца в камеру, как описано в шагах с 4.1 по 4.8. Начните запись диаграммы, обнулите канал (рис. 4A), обеспечьте стабилизацию в течение не менее 30 минут, затем снова обнулите канал, прежде чем продолжить нормализацию.
  2. Выберите «Настройки нормализации» в меню DMT (Рисунок 4B) и настройте параметры следующим образом (Рисунок 4C):
    1. Калибровка окуляра (мм/дел): 1; Целевое давление (кПа): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Время онлайн усреднения (секунды): 3; Время задержки (секунды): 60.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IC1 обозначает внутреннюю окружность сосуда при максимальном активном усилии, в то время как IC100 представляет собой окружность, соответствующую трансмуральному давлению 100 мм рт.ст. Почечные артерии человека демонстрируют значительную межвидовую вариабельность, требующую стандартизации, в отличие от животных моделей, которые имеют стабильные сосудистые свойства для экспериментального определения и повторного использования соотношений IC1/IC100. Из-за значительных различий в диаметре сосуда, толщине стенок и механических свойствах у отдельных образцов человека, каждый сосуд должен пройти независимую нормализацию для установления его уникальных исходных характеристик. Таким образом, коэффициент 0,9 был установлен в качестве заполнителя для инициализации протокола здесь и не использовался на практике в этом протоколе.
  3. Выберите канал, соответствующий целевой артерии, и откройте экран нормализации из меню DMT (рисунок 4C), заполните его соответствующими данными:
    1. Конечные точки тканей: a1 должно быть равно 0, a2 должно быть длиной сосуда (в мм); диаметр проволоки: 40 μм (введите диаметр используемой проволоки); показания микрометра: значение со шкалы микрометра, нажмите Добавить точку , чтобы записать точку.
  4. Когда все будет готово, нажмите кнопку Добавить точку , чтобы записать первую точку и начать процедуру нормализации.
  5. Примените пассивное растяжение, подождите 3 минуты, введите показания микрометра в качестве следующей точки, затем добавьте 5 мл 60K+ , чтобы вызвать опосредованное калием сужение сосудов (Рисунок 5).
  6. Подождите, пока схватка не достигнет плато. Затем промойте раствор 60K+ с 5 мл раствора Кребса 3 раза и рассчитайте данные об активной силе по следу, вычитая пассивную силу на каждом растяжении из силы, активированной калием (Рисунок 5).
  7. Повторяйте шаги с 5.5 по 5.6 (шаги «Stretch-60K+ Stimulation-Wash») до тех пор, пока активная сила не достигнет своего максимума, затем определите оптимальное базовое натяжение, при котором производство активной силы сосуда является максимальным (Рисунок 5).
  8. Уравновесьте артериальное кольцо в камере в течение 10 минут, прежде чем переходить к следующим этапам эксперимента.

