Разработка и применение ингибирующего пептида для быстрого подавления in vitro уровней посттрансляционных модификаций в определенном месте

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, в котором изложены спецификации конструкции, стандарты контроля качества и система функциональной верификации TAT-PIP, пептида, ингибирующего посттрансляционную модификацию.

Аннотация

Белки являются основными исполнителями жизнедеятельности и регулируются на уровне транскрипции, трансляционной и посттрансляционной модификации (ПТМ). Кроме того, ПТМ представляет собой более сложный механизм регуляции активности белка, поскольку белок обычно имеет различные типы ПТМ и несколько сайтов для конкретного ПТМ. Трансфекция плазмид или лентивирус и аденовирус могут быть использованы для первоначального скрининга функционально важного сайта ПТМ среди всех идентифицированных сайтов; Тем не менее, эти методы всегда сталкиваются с такими проблемами, как низкая эффективность проникновения в клетки и ткани, трудоемкость и высокие затраты, потенциальная иммунная реакция и т. д. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали и успешно использовали тип рекомбинированного пептида под названием TAT-PIP, TAT-конъюгированный ингибирующий пептид PTM. TAT-PIP состоит из модуля TAT, который облегчает проникновение в клетки и ткани, и модуля PIP, который специфически подавляет PTM в целевых участках за счет конкурентного связывания. Здесь мы представляем протокол, в котором изложены спецификации проекта, стандарты контроля качества и система функциональной верификации TAT-PIP. В разделе «Проектирование» мы описываем согласованность, необязательную длину, специфичность и сохранность TAT-PIP. Далее мы вводим требования к качеству тестирования TAT-PIP, которые гарантируют его эффективность и безопасность. При применении части TAT-PIP мы представили тест на градиент концентрации TAT-PIP, процесс инкубации исследуемых клеток и последующее фенотипическое обнаружение. Подводя итог, мы описываем эффективный метод скрининга сайтов ПТМ путем выборочного сбивания конкретного участка и наблюдения за полученным фенотипом для определения его функции. Благодаря низкой стоимости синтетики и высокой эффективности, этот метод преодолевает ограничения существующих технологий, таких как трансфекция плазмид.

Введение

Белки являются основными исполнителями жизнедеятельности, и их биологические регуляторные процессы включают два основных аспекта регуляции экспрессии генов — транскрипцию генов и трансляцию мРНК. Тем не менее, в течение последних десятилетий посттрансляционная модификация (ПТМ) стала еще одним незаменимым механизмом для регуляции клеточных^{функций.} Фосфорилирование, наиболее известный исследователям метод ПТМ, играет особенно важную роль в физиологических функциях. Например, после того, как внеклеточная сигнал-регулируемая киназа (ERK) фосфорилируется MEK-киназой в сайтах Thr202 и Tyr204, ее конформация изменяется, обнажая активный центр, который активирует нижестоящие белки-мишени, такие как факторы транскрипции². Напротив, когда N-концевой Ser9 GSK-3β фосфорилируется киназой Akt/PKB, его карман, связывающий субстрат, блокируется, что приводит к потере активности киназы³. Убиквитинация является еще одним важным методом ПТМ, который регулирует различные клеточные процессы посредством ковалентного присоединения молекул убиквитина к белкам субстрата. Убиквитин содержит 7 остатков лизина (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) и N-концевой метионин (M1). Связывание убиквитиновых цепей в разных местах придает белкам субстрата различную судьбу. Основной функцией убиквитинирования, связанного с K48, является маркировка белков субстрата для деградации протеасомой⁴. И наоборот, основной функцией убиквитинирования, связанного с K63, является участие в недеградирующей передаче сигнала, такой как восстановление повреждений ДНК, воспалительные реакции и эндоцитоз⁵. В последние годы, с быстрым развитием технологий протеомики, было открыто все большее количество новых ПТМ. Помимо классического ацетилирования, были идентифицированы новые ацилирования, такие как пропионилирование, кротонилирование и глутарилирование⁶. В области модификаций гистонов лактозилирование гистонов нарушает модификацию РНК m⁶A и гомеостаз иммунного микроокружения⁷. В области негистоновых модификаций снижение кротонилирования ATP5O является основным вредным фактором в подавлении метаболизма фосфолипидов⁸.

