Методическая статья

Анализ проницаемости мембраны липосомы для изучения влияния фосфатидилинозитолфосфатных групп на мембранотропное действие яда PLA2

827 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68594

⸱

26 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем экономически эффективный метод оценки проницаемости липосомальной мембраны с превосходной чувствительностью и разрешением по сравнению с традиционными методами. Используя новую реакцию замещения инкапсулированного лиганда, этот метод обнаруживает изменения, индуцированные фосфолипазойА-2 в модельных мембранах. Этот доступный подход, легко интегрируемый со стандартными анализами, повышает разрешение при изучении мембранной биофизики и токсинных взаимодействий.

Аннотация

Мы разработали новый, экономически эффективный и высокочувствительный анализ для оценки проницаемости липосомальных мембран, основанный на реакциях замещения лигандов с участием лигандов, инкапсулированных во внутреннем объеме липосом, который мы объединили с анализом гидролитической активности (с использованием ацилирования коэнзима А) и молекулярным моделированием для изучения того, защищают ли фосфаты инозитолового кольца в фосфатидилинозитоле мембраны от повреждающего воздействия аберрантно экспрессируемых ферментов. Аберрантная экспрессия фосфолипазА2 (PLA2) приводит к демиелинизации аксонов, что провоцирует развитие рассеянного склероза и болезни Альцгеймера. Чтобы имитировать эффекты аберрантно экспрессируемого PLA₂, мы использовали основную субъединицу яда гадюки PLA₂, HDP-2P. HDP-2P был протестирован на фосфатидилхолиновых (ПК) липосомах, обогащенных фосфатидилинозитолом, фосфатидилинозитол-4-фосфатом (PI-4-P) или фосфатидилинозитол-4,5-дифосфатом (PI-4,5-P2). В то время как HDP-2P показал минимальную гидролитическую активность и лишь незначительно увеличил проницаемость в липосомах ФК, обогащение липосомов ФК ПИ усилило как гидролиз, так и проницаемость. Примечательно, что PI-4-P и PI-4,5-P₂ резко ингибировали гидролитическую активность HDP-2P и полностью снижали проницаемость. Молекулярное моделирование показало, что фосфаты инозитолового кольца в фосфатидилинозитоле стерически блокируют доступ фосфолипидов к активному центру HDP-2P, предотвращая гидролиз. Данные in vitro и in silico свидетельствуют о том, что фосфорилированные фосфатидилинозитолы связаны со снижением активности PLA₂, что указывает на потенциальный механизм смягчения чрезмерной активности PLA₂ — предположительно в качестве средства защиты клеточных мембран от дегенерации.

Введение

Фосфатидилинозитол (ПИ) представляет собой анионный фосфолипид, состоящий из основы фосфатидной кислоты, связанной с инозитолом, гексагидроксишестиуглеродным кольцом, через фосфатную группу. Инозитол может быть обратимо превращен в фосфоинозитиды путем фосфорилированияв положениях углерода 2, 3, 4, 5 и 6 1. PI и фосфоинозитиды обнаружены в плазматических мембранах и органеллах различных клеток животных, растений и микроорганизмов. Спустя семьдесят лет после их открытия Мейблом и Лоуэллом Хокиными 2,3,4, PI и фосфоинозитиды остаются предметом обширных исследований, направленных на понимание их молекулярных механизмов и их значимости для здоровья человека 5,6,7.

Помимо мозговой ткани, фосфоинозитиды обычно присутствуют в низких концентрациях, составляя от 0,5 до 1% от общего количества липидов во внутреннем листке плазматической мембраны. Опубликованные данные указывают на то, что ПИ вряд ли будет играть важную структурную роль в физиологических условиях1. Однако во время болезненных состояний уровни PI и фосфоинозитидов повышаются, и они перекидываются на внешний листок плазматической мембраны, указывая на то, что эти фосфолипиды могут быть связаны с устойчивостью к болезням1. Хотя долгое время считалось, что ПИ играет менее значимую физиологическую роль по сравнению с фосфоинозитидами, новые данные подчеркивают важность PI-4-P и PI-4,5-P2 в различных физиологических процессах1. Эти процессы включают внутриклеточную передачу сигналов, межклеточную передачу сигнала 8,9,10, мембранный транспорт 11,12,13, модуляцию экспрессии генов1, а также пролиферацию клеток14 и выживаемость1. Несмотря на это, молекулярные механизмы, с помощью которых PI и фосфоинозитиды управляют этими процессами, остаются плохо изученными.

