Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Функция почечной артерии и гистопатология, связанные с метаболитами плазмы и кала у пациентов с сердечной недостаточностью

546 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68583

⸱

9 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол разработки мультимодальной платформы для выяснения сердечной почечно-сосудистой дисфункции, вызванной метаболитами сердца, при кардиоренальном синдроме.

Аннотация

Микробиота кишечника и связанные с ней кометаболиты микроба-хозяина все чаще признаются в качестве ключевых регуляторов системного метаболического баланса и кардиоренальной оси, особенно в контексте кардиоренального синдрома. Хотя клинические данные указывают на то, что сердечная дисфункция может инициировать или усугублять патологические изменения почек, ключевые метаболические сигнальные молекулы, опосредующие кардиоренальную ось, и лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Это исследование создает новую систематическую исследовательскую платформу, объединяющую кардиометаболические сигнатуры с анализом функции почечных сосудов, включающую: (1) выделение и экстракцию метаболитов плазмы/кала у пациентов с сердечной недостаточностью; (2) Выделение почечных сосудов ex vivo и методы первичного культивирования; (3) Мультимодальная система оценки кардиоренальных метаболических взаимодействий, включающая сосудистые функциональные анализы, молекулярные биохимические тесты на маркеры повреждения почечных сосудов и гистопатологические анализы. По сравнению со здоровой контрольной группой, метаболиты от пациентов с сердечной недостаточностью нарушали функцию почечных сосудов и индуцировали воспалительные реакции, что подчеркивает их потенциал в качестве функциональных биомаркеров при кардиоренальном синдроме. Это исследование не фокусируется на конкретном метаболите; таким образом, в будущих исследованиях потребуется дальнейшая идентификация и валидация конкретных типов метаболитов, оказывающих патогенное воздействие, с использованием аналитических методов, таких как ЖХ-МС/МС и ЯМР. Применение этой платформы показало, что метаболиты, связанные с сердечными заболеваниями, нарушают функцию почечных сосудов и гомеостаз. Эти результаты дают механистическое представление о метаболических факторах кардиоренальных взаимодействий и предлагают трансляционный инструмент для идентификации новых биомаркеров и терапевтических мишеней.

Введение

Кардиоренальный синдром (СРК) – это сложное патологическое состояние, характеризующееся двунаправленным поражением между сердцем и почками. Сложная взаимозависимость между этими двумя органами была впервые описана Робертом Брайтом в 1836 году, который систематически документировал значительные структурные изменения в сердце, связанные с прогрессирующимзаболеванием почек. Распространенность СВК тесно связана с сосуществованием сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и хронической болезни почек (ХБП). Исследования показывают, что примерно 30% пациентов с сердечной недостаточностью также имеют ХБП, в то время как 44%-51% смертей у пациентов с ХБП напрямую связаны с сердечно-сосудистымизаболеваниями.

Управление CRS сопряжено с рядом существенных проблем. Во-первых, клиническая помощь остается фрагментарной, с отсутствием междисциплинарной координации и механизмов раннего предупреждения, что часто приводит к задержке вмешательств во времяфазы 3 декомпенсации. Во-вторых, современные стратегии лечения сталкиваются с парадоксальной дилеммой. Традиционные методы лечения, такие как диуретики и ингибиторы ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), могут облегчить симптомы сердечной недостаточности4; однако их длительное применение или применение в высоких дозах может активировать РААС и симпатическую нервную систему (СНС), усугубляя почечную гипоксию и фиброз, что в конечном итоге способствует развитию диуретической резистентности и ухудшению функции почек5. Аналогичным образом, в то время как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ИАПФ) и блокаторы рецепторов ангиотензина (БРА) могут смягчать повреждение кардиоренала, их клиническое применение часто ограничено из-за опасений по поводу повышенного уровня креатинина в сыворотке крови или гиперкалиемии, при этом только 30%-40% пациентов могут переносить длительную терапию6.