Проведение исследований в области ПТМ требует систематического продвижения анализа протеома⁹ ПТМ. Это направление охватывает два основных направления исследований: анализ профилей ПТМ на уровне всего протеома и комплексная идентификация сайтов ПТМ конкретного белка. Несмотря на то, что современная масс-спектрометрия позволяет эффективно идентифицировать различные типы ПТМ и конкретные участки, скрининг и валидация ключевых функциональных участков остается основной научной задачей, ограничивающей прогресс исследований. Разработка эффективных стратегий скрининга объектов является первым шагом на пути к решению вопроса о функционировании ключевых объектов регулирования. Традиционные методы включают в себя конструирование мутантных плазмид для определенных участков (инактивация мутаций, активация мутаций), введение их в клетки-мишени с помощью методов трансфекции in vitro и систематическую оценку изменений фенотипических показателей, таких как пролиферация клеток, апоптоз и окислительный стресс. Тем не менее, эта стратегия сталкивается со значительными техническими препятствиями в моделях транскрипционно молчащих клеток, таких как ооциты и системы первичных тканевых культур. Несмотря на то, что лентивирусная или аденовирусная система трансдукции может частично решить проблему эффективности трансфекции, ее применение сталкивается с двумя проблемами: высокими экономическими затратами и низкой эффективностью проникновения вирусных частиц в моделях тканей in vitro . В то время как стратегия создания мутантных мышей-нокаутов чрезвычайно долговечна и дорогостояща. В целом, необходимо срочно разработать экономичные и эффективные стратегии для первоначального скрининга функционально важных участков PTM.

В последние годы наша команда успешно разработала и применила метод быстрой подавления ПТМ под названием TAT-PIP, TAT-конъюгированный ингибирующий ПТМ, основанный на конкурентном ингибировании полипептида. Его основным преимуществом является универсальность и высокая эффективность для проведения предварительного скрининга функционально важных сайтов ПТМ, что обеспечивает важнейшую основу для углубленного анализа молекулярных механизмов ключевых сайтов ПТМ. В этом исследовании систематически выясняются основные принципы и процесс реализации TAT-PIP, а также демонстрируется его эффективность в регулировании уровня ПТМ на конкретном участке с помощью репрезентативных экспериментальных данных.

Протокол

1. Проектирование последовательности TAT-PIP

ПРИМЕЧАНИЕ: TAT-PIP состоит из двух частей пептидов (Рисунок 1): N-концевая часть - это TAT, CYGRKKRRQRRR, которая остается неизменной для каждого TAT-PIP и может помочь эффективно проникать в культивируемые in vitro клетки или ткани in vivo ; С-концевая часть представляет собой полипептидную последовательность вокруг специфического сайта ПТМ (рисунок 1, обычно лизин в символе «К», выделен красным цветом) белка-объекта. Длина PIP составляет около 10-15 остатков АА (если дольше – стоимость увеличивается; если короче – специфичность значительно снижается).

1. Оптимизируйте последовательность PIP с помощью взрывного анализа (Рисунок 2).
   1. Авторизуйтесь в https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, нажмите на blastp для поиска белковых последовательностей.
   2. Скопируйте целевую последовательность белка в окно ввода последовательности запроса .
   3. При выборе поиска выберите опцию Стандартные базы данных . Выберите опцию blastp (protein-protein BLAST) в выборе программы. Наконец, нажмите кнопку BLAST (рисунок 2B).
   4. Выберите пептидные сегменты с высокой специфичностью в качестве кандидатов в ПИП.
2. Проведите сравнение гомологий между людьми и мышами для получения итоговой PIP.
   1. Авторизуйтесь в https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, нажмите на blastp для поиска белковых последовательностей.
   2. Скопируйте последовательности белка у человека и мыши и вставьте их в поле входной последовательности.
   3. Нажмите кнопку «Отправить», чтобы получить результаты.
   4. Выберите PIP со 100% гомологией между человеком и мышью (рис. 2C).
3. Определите состав TAT-PIP, который состоит из N-концевого TAT и C-концевого PIP.

2. Синтез и проверка качества TAT-PIP

1. Выберите компанию с большим опытом работы в проектах, чтобы обеспечить чистоту пептидов не менее 98% с помощью масс-спектрометрии, избегая примесей, которые могут повлиять на последующие эксперименты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень эндотоксина полипептида должен быть ≤10, и он должен быть свободен от патогенов.

3. Применение TAT-PIP

1. Используйте сверхчистую воду, не содержащую патогенных микроорганизмов, для растворения TAT-PIP для достижения исходной концентрации 10 мг/мл. Разложите бульон по маленьким пробиркам, чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания, которые приведут к частичной денатурации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 1% диметилсульфоксида (ДМСО) поможет защитить структуру TAT-PIP.
2. Обрабатывайте клетки с помощью TAT-PIP.
   1. Культивирование эмбриональных клеток почки человека 293T в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle's Medium с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5% CO₂).
      Примечание: После посева клетки культивировали в течение примерно 12 ч, а обработку TAT-PIP проводили, когда слияние достигало примерно 70%.
   2. Растворенный ТАТ разбавляют до 1 мг/мл с помощью PBS, затем непосредственно добавляют в среду для культивирования клеток в соответствующей дозировке (рекомендуемая конечная концентрация питательной среды: 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл) в течение 24 ч.
   3. Промойте клетки исходной питательной средой 3 раза.
   4. Проведите вестерн-блоттинг, чтобы проверить степень подавления ПТМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на опыте и последующих экспериментальных результатах, оптимальная конечная концентрация TAT-PIP составляет 0,1 мг/мл.