PI и фосфоинозитиды в изобилии присутствуют в клетках тканей мозга, где они составляют примерно 10% от общего количества фосфолипидов, хотя их уровни могут временно увеличиваться на ранних стадиях заболеваний головного мозга, что позволяет предположить, что фосфоинозитиды могут противодействовать развитию неврологических патологий1, таких как рассеянный склероз и болезнь Альцгеймера, вызванные демиелинизацией аксонов, вызванной аберрантной активностью PLA2s 15, 16,17. Эти ферменты принадлежат к различным классам и группам, включая секреторную фосфолипазу группы IIA A2 (sPLA2)15. Повышенные уровни этой группы ферментов обнаруживаются в спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом и болезнью Альцгеймера, где они способствуют разрушению миелиновых мембран, приводящим к демиелинизации15. Также сообщалось, что sPLA2s из змеиных ядов ингибируют передачу в нервно-мышечных синапсах18,19, вызывая расстройства центральной нервной системы и отрицательно влияя на периферическую нервно-мышечную систему20.

В этом исследовании мы изучали, могут ли PI и фосфоинозитиды защищать модельные фосфолипидные мембраны от воздействия аберрантно экспрессируемых ферментов sPLA2. Модельные мембраны были изготовлены из фосфатидилхолина (ФК), наиболее распространенного фосфолипида во всех клеточных мембранах млекопитающих21, обогащенного 20% молярным соотношением либо PI, либо PI-4-P, либо PI-4,5-P2. Для имитации эффектов аберрантно экспрессируемых ферментов sPLA2 на модельных мембранах мы использовали основную субъединицу HDP-2P группы IIA секреторного яда гадюки нейротоксического фермента PLA22, гидролитическая активность которого ранее изучалась на модельных миелиновых мембранах23.

Для этой работы мы разработали новый подход к исследованию изменений проницаемости липосомальных мембран, пораженных HDP-2P. Новый метод основан на реакции замещения лиганда в растворе CuSO4 вне липосом, в которой участвует лигандNH-3, захваченный внутри липосом. Если индуцированная HDP-2P проницаемость мембраны допускает утечку NH3 из липосом, то высвобожденный аммиак количественно заменит четыре молекулы воды в гидратированных ионах меди в результате реакции: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2О (л). Этот обмен лигандов приводит к характерному увеличению оптической плотности раствора, измеряемой с помощью спектрофотометрии (λ = 600 нм), что служит для количественного считывания изменений мембранной проницаемости. Наш подход, основанный на замене лиганда, демонстрирует превосходную чувствительность для оценки проницаемости мембраны по сравнению с традиционными методами, такими как 1H-ЯМР 23,24,25,26,27,28 и анализы транспорта ионов29, предлагая при этом дополнительное преимущество, заключающееся в отсутствии дорогостоящих приборов. Этот простой и экономически эффективный метод, примененный в сочетании с измерениями гидролитической активности HDP-2P и моделированием in silico связывания PI, PI-4-P и PI-4,5-P2 с молекулярной поверхностью HDP-2P, позволил нам сделать вывод о том, что фосфаты инозитолового кольца в PI устраняют разрушающее действие HDP-2P на мембраны PC, обогащенные PI-4-P или PI-4. 5-2. Если этот вывод подтвердится в дальнейших исследованиях, способность инозитолкольцевых фосфатов в ПИ защищать от вредного воздействия аномально действующих клеточных белков, потенциально способствующих стабильности мембран в условиях заболевания, включающих аберрантную активность белка, может проложить путь к разработке новых фармацевтических препаратов для лечения неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз.