Учитывая эти проблемы, существует острая необходимость в выявлении эффективных ранних биомаркеров и достижении более глубокого понимания патогенеза СВК для содействия открытию новых терапевтических мишеней. Тем не менее, существующие ограничения в выявлении действенных медиаторов кардиоренальных перекрестных помех, особенно специфических для заболевания метаболитов, которые напрямую связывают сердечную дисфункцию с повреждением почечных сосудов, препятствуют прогрессу в решении этих неудовлетворенных клинических потребностей. Новые данные свидетельствуют о том, что метаболиты, связанные с сердечными заболеваниями, могут служить как диагностическими биомаркерами, так и механистическими факторами СВК путем перепрограммирования почечного сосудистого гомеостаза, однако их пространственно-временная роль в инициировании или усилении повреждения почек остается плохо охарактеризованной 7,8,9. Недавние исследования показали, что эндогенные метаболиты, такие как церамиды, могут активно усугублять сосудистое воспаление и ремоделирование, особенно при кардиоренальных условиях, что подчеркивает более широкое значение чувствительности к метаболитам при сосудистой патологии.

Среди почечных компартментов, пораженных при СВЦ, сосудистая сеть все чаще признается первичной и ранней мишенью повреждения. Эндотелиальная дисфункция в почечной микроциркуляции, характеризующаяся нарушением биодоступности оксида азота, окислительным стрессом и повышенной экспрессией провоспалительных и протромботических медиаторов, способствует разрежению микрососудов, повышению проницаемости сосудов ирегионарной гипоксии. В то же время, сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC), которые необходимы для регуляции артериального тонуса и податливости, также уязвимы к метаболической дисрегуляции при СВЦ. Накопленные данные указывают на то, что связанные с заболеванием метаболиты могут нарушать сократительную способность VSMC, способствовать неадаптивному ремоделированию, а также способствовать увеличению жесткости сосудов и нарушению почечной перфузии. Несмотря на их фундаментальную роль, механизмы сосудистой дисфункции, управляемые гладкими мышцами, остаются недостаточно изученными в современных моделях СВК 8,12. Эти патофизиологические изменения не только усугубляют повреждение почек, но и способствуют дезадаптивной нейрогормональной активации и системным гемодинамическим нарушениям, еще больше ухудшая сердечную функцию и увековечивая прогрессирование СВЦ13. Таким образом, нацеливание на повреждение почечных сосудов открывает механистически информативное окно в ранний патогенез СВК и обеспечивает рациональный фокус для исследования метаболических взаимодействий между сердцем и почками.

Чтобы восполнить эти пробелы, наше исследование уделяет приоритетное внимание систематической идентификации и функциональной валидации метаболитов, связанных с сердечной недостаточностью, в качестве центральных регуляторов прогрессирования СВЦ. Эта работа устраняет критический разрыв между открытием наблюдательных биомаркеров и исследованиями механистического патогенеза, описывая, как эти метаболиты индуцируют почечную сосудистую дисфункцию, активируют воспалительные каскады и ставят под угрозу механизмы восстановления тканей. Традиционные модели, используемые для изучения CRS, включая животные модели, клеточные культуры in vitro и органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), имеют ограничения. Животные модели страдают от межвидовых различий, которые ограничивают клиническую значимость. Культурам in vitro не хватает интеграции на уровне органов, в то время как органоиды, полученные из ИПСК, хотя и способны моделировать взаимодействия кардиомиоцитов и канальцевых эпителиальных клеток, остаются функционально незрелыми и ограниченыранними стадиями развития. Кроме того, современные сосудистые органоидные системы в основном состоят из эндотелиальных монослоев или примитивных микрососудов, в которых отсутствует сократительный слой гладкой мускулатуры и функциональные показания, необходимые для оценки реакции сосудов на метаболическое повреждение.