4. Вестерн-блот

1. Подготовьте образцы клеточного белка.
   1. Промойте клетки фосфатно-соевым буфером (PBS) 3 раза, добавьте в клеточную гранулу 200 μл сильного буфера для лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA) (с добавлением ингибитора фенилметилсульфонилфторида [PMSF]-протеазы) и инкубируйте в течение 5 минут для предварительного лизиса, соскребите их скребком для клеток.
   2. Смесь облучают ультразвуком с помощью ультразвуковой дробилки при энергоемкости 12% в течение 5 с.
   3. Охладите лизат клеток на льду в течение 30 минут и центрифугируйте при 13400 г при 4 °C в течение 10 минут.
   4. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую белки, в предварительно охлажденную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте в надосадочную жидкость 1/4 объема 5-кратного буфера для проб (конечная концентрация 1х).
   5. Перемешайте смесь в вихре, нагрейте ее при температуре 95 °C в течение 5 минут в сухом термостате и охладите на льду в течение 2 минут.
   6. Измерьте общую концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда на нанодропе.
2. Проводят электрофорез в виде додецилсульфата натрия и полиакриламида геля (SDS-PAGE).
   1. Используйте 12% разрешающий гель и 4% стекирующий гель для SDS-PAGE.
   2. Пипеткой введите образцы белка в лунки в соответствии с указанным объемом.
   3. Включите аппарат для электрофореза и сначала запустите его при напряжении 80 В, 300 мА в течение 30 минут, чтобы выровнять полосы на границе между стекируемым и разрешающим гелями. Затем запустите при напряжении 120 В, 300 мА в течение 45 минут, чтобы растворить белки.
   4. Перенесите белки из геля на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью аппарата для быстрого переноса.
3. Выполняйте блокирование, инкубацию антител и визуализацию.
   1. Заблокируйте мембрану PVDF в 5% обезжиренном молоке в Трис-буферном физрастворе, содержащем 0,1% Tween 20 (TBST) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
   2. Инкубируйте мембрану с первичным антителом, разведенным в соотношении 1:1000 в 5% обезжиренном молоке/ПБСТ, в течение ночи при 4 °C на ротаторе.
   3. Промойте мембрану три раза TBST (по 10 мин).
   4. Инкубировать мембрану с вторичным антителом, разведенным в соотношении 1:1000 в 5% обезжиренном молоке/TBST в режиме лучевой терапии в течение 1 ч.
   5. Промойте мембрану три раза TBST (по 10 мин).
   6. Экспонируйте мембрану во временных рядах (5 с, 10 с, 20 с, 30 с, 60 с, 120 с) для получения оптимального изображения с помощью электрогенерирующего хемилюминесцентного устройства (ЭКЛ).

5. Функциональная валидация TAT-PIP в культивируемых клетках in vitro

1. Определение уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках.
   1. Пластина 293T клеток с оптимальной плотностью 1 x 10⁵ клеток/лунка в 24-луночном культуральном планшете.
   2. Обрабатывайте клетки TAT-конъюгированным Histon3 lysine 116 ингибирующим пептидом кротонилирования (THCIP) (0,1 мг/мл) в течение 24 ч, затем промойте клетки PBS.
   3. Инкубируйте клетки с 10 мкМ дихлор-дигидро-флуоресцеина диацетатом (DCFH-DA) в бессывороточном DMEM при 37 °C в темноте в течение 20 минут.
   4. Захватывайте изображения с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа и измеряйте интенсивность флуоресценции с помощью функции «Измерить » в ImageJ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался комплект фильтров FITC с фильтром излучения 465-495 нм, дихроичным зеркалом 505А и вторым фильтром излучения 512-550 нм.
2. Анализ пролиферации клеток
   1. Засейте клетки 293T с оптимальной плотностью 1 x 10^{по 5} клеток на лунку в 24-луночный культуральный планшет.
   2. Добавьте по 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку.
   3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 2 ч.
   4. Запишите поглощение на длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера и вычтите фоновый сигнал из глухих лунок (среда + CCK-8).
   5. Нормализуйте данные для расчета жизнеспособности клеток.
3. Определение уровня АТФ в клетках
   1. Лизируйте клетки с помощью буфера для лизиса. Центрифугируйте лизат при 12 000 × г в течение 5 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость для последующего анализа.
   2. Разбавьте стандартный раствор АТФ буфером для лизиса до получения градиента концентраций 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкм, 3 мкм, 4 мкМ и 5 мкМ.
   3. Добавьте 20 мкл раствора для обнаружения АТФ в каждую лунку, содержащую либо надосадочную жидкость, либо стандарт АТФ.
   4. Немедленно измерьте люминесцентный сигнал с помощью считывателя микропланшетов.
      1. Нажмите кнопку Компоновка пластины, выберите соответствующий шаблон пластины в поле Изменить шаблон пластины, чтобы настроить образцы (стандарты и сэмплы).
      2. Затем нажмите « Протокол » слева, нажмите кнопку « Хемилюминесценция », затем нажмите «Начать », чтобы начать обнаружение.
   5. Сгенерируйте стандартную кривую на основе люминесцентных сигналов стандартов АТФ и используйте ее для количественной оценки концентрации АТФ в надосадочной жидкости клетки.