Протокол

1. In silico моделирование взаимодействия HDP-2P с PI и фосфоинозитидами с помощью программного обеспечения для молекулярного моделирования

  1. Установка и подготовка программного обеспечения
    1. Установите указанный редактор химических чертежей для создания молекул лиганда, как показано в дополнительном файле 1-дополнительном рисунке S1A.
    2. Установите программное обеспечение для молекулярного моделирования молекулярного докинга лиганда к рецептору.
    3. Установите автоматизированные инструменты стыковки для подготовки лигандов и рецепторов.
    4. Поскольку программное обеспечение для молекулярного моделирования зависит от среды Python, установите Python.
  2. Подготовка лиганда
    1. Во-первых, используйте редактор химических чертежей для построения атомных координат молекулярных структур PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, кардиолипина и фосфатидилсерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример протокола на следующих этапах получения лиганда описывает этапы только для PI.
    2. Постройте молекулярную структуру PI с помощью редактора химических чертежей, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительном рисунке S1B , и сохраните файл в формате PDB, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительном рисунке S2.
    3. Откройте PDB-файл в программном обеспечении автоматической стыковки, как показано на дополнительном файле 1-дополнительном рисунке S3A.
    4. Добавьте атомы водорода, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S3B , и выберите либо полярные, либо все атомы водорода, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S4A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения стыковки PI с HDP-2P выберите только полярные атомы водорода, чтобы упростить визуализацию полярных или водородных связей.
    5. Установите молекулу PI в качестве лиганда для программного обеспечения автоматического инструмента стыковки, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S4B.
    6. Сохраните лиганд в виде файла PDBQT, как показано в дополнительном файле 1-дополнительном рисунке S5A. Убедитесь, что все связи вращаются.
  3. Подготовка рецепторов
    1. Скачать PDB-файл фосфолипазы А2 HDP-2 (PDB-код 2I0U), состоящего из двух мономеров, один из которых является кислым, ферментативно неактивным, А, а другой – основным, ферментативно активным, Е. Чтобы удалить ферментативно неактивный мономер A, импортируйте файл 2I0U в программу молекулярного моделирования (Supplemental File 1-Supplemental Figure S5B), выберите все атомы мономера A (Supplemental File 1-Supplemental Figure S6A), затем перейдите в раздел «Edit» и удалите все атомы мономера A (Supplemental File 1-Supplemental Figure S6B). Сохраняйте ферментативно активный мономер Е, который теперь обозначается как рецептор.
    2. Откройте PDB-файл рецептора HDP-2P в программном обеспечении автоматического инструмента стыковки, как показано в дополнительном файле 1-дополнительном рисунке S7.
    3. Удалите все молекулы воды, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительном рисунке S8A.
    4. Добавьте атомы водорода, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительном рисунке S8B. Обратите внимание, что после завершения стыковки HDP-2P с PI, для упрощения визуализации полярных и водородных связей необходимо выбирать только полярные водороды.
    5. Установите HDP-2P в качестве рецептора, как показано в дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S9A, и сохраните его как файл PDBQT. Убедитесь, что рецептор установлен без вращающихся связей.
  4. Настройка параметров стыковки
    1. Откройте файлы PDBQT лиганда и рецептора.
    2. Войдите в интерфейс настройки грид-бокса, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S9B, и определите координаты размера сетки (размер x = 44,644; размер y = 74,939; размер z = 43,050) и центра (центр x = 25,626; центр y = 9,582; центр z = 41,825), которые полностью охватывают всю поверхность молекулы рецептора, как показано в дополнительном файле 1 - Дополнительный рисунок S10A.
    3. Закройте интерфейс настройки сетки с текущими настройками, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S10B , и сохраните параметры стыковки в файле config.txt, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S11A.
  5. Запуск программного обеспечения для молекулярного докинга
    1. Запустите программное обеспечение для молекулярного докинга с помощью файла config.txt, как показано в Дополнительном файле 1-Дополнительном рисунке S11B.
    2. Выполните расчет стыковки (~30-90 мин; Дополнительный файл 1-Дополнительный рисунок S12).
    3. Проверьте файл docking_log.txt, чтобы просмотреть оценки стыковки (привязки привязки).
    4. Выберите результат стыковки с наименьшей конформацией энергии.
  6. Анализ данных стыковки
    1. Используйте программное обеспечение автоматического инструмента стыковки, чтобы открыть файл результатов стыковки PDBQT.
    2. Анализируйте сайты связывания лиганд-рецепторов, уделяя особое внимание активному центру рецептора и межмолекулярным взаимодействиям, включая ионные, ионно-полярные, полярные и водородные связи. Составьте таблицу для PI и фосфоинозитида, который взаимодействует с активным центром рецептора, чтобы описать аффинности сайтов связывания в ккал/моль, заряженные и полярные фрагменты в полярной головке PI/фосфоинозитида, а также остатки HDP-2P, участвующие в межмолекулярных связях, а также типы связей, как показано в таблицах 1 и 2. Повторите стыковку для каждой пары рецептор-лиганд 3 раза, чтобы убедиться в отсутствии отклонений в сайтах связывания, аффинностях связывания, заряженных и полярных фрагментах остатков PI/фосфоинозитида и HDP-2P, а также в типе связей.