В отличие от этого, наша платформа использует сердечные метаболиты человеческого происхождения и почечную сосудистую сеть человека ex vivo , что позволяет создавать физиологически значимые и структурно неповрежденные почечные артерии человека ex vivo , обеспечивая физиологически значимый и механистически информативный анализ метаболических взаимодействий кардиоренальных клеток на границе сосудистых сосудов. Это дает уникальное преимущество в моделировании межорганной метаболической коммуникации, лежащей в основе прогрессирования кардиоренального синдрома. Наша новаторская интегрированная платформа кардиоренальных исследований сочетает в себе три основные инновации: метаболомное профилирование метаболитов плазмы/кала, полученных из сердечной недостаточности, реноваскулярные изоляционные/культивальные системы ex vivo и мультимодальная функционально-молекулярно-гистопатологическая оценка. Каждый компонент этой платформы был оптимизирован для воспроизводимости и трансляционной релевантности, включая использование 200 мкл плазмы или 0,1 г фекального материала на образец, инкубацию сегментов почечной артерии человека диаметром 2 мм при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч и обнаружение маркеров повреждения сосудов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR). Эта система не только расшифровывает диагностический потенциал сигнатур метаболитов, но и напрямую связывает их причинный вклад с патологией СВЦ, позволяя идентифицировать терапевтические мишени посредством картирования на молекулярном уровне межорганной метаболической дисрегуляции. Соединяя механистические открытия с клиническим переводом, эта двунаправленная парадигма смещает управление СВК от реактивного контроля симптомов к упреждающим вмешательствам, основанным на биомаркерах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные протоколы и методологии клинических случаев, использованные в этом исследовании, были этически одобрены урологическим отделением Первой больницы Пекинского университета (Кодекс этической экспертизы: 2023yan500-002) и больницей Пекинского объединенного медицинского колледжа (одобрение No I-23PJ585) в строгом соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Для этого исследования мы набрали пациентов мужского или женского пола, госпитализированных в больницу Пекинского объединенного медицинского колледжа (PUMCH) с июля 2019 года, у которых по крайней мере двум опытным кардиологам была диагностирована сердечная недостаточность (СН). В исследование были включены четыре пациента с СН (HF1-HF4) для экстракции метаболитов из плазмы и кала. Письменное информированное согласие было получено от всех испытуемых до их включения в исследование. Экспериментальная аппаратура и реактивы приведены в таблице материалов.

1. Обработка плазменных и фекальных образцов – экстракция полярных метаболитов

  1. Забор образцов
    1. Соберите все образцы плазмы и кала в стерильные, предварительно охлаждаемые пробирки для сбора и немедленно заморозьте их в жидком азоте после сбора. Храните образцы при температуре -80 °C до обработки.
    2. Чтобы обеспечить стабильность метаболитов, обрабатывайте все образцы в течение одного цикла замораживания-размораживания и не допускайте, чтобы временной интервал между сбором и экстракцией образцов не превышал 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти меры были приняты для минимизации деградации метаболитов и обеспечения воспроизводимости в последующих метаболомных анализах.
    3. Извлеките метаболиты из образцов кала и плазмы, следуя шагам протокола 1.3 или 1.4 соответственно.
  2. Исследуемая популяция
    1. Проведите исходные измерения артериального давления и запишите историю приема лекарств всеми участниками.
    2. Соберите образцы пациентов до любого острого клинического ухудшения, исключая лиц с основными метаболическими сопутствующими заболеваниями (например, диабетом, первичной гипертензией), чтобы свести к минимуму искажающие факторы при метаболомном анализе (Дополнительная таблица S1).
    3. Получение клинической информации по каждому субъекту с использованием стандартных процедур.
  3. Плазменная экстракция
    1. Центрифугируйте сырую сыворотку при 14 000 × г в течение 10 минут (4-8 °C). Соберите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    2. Добавьте охлажденный (-80 °C) метанол класса ВЭЖХ для достижения концентрации метанола 80% (v/v). Аккуратно перемешайте инверсией и выдерживайте при температуре -80 °C в течение 6-8 часов.
    3. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 10 минут (4-8 °C). Перенесите метанольную надосадочную жидкость в свежие пробирки для метаболомного профилирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите образцы плазмы после сбора в морозильную камеру при температуре -80 °C в течение 2 часов и сведите к минимуму циклы замораживания-размораживания для обеспечения стабильности метаболитов.
  4. Экстракция кала
    1. Добавьте 500 мкл метанола класса ВЭЖХ (предварительно охлажденного до -80 °C) в свежие или замороженные образцы кала в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Гомогенизацию с помощью микропестика/тканевого гомогенизатора на сухом льду в течение 1-2 мин, затем вортексирование (1 мин при 4-8 °C) и инкубацию при -80 °C в течение 4 ч.
    2. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 10 мин (4-8 °C) с помощью охлаждаемой центрифуги. Перенести надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; хранить при температуре -80 °C до шага 1.4.4.
    3. Суспендируйте гранулу 400 μл предварительно охлажденного (-80 °C) метанола класса ВЭЖХ. Тщательно перемешайте (1 мин при 4-8 °C) и инкубируйте при -80 °C в течение 30 мин.
    4. Повторное центрифугирование (14 000 × г, 10 мин, 4-8 °C). Соедините надосадочную жидкость из обеих фаз экстракции.
    5. Проведите окончательное центрифугирование с осветлением (14 000 × г, 10 мин, 4-8 °C). Перенесите очищенную надосадочную жидкость в стерильные пробирки объемом 1,5 мл для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите образцы кала после сбора в морозильную камеру при температуре -80 °C в течение 2 часов и сведите к минимуму циклы замораживания-размораживания для обеспечения стабильности метаболитов.