Результаты

В этом исследовании описывается стратегия, которая использует TAT-PIP для подавления уровня PTM целевого белка в определенном месте на основе конкурентного ингибирования. В типичном примере TAT-PIP здесь переименован именно в THCIP. Он состоит из двух функциональных модулей: (1) N-концевого пептида ТАТ, проникающего в клетки (CYGRKKRRQRRR), который позволяет THCIP проникать в клетки; (2) С-концевая последовательность вокруг K116 H3, AIHAKRVTIMPKD, которая специфически конкурирует с эндогенным H3, подлежащим кротонилирова...

Обсуждение

В этом протоколе решающее значение имеют следующие шаги. Во-первых, дизайн TAT-PIP учитывает специфичность пептида. Во-вторых, оптимизируйте нанесение и концентрацию; Оптимизированная концентрация должна быть тщательно протестирована для достижения эффективного и быстрого сбивающего кода. В-третьих, для проверки эффекта TAT-PIP рекомендуется проводить несколько экспериментов, а не полагаться на один эксперимент для подтверждения его дополнительных эффектов.

Ср...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматическая многофункциональная система визуализации	Tanon	4600	Экспонометр идентифицирует и визуализирует целевые полосы белка путем обнаружения сигналов флуоресценции или хемилюминесценции на мембране после проявочной обработки.
Набор для подсчета клеток-8	GLPBIO	GK10001	Основываясь на корреляции между метаболической жизнеспособностью клеток и количеством клеток, этот метод оценивает пролиферативную способность клеток путем измерения восстановительной способности клеток к реагентам CCK-8
Dulbecco' s Модифицированный Eagle'		11995065Модифицированная	среда Игла Дульбекко (DMEM) является широко используемой базальной средой для поддержки роста широкого спектра клеток млекопитающих.
Хемилюминесцентный субстрат ECL	Biosharp	BL520B	ECL генерирует световые сигналы посредством хемилюминесцентных реакций, которые позволяют обнаруживать специфические белки или нуклеиновые кислоты.
Аппарат для электрофореза	Tanon	EPS600	Основная роль аппарата для электрофореза заключается в разделении и анализе биологических макромолекул ‌
Набор для расширенного анализа АТФ	Beyotime	S0027	Набор может эффективно определять уровень АТФ в образцах
Фетальный бычий бычий крем (FBS)	Gibco	16000-044	Фетальная бычья сыворотка (FBS) обеспечивает необходимые питательные вещества и факторы роста для поддержания и роста клеток.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Прибор обладает высокой эффективностью и способен быстро осуществлять перенос белка от полиакриламидного геля к мембране PVDF в течение 15 минут
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus Corporation	IX73	Флуоресцентная микроскопия использует ультрафиолетовый свет в качестве источника света для облучения исследуемого объекта, чтобы заставить его излучать флуоресценцию, а затем наблюдать за формой и расположением объекта под микроскоп.
NanoDrop2000 микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр	Thermo Scientific	2000	NanoDrop использовался для определения концентрации ДНК или РНК
PVDF мембраны	BioRAD	1620177	Этот тип PVDF мембраны обладает отличной химической стойкостью и высокой способностью связывания белков
Набор для анализа АФК	Beyotime	S0033S	Набор может точно определить уровень активных форм кислорода в клетках
TAT-конъюгатор H3K16 Ингибиторный пептид кротонилирования	Nanjing Taopu Biotechnology Co. Ltd	CN218107533U	Он может специфически конкурировать с эндогенным H3, подлежащим кротонилированию в K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST может очищать посторонние вещества на мембране, уменьшать экспериментальные ошибки и обеспечивать точность экспериментальных результатов ‌
Ультразвуковая дробилка	LICHEN	LC-AUD-150P	Основными функциями аппарата являются фрагментация клеток, диспергирование частиц и эмульгирование
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Считыватели микропланшетов позволяют достичь высокопроизводительного количественного анализа биологических образцов путем обнаружения оптических сигналов (таких как абсорбция, флуоресценция или люминесценция) образцов в микропланшетах