2. Гидролитическая активность HDP-2P в липосомах PC, обогащенных PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS или CL, контролируется с помощью коэнзима А, ацилированного свободными жирными кислотами

ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ, метанол, NH3 и CuSO4 опасны. Всегда используйте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Обрабатывайте все протоколы с этими реагентами под вытяжным шкафом. Храните хлороформ в стеклянной бутылке янтарного цвета. Храните метанол в легковоспламеняющихся шкафах вдали от окислителей. Держите метанол подальше от пламени и искр. Промаркируйте все контейнеры для отходов для этих реагентов и утилизируйте в соответствии с местными правилами утилизации опасных отходов.

  1. Приготовьте 100 мл буферного раствора для гидролиза фосфолипидов, катализируемого HDP-2P, путем растворения 5,55 мг CaCl2 в 0,10 М буфере Tris-HCl (pH 7,4).
  2. Приготовьте 50 мл 1,0 М стокового раствора ЭДТА, растворив 7,31 г ЭДТА в деионизированной дистиллированной воде (ддН20).
  3. Приготовьте 0,54 мМ стоковый раствор HDP-2P в 0,10 М буфере Tris-HCl (pH 7,4). Молярная масса HDP-2P составляет 13,827 кДа.
  4. Приготовьте следующие исходные растворы фосфолипидов в концентрации 10,0 М в смеси хлороформа/метанола (2 к 1 по объему): яичный желток L-α-фосфатидилхолин (ПК), кардиолипин сердца крупного рогатого скота (КЛ), L-α-фосфатидил-L-серин (ПС) ГОЛОВНОГО МОЗГА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПИ, ПИ-4-и ПИ-4,5-2. Молярные массы PC, CL, PS, PI, PI-4-P и PI-4,5-P2 составляют 768 Да, 1466 Да, 792 Да, 867 Да, 962 Да и 1057 Да, соответственно, как описано ниже.
  5. Подготовьте пять образцов липосом. Для приготовления образца липосом ФК добавьте 75 мкл исходного раствора хлороформа/метанола ФК в стеклянную пробирку и высушите липиды при 25 °С при вакууме 10 Па в течение 1 ч до образования липидной пленки. Гидратировать липидную пленку в течение 1 ч 15 мл буферного раствора для гидролиза фосфолипидов при температуре 25 °C в термостате. Затем вставить титановый пистолет ультразвукового дозатора мощностью 100-150 Вт в липидную суспензию в стеклянной пробирке, помещенной в ледяную баню, и обработать суспензию ультразвуком на частоте 22 кГц в течение 10 мин, не превышающей 50% от максимальной мощности. Чтобы удалить частицы титановой пыли, центрифугируйте липосомы при 200 × г (1270 об/мин с ротором 10 см) в течение 10 минут при комнатной температуре.
  6. Приготовьте образцы липосом, обогащенных CL, PS, PI, PI-4-P или PI-4,5-P2 в соотношении ПК и других липидных моляров 4 к 1, смешав стоковые растворы хлороформа/метанолфосфолипида -60 мкл ФК с 15 мкл либо CL, PS, PI, PI-4-P, либо PI-4,5-P 2-в стеклянной пробирке. Затем высушите липиды в вакууме 10 Па или в течение 3 часов при комнатной температуре, увлажните липидную пленку в буферном растворе для гидролиза фосфолипидов и обработайте ультразвуком ультразвуковыми волнами, как описано выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого типа липосом подготовьте пять образцов.
  7. Поместите по 1,0 мл из пяти образцов от каждого типа липосом, описанных выше, в отдельные пробирки и добавьте в каждую пробирку по 10 мкл бесцветного раствора коэнзима-А из набора NEFA, а затем добавьте 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 или 3,72 мкл 0,54 мМ стокового раствора HDP-2P в отдельные пробирки для получения в образцах липосомы соотношения моляров HDP-2P/фосфолипиды 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 и 0,004 соответственно.
  8. Сразу после добавления HDP-2P в липосомы инкубируйте образцы липосом в течение 15 мин при 37 °C в термостате, а затем остановите фосфолипидный гидролиз, индуцированный HDP-2P, добавив 100 мкл исходного раствора ЭДТА. После этого сделайте вортсинг образцов в течение 1 минуты.
  9. Количественно оцените гидролитическую активность HDP-2P путем измерения оптической плотности липосомальных образцов на длине волны 550 нм с помощью спектрофотометра, который измерит степень, в которой бесцветный раствор коэнзима-А становится фиолетовым при его ацилировании свободными жирными кислотами.
  10. Повторите описанную выше процедуру еще два раза, чтобы средние значения оптической плотности были получены из трех независимых испытаний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка данных, полученная в этом экспериментальном испытании, является средним значением оптической плотности. В идеале стандартное отклонение точек экспериментальных данных должно лежать в пределах ±5% от среднего.