2. Изоляция почечной артерии

  1. Отбор участников и забор тканей
    1. Скрининг пациентов, перенесших радикальную нефрэктомию на предмет почечно-клеточной карциномы. Включайте только лиц в возрасте ≥ 18 лет без метаболических сопутствующих заболеваний (например, первичной гипертензии, сахарного диабета). Во время операции соберите гистологически нормальную почечную паренхиму, расположенную на расстоянии не менее 3 см от краев опухоли.
    2. Собранные образцы немедленно погрузить в оксигенированный буфер Кребса-Хенселеита (4 °C, pH 7,4; состав в мМ: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 25,0 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 глюкозы). Завершите процедуры изоляции в течение 6 часов после операции.
  2. Подготовка почечной ткани
    1. Корональный срез в буфере Кребса при 4 °C для получения геминефрических образцов, содержащих неповрежденные прикорневые структуры. Выполните микродиссекцию с использованием стереомикроскопической системы (40-кратное увеличение) для обнажения ветвей дугообразных артерий почек и идентификации дугообразных артерий.
  3. Микрососудистая диссекция
    1. Добейтесь точной изоляции артериальных сегментов путем последовательного удаления периваскулярной адвентициальной ткани с помощью микророговичных ножниц.
    2. Сохранить артериальные сегменты диаметром примерно 500 мкм.
    3. Сведите к минимуму напряжение сдвига эндотелия благодаря манипуляциям с микрощипцами без натяжения. Проводите диссекцию в условиях гипотермии (4 °C) с буфером Кребса, обновляемым каждые 15 минут, для сохранения физиологического pH и ионного гомеостаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная количественная оценка артериальных размеров и буферного состава, термически регулируемый рабочий процесс от заготовки (4 °C) до обработки (4 °C) и полная микрососудистая диссекция в течение 6 часов после забора образца обеспечивают оптимальную жизнеспособность тканей и функциональную целостность.

3. Инкубация почечной артерии с метаболитами повреждения сердца

  1. Подготовка сосудистой ткани: Рассеките почечные артерии микрохирургическим путем в стерильных условиях и тщательно удалите прилегающую периваскулярную соединительную ткань с помощью тонких офтальмологических щипцов. Разделите изолированные почечные артерии на сегменты по 2 мм с помощью стерильных микроножниц для последующего органотипического посева.
  2. Обеззараживание антибиотиками: Промывайте сосудистые сегменты в течение 3 x 5 минут фосфатно-соевым буфером (PBS) с добавлением тройного антибиотического/антимикотического коктейля для минимизации микробного загрязнения и обеспечения стерильности перед воздействием метаболитов.
  3. Экспериментальная группировка: Случайным образом распределите сосудистые сегменты по четырем экспериментальным когортам и перенесите на 24-луночные культуральные планшеты, содержащие 500 мкл модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium на лунку.
  4. Метаболитное вмешательство
    1. Добавьте метаболиты из следующих групп: 1) Здоровые контрольные метаболиты, полученные из плазмы крови (HC-P); 2) Метаболиты плазмы крови пациентов с сердечной недостаточностью (HF-P); 3) Здоровые контрольные метаболиты, полученные из кала (HC-F); 4) Фекальные метаболиты (СН-Ф) пациентов с сердечной недостаточностью.
    2. Восстановите метаболитные экстракты в метаноле (класса ВЭЖХ) и введите 10 мкл каждого экстракта в соответствующую лунку 24-луночного планшета, который содержит 500 мкл модифицированной орлиной среды Dulbecco и сегменты почечной артерии (конечная концентрация растворителя 2% (v/v)). Добавьте эквивалентные объемы транспортного средства (смесь метанол/PBS) в контрольные скважины.
  5. Условия культивирования: Инкубировать пластинчатые сборки в стандартных условиях клеточного культивирования (37 °C, 5%CO2, 95% влажности) в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе.