6. Определение реактивности кольца почечной артерии

  1. Перед началом эксперимента убедитесь, что объем Кребса в каждой камере составляет 5 мл.
  2. Для оценки концентрационно-зависимого сокращения, вызванного фенилэфрином, применяйте кумулятивный фенилоналан с шагом в поллогарифма (от 10-9 до 10-4 М)37.
  3. Начните с самой низкой концентрации фенилаланина (10-9 М). Добавьте 5 μL запаса Phe (10-6 M) в камеру, содержащую 5 мл буфера Krebs, непрерывно контролируйте и дождитесь стабилизации сжатия (2-3 минуты неизменного напряжения), отметьте точку, затем добавьте следующую концентрацию с шагом в поллогарифма. Повторяйте до достижения конечной концентрации (10-4 М), поддерживая постоянный контроль на всем протяжении (Рисунок 6).
  4. Для дополнительного тестирования на наркотики промойте камеру теплыми 5 мл раствора Кребса не менее 5 раз, пока напряжение не вернется к исходному уровню и не останется стабильным в течение не менее 10 минут.
  5. Для оценки вазодилатации, зависящей от концентрации ацетилхолина, применяют кумулятивный АЧ с шагом в поллогарифма (от 10-8 до 10-5,5 М).
    Примечание: При нормальной сосудистой сети реакция на ацетилхолин (АЧ) служит функциональным индикатором целостности эндотелия37,38. Сосудорасширяющий ответ на АЧ отражает функцию эндотелия через NO-опосредованную релаксацию в здоровых сосудах. Однако при патологических состояниях этот ответ может быть ослаблен или отменен из-за нарушения биодоступности оксида азота (NO) и/или измененных рецепторных сигнальных путей.
  6. Предварительно законтрактуйте сосуды с 10-4 М Phe, добавьте 5 μL запаса Phe (10-1 M) в камеру, содержащую 5 мл буфера Кребса, и инкубируйте в течение 15 минут. Начиная с самой низкой концентрации АЧ, добавьте 5 мкл запаса Ach (10-5 М) в камеру, содержащую 5 мл буфера Кребса, непрерывно контролируйте и дождитесь реакции вазодилатации (подтвержденной устойчивым обнаружением следов), отметьте точку, затем перейдите к следующей концентрации. Повторяйте до тех пор, пока все не будут проверены (рисунок 7).
  7. Завершите эксперимент, сохранив файл и удалив артериальные кольца. Тщательно очистите камеру путем инкубации с 10 мл 8% раствора уксусной кислоты в течение 3 мин, затем промойте 10 мл воды 3 раза. Далее инкубировать в 10 мл 95% этанола в течение 3 минут и снова промыть 10 мл воды 3 раза. Наконец, выключите нагреватель и газ, убедившись, что вся жидкость удалена, прежде чем перекрыть газ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В почке человека междолевая артерия проходит между почечными пирамидами вдоль соответствующей вены. Характеризуясь относительно толстой сосудистой стенкой и значительным охватом жировой ткани, эта артерия требует особенно тщательного вскрытия. Окружающая жировая ткань должна быть тщательно удалена, чтобы избежать приложения чрезмерной силы во время процедуры изоляции (Рисунок 1C).

Дугообразная артерия анатомически расположена в кортикомедуллярном переходе, образуя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стабильность почечной перфузии служит как важнейшей терапевтической мишенью, так и окном в гемодинамическую патофизиологию39,40. Мы представляем протокол иерархической изоляции и функциональной оценки почечных артерий человека из свежих образцов нефрэктомии, устраняя значительные пробелы в современных методологиях. В отличие от существующих подходов, ограниченных трупными образцами или животными моделями, наш метод позволяет наде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить добровольцев за их участие в этом исследовании, а также поблагодарить хирургический персонал урологического отделения Первой больницы Пекинского университета за предоставление почечной ткани. Работа выполнена при поддержке Пекинского муниципального фонда естественных наук (F251013 Y. Z., 7232096 Y. L.); Национальный научный фонд Китая (82325004, 92168114 до Y. Z., 82170422 до Y. L.); Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 к Y. Z., 2021YFF0501404 к Y. L., 2023YFC2415500 к L. Y.); Исследовательский проект Третьей больницы Пекинского университета в Государственной ключевой лаборатории сосудистого гомеостаза и ремоделирования (Пекинский университет; 2024-VHR-SY-07 to Y.Z.); 2023 г. Пекинская муниципальная комиссия по здравоохранению Столичная медицинская наука и технологии Инновации Трансформация Программа отличного продвижения Проект (YC202301QX0162 до Лос-Анджелеса); Финансирование клинических исследований Национальной больницы высокого уровня (проект Фонда инкубации трансформации научных и технологических достижений Первой больницы Пекинского университета, 2024CX24 до L. Y.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетилхолина хлоридSigma-Aldrich, Merck, Дармштадт, ГерманияА6625
Блюдо для культуры с черным дномDanish Myo Technology, Орхус, Дания300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA501330
D-глюкозаSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA610219
Щипцы DumontDanish Myo Technology, Орхус, Дания300413
Ножницы для рассечения ГейдераDanish Myo Technology, Орхус, Дания400431
Направляющая проволокаDanish Myo Technology, Орхус, Дания400447Диаметр 40 & микро; m
KClSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100781
LabChart Professional версия 8.3 ADInstruments, Австралия-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100288
Мультимиографическая система Danish Myo Technology, Орхус, Дания620 МИН.
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, КитайA100865
ФенилэфринSigma-Aldrich, Merck, Дармштадт, ГерманияП6126

Ссылки

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод микродиссекциипроволочная миографиясосудистая дисфункцияизоляция внутрипочечной артериивазомоторные реакциизависимость между длиной и напряжением мышцыокрашивание гематоксилином и эозиномсокращение при воздействии фенилэфринанормализация артерии
Многоуровневая микродиссекция и функционально-структурное профилирование ветвей почечных артерий человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.