3. Влияние HDP-2P на проницаемость липосомальных мембран PC, обогащенных PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS или CL, измеренное с помощью реакции замещения лиганда в растворе CuSO4 с участием лиганда NH3 , захваченного внутри липосом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ, метанол, NH3 и CuSO4 опасны. Всегда используйте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Обрабатывайте все протоколы с этими реагентами под вытяжным шкафом. Храните хлороформ в стеклянной бутылке янтарного цвета. Храните метанол в легковоспламеняющихся шкафах вдали от окислителей. Держите метанол подальше от пламени или искр. Промаркируйте все контейнеры для отходов для этих реагентов и утилизируйте в соответствии с местными правилами утилизации опасных отходов.

  1. Приготовьте по 20 мл 0,03 М стоковых растворов для каждого из шести фосфолипидов - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- в хлороформе/метаноле (2 к 1 объему). Молекулярные массы PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 составляют 768, 1466, 792, 867, 962 и 1057 Да соответственно.
  2. Приготовьте 100 мл 0,10 М Трис-HCl (pH 7,4) буфера с конечной концентрацией 0,05 МCuSO4.
  3. Приготовьте 4 мл 1,5 × 10-3 М запаса HDP-2P в 0,05 М CuSO4, 0,10 М Tris-HCl (pH 7,4). Молярная масса HDP-2P составляет 13,827 кДа.
  4. Для приготовления 100 мл 0,5 М раствора NH3 используют 25% раствор NH3 (плотность 905 г/л30, равна 13,30 М [905 г/л × 0,25 М ÷ 17,00 г/л = 13,30 М]). Таким образом, для приготовления 100 мл 0,5 М NH3 используют 3,76 мл 25% раствора NH3 : (0,5 М × 1000 мл ÷ 13,30 М) ÷ 10 = 3,76 мл 25% раствора NH3 . Поместите 3,76 мл 25% раствора NH3 в мерную колбу объемом 100 мл и доведите объем до 100 мл с помощью 0,10 М Трис-HCl (pH 7,4).
  5. Для приготовления липосом с NH3 во внутреннем объеме липосом поместите в пробирку 12,5 мл 0,03 М стокового раствора фосфолипидов в хлороформе/метаноле и высушите фосфолипиды в вакууме 10 Па или в течение 3 ч при комнатной температуре. Увлажнить фосфолипидную пленку в течение 1 ч 12,5 мл 0,5 М NH3, 0,10 М Tris-HCl (pH 7,4) при 25 °C в термостате; затем ультразвуком обрабатывают липидную суспензию на частоте 22 кГц, как описано в шаге 2.5, для получения липосом, обработанных ультразвуком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В растворе с ультразвуковыми липосомами NH3 находится внутри и снаружи липосом.
  6. Чтобы устранить NH3 за пределами липосом, диализируйте липосомы с помощью диализной мембраны (молекулярная отсечка 1,0 кДа) при комнатной температуре 5 шляп против 0,10 М Tris-HCl (pH 7,4) с помощью магнитной мешалки.
    Диализ в течение 5 ч был достаточен для полного удаления NH3, так как добавление 0,5 мл диализованных липосом к 0,5 мл 0,10 М Tris-HCl, 0,05 М буфера CuSO4 давало такую же оптическую плотность при длине волны 600 нм, как и у липосом, приготовленных без NH3 и смешанных с тем же буфером.