4. Кольцевой анализ почечной артерии

  1. Подвеска и фиксация почечного кольца
    1. Подготовка проволоки: Проведите две параллельные проволоки из нержавеющей стали диаметром 2 см (предварительно уравновешенные по методу Кребса, 95% O2/5% CO2) через просвет артерии под оптической микроскопией, обеспечивая одинаковое выступание проволоки с обоих концов.
    2. Крепление миографа: включите систему отопления и газ для поддержания физиологической температуры и насыщения кислородом. Закрепите провода горизонтально в ванне с проволочным миографом с регулируемой температурой (Krebs, 95% O2/5% CO2). Отрегулируйте винтовые ручки для поддержания естественного расслабления судна.
  2. Определение оптимального начального напряжения с нормализацией для конкретного сосуда
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение покоя было скорректировано с использованием процедуры нормализации для стандартизации исходных условий, оптимизации реакции судна и обеспечения воспроизводимости. Уравновесьте в течение 30 минут, прежде чем приступить к нормализации.
    1. Выберите Настройки нормализации в меню DMT , используя следующие параметры: калибровка окуляра: 1 мм/дел; давление цели: 13,3 кПа; Передаточное отношение IC1/IC100: 0,9 С; онлайн усреднение: 3 с; Время задержки: 60 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная справочная информация и подробная информация о конфигурации системы приведены в упомянутом документе17.
    2. Чтобы нормализовать сосуд, выберите интересующий вас канал и заполните экран нормализации данными. Установите конечные точки тканей на основе показаний микрометра и диаметра проволоки 40 мкм.
    3. Примените пассивную растяжку и подождите 3 минуты. Введите 60K+ , чтобы вызвать опосредованное калием сокращение, и подождите, пока сокращение не достигнет плато. Промойте препарат 3 x 5 минут раствором Кребса, чтобы вымыть 60K+. Рассчитайте активную силу, вычитая пассивную силу на каждом уровне растяжения из силы, вызванной калием, записанной на трассе.
    4. Повторяйте шаг 4.2.3 до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное активное усилие. Определите оптимальное напряжение покоя как уровень, обеспечивающий максимальное активное напряжение в каждой артерии, с пиковыми реакциями на высокий K+ , используемыми в качестве референсных сокращений.
    5. Уравновесьте артериальное кольцо в течение 10 минут перед дальнейшими экспериментами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за значительной межиндивидуальной вариабельности сортов, толщины и происхождения сосудов нормализуйте каждый кровеносный сосуд индивидуально, чтобы обеспечить воспроизводимость. Используйте модуль нормализации системы проволочного миографа для определения соответствующего базового напряжения на основе пассивного диаметра и механических свойств каждого сосуда. Применяйте процедуру последовательно ко всем образцам перед функциональным тестированием.
  3. Определение реактивности кольцев почечной артерии
    1. Для изучения влияния различных метаболитов на сократительную способность сосудов проводят тесты функции сокращения сосудов с использованием почечных артерий, инкубированных с экстрагированными метаболитами плазмы и кала здоровых добровольцев и пациентов с СН в течение 12 ч. Для получения более подробной информации обратитесь к разделу 3.
    2. Используйте 60K+ , чтобы вызвать опосредованное калием сокращение. Убедитесь, что в каждой камере имеется 5 мл раствора Кребса.
    3. Чтобы определить индуцированные фенилэфрином (Phe) и зависящие от концентрации сокращения в кольцах артерий, добавляйте фенилахилланур с шагом в поллогарифма от 10-9 до 10-4 М. Начните с самой низкой концентрации фенилахилана, введите его в камеру и дождитесь устойчивого сокращения.
    4. Отметьте точку, в которой достигается устойчивое сокращение (т.е. запишите значение напряжения на плато), затем перейдите к следующей концентрации. Повторяйте до тех пор, пока не будет успешно добавлено окончательное концентрирование.
    5. После завершения эксперимента сохраните файл с данными и удалите кольца артерий. Хорошо очистите камеру 8% раствором уксусной кислоты, затем выдержите в течение 3 минут.
    6. Выключите систему отопления и газ, убедившись, что вся жидкость была удалена, прежде чем выключать газ.

5. Гистопатологическое исследование почечной артерии: окрашивание гематоксилин-эозином

ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте опасные реагенты и биологические отходы в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности и химической гигиены. В частности, ксилол и параформальдегид должны собираться в маркированные, закрывающиеся контейнеры для химических отходов и храниться в специально отведенном для этого вытяжном шкафу перед утилизацией сертифицированными специалистами по обращению с опасными отходами. Уксусная кислота, используемая для очистки камеры миографа, должна быть нейтрализована и утилизирована в соответствии со стандартными процедурами утилизации кислотных отходов. Не сбрасывайте эти реактивы в лабораторные раковины.

  1. Промойте артерии в холодном PBS и зафиксируйте в 4% параформальдегиде (pH 7,4) на ночь. Разрез серийных срезов с точностью до 4 мкм и процесс для гистологии.
  2. Срезы тканей, смонтированные на предметных стеклах, инкубировать в сушилке при температуре 60 °С в течение 1 ч, затем немедленно перевести на ксилол. Погрузите срезы в ксилол (3 х 5 мин).
  3. Подвергните срезы дифференцированной гидратации этанола: 100% этанол (2 x 5 мин), 95% этанол (1 x 5 мин), 90% этанол (1 x 5 мин), 80% этанол (1 x 5 мин), смойте сверхчистой водой (1 x 5 мин).
  4. Окрашивать гематоксилином (0,5% по массе) в течение 5 мин; Затем промойте под проточной водой.
  5. Дифференцировать с 1% кислотным спиртом (HCl-этанолом) в течение 5-10 с и промыть под проточной водой.
  6. Пропитайте срезы в 0,6% аммиачной воде и промойте под проточной водой.
  7. Погрузите срезы в раствор эозина (1% мас./об.) на 2 мин.
  8. Обезвожьте и очистите срезы от содержания 95% этанола (2 x 5 мин), 100% этанола (2 x 5 мин) и ксилола (2 x 5 мин).
  9. Кратковременно высушите на воздухе до достижения оптической прозрачности, установите монтажную среду, накройте покровными крышками и загерметизируйте защитные крышки нейтральной средой для крепления.
  10. Выполняйте визуализацию в светлом поле и гистоморфометрическую оценку.