  7. После диализа центрифугируйте липосомы при концентрации 200 × г в течение 90 минут, как описано в шаге 2.5, чтобы гранулировать липосомы. Отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте липосомы 5,0 мл 0,10 М Трис-HCl, 0,05 М CuSO4 (pH 7,4) и разделите ресуспендированные липосомы на пять образцов по 1,0 мл каждая. Добавьте к этим пяти образцам объемом 1,0 мл отдельно 60, 40, 20 и 0 мкл 0,10 М Трис-HCl, 0,05 М буфера CuSO4 (pH 7,4), а затем 0, 20, 40, 60, 80 мкл стокового буфера HDP-2P для корректировки в образцах липосом соотношения моляров HDP-2P/фосфолипиды 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 и 0,004 соответственно.
  8. Инкубировать образцы липосом в течение 30 минут в термостате при температуре 37 °C; Затем измерьте оптическую плотность образцов липосом на длине волны 600 нм с помощью спектрофотометра. Выполните действия, описанные в разделе 3 для всех шести образцов липосом, и повторите 3 раза, чтобы обеспечить тройные показания оптической плотности для каждой точки данных.
    Примечание: Стандартное отклонение экспериментальных данных всегда должно быть в пределах ±5% от среднего.

Результаты

Молекулярное моделирование взаимодействия HDP-2P с PI и фосфоинозитидами
Программа молекулярного моделирования вычисляет лучшие девять сайтов связывания на молекулярной поверхности рецептора (более крупной молекулы), на который нацелен лиганд (меньшая молекула). Эти участки определяются высвобождением девяти высших энтальпий, которые обозначают участки с наилучшим сродством связывания. Аффинность связывания выражается в виде отрицательных значений, что указывает на то, что межмолекулярное связывание является экзотермическим процессом. В случае взаимодействия HDP-2P с PI, моделирование предсказывало четыре сайта связывания (#3, #6, #7 и #8) для PI на молекулярной поверхности HDP-2P в активном центре (Таблица 1). Кроме того, пять сайтов связывания для PI были обнаружены за пределами активного центра HDP-2P. Обозначения заряженной и полярной частей в полярной головке ПИ проиллюстрированы на рисунке 1.

Активный центр HDP-2P состоит из пяти ключевых аминокислотных остатков: Gly30, Gly32, His48, Asp49 и Lys69, которые способствуют правильному выравниванию фосфолипидного субстрата в активном центре для обеспечения каталитического гидролиза. Некоторые репрезентативные состыкованные структуры демонстрируют связывание PI с некоторыми аминокислотными остатками активного центра, тогда как в сайте связывания #6 PI взаимодействует со всеми пятью ключевыми аминокислотными остатками активного центра через ионные, ионно-полярные и водородные связи (табл. 1). На рисунке 2 показано, как PI взаимодействует со всеми пятью ключевыми аминокислотными остатками в активном центре HDP-2P в сайте связывания #6.

Моделирование стыковки взаимодействия между HDP-2P и PI-4-P, который содержит фосфатную группу в положении 4 инозитолового кольца, предсказало только сайт связывания #1 в качестве места, где PI-4-P связывается с активным центром HDP-2P. В частности, в этом сайте PI-4-P взаимодействует с тремя ключевыми аминокислотными остатками активного центра — Gly30, Gly32 и Lys69 — через ионные, ионно-полярные и водородные связи (Таблица 2). На рисунке 3 показано взаимодействие PI-4-P с активным центром HDP-2P. В остальных восьми сайтах связывания на молекулярной поверхности HDP-2P PI-4-P связывается с местами за пределами активного центра.