6. Обнаружение молекулярных биомаркеров, ассоциированных с повреждением почек

  1. Экстракция мРНК почечной артерии
    1. Добавьте криоконсервированную сосудистую ткань в жидком азоте к 1 мл реагента для экстракции РНК и переложите в предварительно охлажденный гомогенизатор тканей для тщательной гомогенизации.
    2. Добавьте 250 мкл хлороформа на 100 мкл экстракционного реагента, энергично перемешайте в течение 30 с и инкубируйте в течение 10 мин при 25 °C.
    3. Центрифугируйте при 12 000 × г (10 мин, 4 °C) и перенесите водную фазу в свежую пробирку.
    4. Добавьте 500 мкл изопропанола в водную фазу, перемешайте путем инверсии и инкубируйте в течение 20 мин при 25 °C.
    5. Центрифугируйте при 12 000 × г (10 мин, 4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Промойте гранулу 1 мл 75% этанола (2 x 5 минут), высушите РНК-гранулу на воздухе и повторно суспендируйте в DEPC-H2O (0,1% v/v).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте чистоту РНК (OD260/OD280 = 1,9-2,0) и подтвердите неповрежденные полосы рРНК 28S/18S.
  2. Синтез кДНК
    1. Смешайте 2 мкг мРНК + 1 мкл олиго(dT) праймера, доведите до 8 мкл с помощью DEPC-H2O (0,1% v/v), нагрейте до 70 °C в течение 5 минут и охладите на льду в течение 5 минут.
    2. Приготовьте мастер-смесь для обратной транскрипции в 10 мкл 2x TS Reaction Mix, 1 мкл RT/RI Enzyme Mix и 1 мкл средства для удаления гДНК. Добавьте 12 мкл исходной смеси к 8 мкл смеси РНК/праймера, полученной на этапе 6.2.1, чтобы получить общий объем реакции 20 мкл.
    3. Нагрейте смесь с шага 6.2.2. при 42 °C в течение 60 мин и завершить процесс нагреванием до 85 °C в течение 5 мин.
    4. Разбавьте 20 мкл реакции обратной транскрипции путем добавления 80 мкл безнуклеазного H2O, в результате чего конечный объем составит 100 мкл (4-кратное разведение). Используйте разведенную кДНК в качестве матрицы для количественной ПЦР.
  3. Количественный анализ ПЦР
    1. Запустите реакцию, смешав 2,0 мкл матрицы кДНК, 0,5 мкл прямого праймера (10 мкМ), 0,5 мкл обратного праймера (10 мкМ), 10 мкл мастер-смеси SYBR Green (2x) и 7 мкл ddH2O.
    2. Проводят ПЦР в следующих условиях: начальная денатурация: 95 °C/3 мин; 40 циклов: 95 °C/30 с; Tm-5 °C/30 с; 72 °C/30 с; кривая плавления: 65-95 °C (+0,5 °C/5 с).
    3. Анализ экспрессии генов методом 2-ΔΔct. Последовательности праймеров показаны в дополнительной таблице S2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когорта состояла из двух женщин и двух мужчин в возрасте от 46 до 73 лет (средний возраст: 64,0 года). Исходные измерения артериального давления показали систолическое артериальное давление в диапазоне от 109 до 168 мм рт.ст. и диастолическое давление от 68 до 115 мм рт.ст. У всех пациентов с СН в анамнезе регистрировались лекарственные препараты, включая распространенные кардиопротекторы, такие как бета-блокаторы, статины и антитромбоцитарные препараты, с индивидуальными вариациями ингибиторов ренин-ангиотензиновой сист...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавние исследования СВК определили метаболическое перепрограммирование в качестве ключевого патологического механизма, при этом метаболиты регулируют гомеостаз почечных сосудов 7,8,9. В то время как VSMC играют решающую роль в регулировании сосудистого тонуса и податливости при СВЦ, наше исследование предоставляет прямые доказательства того, что метаболиты, связанные с повреждением сердца, нар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 to Y. Z., 2021YFF0501404 to Y. L.), Национального фонда естественных наук Китая (82325004 и 92168114 до Y. Z., 82300286 до J. Z., 92168113 до E. D., 82170422 до Y. L.), Хайхэ Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (No. HH22KYZX0047 до Э. Д.), Китайский фонд постдокторантуры (BX20220023, 2022M720288 до Дж. З.), Пекинский фонд естественных наук (7252157 до Дж. З.). Пекинский муниципальный фонд естественных наук (7232096 до Y. L.), Исследовательский проект Третьей больницы Пекинского университета в Государственной ключевой лаборатории сосудистого гомеостаза и ремоделирования (Пекинский университет; 2024-VHR-SY-07 to Y.Z.). Рисунок 1 был создан с Biorender.com с утвержденными лицензиями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM с высоким уровнем глюкозыGibcoКат# 06-1055-57-1-ACS
ПБССоларбиоКат# P1010
Пенициллин-стрептомицин-амфотерицин ВThermo Fisher ScientificКат# 15240062
ФенилэфринMCEКошка#HY-B0769
Система обратной транскрипцииКомпания PromegaКат# A5001
Стереомикроскопическая системаЛейкаМ80
SYBR Green мастер-миксThermo Fisher ScientificКат# 4309155
Система измерения сосудистого давленияДМТ620 МИН.

Ссылки

  1. Cases and observations illustrative of renal disease, accompanied with the secretion of albuminous urine. Med Chir Rev. 25 (49), 23-35 (1836).
  2. Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
  3. KDIGO 2020 clinical practice guideline for diabetes management in chronic kidney disease. Kidney Int. 98 (4S), S1-S115 (2020).
  4. Amatruda, J. G., et al. Reninangiotensinaldosterone system activation and diuretic response in ambulatory patients with heart failure. Kidney Med. 4 (6), 100465(2022).
  5. Valente, M. A., et al. Diuretic response in acute heart failure: clinical characteristics and prognostic significance. Eur Heart J. 35 (19), 1284-1293 (2014).
  6. Damman, K., et al. Renal effects and associated outcomes during angiotensinneprilysin inhibition in heart failure. JACC Heart Fail. 6 (6), 489-498 (2018).
  7. Curaj, A., et al. Cardiovascular consequences of uremic metabolites: an overview of the involved signaling pathways. Circ Res. 134 (5), 592-613 (2024).
  8. Wang, J., et al. New insights into the pathophysiological mechanisms underlying cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 12 (12), 12422-12431 (2020).
  9. Zou, D., Li, Y., Sun, G. Attenuation of circulating trimethylamine Noxide prevents the progression of cardiac and renal dysfunction in a rat model of chronic cardiorenal syndrome. Front Pharmacol. 12, 751380(2021).
  10. Zhang, S., et al. Sensing ceramides by CYSLTR2 and P2RY6 to aggravate atherosclerosis. Nature. 641 (8062), 476-485 (2025).
  11. Zhang, J., Bottiglieri, T., McCullough, P. A. The central role of endothelial dysfunction in cardiorenal syndrome. Cardiorenal Med. 7 (2), 104-117 (2017).
  12. Guo, J., et al. Vasculopathy in the setting of cardiorenal syndrome: roles of proteinbound uremic toxins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 313 (1), H1-H13 (2017).
  13. Khandait, H., Sodhi, S. S., Khandekar, N., Bhattad, V. B. Cardiorenal syndrome in heart failure with preserved ejection fraction: insights into pathophysiology and recent advances. Cardiorenal Med. 15 (1), 41-60 (2025).
  14. Gabbin, B., et al. Toward human models of cardiorenal syndrome in vitro. Front Cardiovasc Med. 9, 889553(2022).
  15. Gabbin, B., et al. Heart and kidney organoids maintain organspecific function in a microfluidic system. Materials Today Bio. 23, 100818(2023).
  16. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  17. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and realtime recording of dynamic tension changes along vessel diameter. J Vis Exp. (184), e64121(2022).
  18. Lai, Y., et al. Gut microbiotaderived metabolites: potential targets for cardiorenal syndrome. Pharmacol Res. 214, 107672(2025).
  19. Brunt, V. E., et al. TrimethylamineNoxide promotes agerelated vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in mice and healthy humans. Hypertension. 76 (1), 101-112 (2020).
  20. Wang, B., Qiu, J., Lian, J., Yang, X., Zhou, J. Gut metabolite trimethylamineNoxide in atherosclerosis: from mechanism to therapy. Front Cardiovasc Med. 8, 723886(2021).
  21. Seldin, M. M., et al. Trimethylamine Noxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogenactivated protein kinase and nuclear factorκB. J Am Heart Assoc. 5 (2), 002767(2016).
  22. Watanabe, H., et al. pCresyl sulfate, a uremic toxin, causes vascular endothelial and smooth muscle cell damages by inducing oxidative stress. Pharmacol Res Perspect. 3 (1), e00092(2015).
  23. Muteliefu, G., et al. Indoxyl sulfate promotes vascular smooth muscle cell senescence with upregulation of p53, p21, and prelamin A through oxidative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (2), C126-C134 (2012).
  24. Kotlyarov, S., et al. Immunology of atherosclerosis: problems and prospects of immunotherapy. Vessel Plus. , (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.