Моделирование молекулярного докинга взаимодействий HDP-2P с PI-4,5-P₂ (содержащим фосфатные группы в положениях 4 и 5 инозитолового кольца) показало отсутствие связывания с активным центром фермента во всех девяти предсказанных сайтах связывания. Вместо этого PI-4,5-P₂ последовательно связывается с бороздчатой полостью, прилегающей к активному центру (рис. 4), образуя ионно-полярные и водородные связи с тремя остатками HDP-2P: Trp31, Gly33 и Gln34).

В то время как связывание PI-4,5-P₂ с бороздчатой полостью вблизи активного центра клеточного или яда PLA2s ранее не было задокументировано, структурно аналогичные особенности хорошо известны в доменах гомологии плекстрина31 (PH) и эпсина N-концевой гомологии32 (ENTH). Эти сигнальные домены используют сходные гидрофобно-полярно-катионные архитектуры канавок для специфического распознавания PI-4,5-P2 31,32, несмотря на их неферментативную природу. Наличие сопоставимого структурного мотива у HDP-2P открывает интригующие возможности либо эволюционной мимикрии, либо конвергентной эволюции для облегчения распознавания мембранных доменов HDP-2P. При дальнейшей проверке другими методами, это исследование может представлять собой первый зарегистрированный случай использования яда PLA2 с использованием такого механизма распознавания фосфоинозитида.

Интересно, что моделирование молекулярного докинга CL и PS, взаимодействующих с HDP-2P, предсказало связывание обоих фосфолипидов с активным центром HDP-2P в восьми из девяти сайтов связывания, в то время как единственный сайт связывания CL и PS снаружи активного центра не был расположен в бороздчатой полости (данные не показаны). Также стоит отметить, что, как и PI, PC связывается с активным центром HDP-2P в четырех из девяти мест связывания, и как PI, так и PC, как CL и PS, не связываются с бороздчатой полостью (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что фосфатные группы на инозитоловом кольце PI имеют высокое сродство связывания с бороздчатой полостью, расположенной рядом с активным центром. Структурный анализ выявил аналогичные бороздчатые полости с гидрофобно-полярно-катионными поверхностными участками вблизи каталитического центра как в ферментах клеточного33 , так и в ферментах яда34 PLA2 . Связывание фосфоинозитидов с этими полостями может вызывать физиологически значимые конформационные изменения, потенциально ингибируя ферментативную активность. Примечательно, что среди фосфоинозитидов PI-4,5-P2 демонстрирует особенно плохие субстратные характеристики — изоформы PLA2 человека (цитозольные, кальций-независимые и секретируемые типы) демонстрируют минимальную или неопределяемую гидролитическую активность по отношению к PI-4,5-P235. Это говорит о том, что связывание фосфоинозитида с этими консервативными структурными особенностями может выполнять определенную физиологическую функцию (например, аллостерическое ингибирование), а не каталитические функции в надсемействе PLA2 , что требует будущей экспериментальной проверки.

Гидролитическая активность HDP-2P в липосомах ФК, обогащенных PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS или CL, контролировалась с помощью коэнзима А, ацилированного свободными жирными кислотами
Гидролитическую активность HDP-2P на липосомальных образцах оценивали с помощью раствора коэнзима А. Раствор кофермента А бесцветен, но становится фиолетовым при ацилировании свободными жирными кислотами, высвобождаемыми при гидролизе фосфолипидов, катализируемом HDP-2P. Результирующее увеличение оптической плотности, соответствующее степени ацилирования коэнзима А, измеряли спектрофотометрически при длине волны 550 нм. Таким образом, увеличение оптической плотности в липосомальных образцах, обработанных коэнзимом А и HDP-2P, прямо пропорционально гидролитической активности HDP-2P.

На рисунке 5 представлены кривые гидролитической активности в зависимости от соотношения моляров HDP-2P/фосфолипидов в различных липосомальных образцах. Гидролитическая активность HDP-2P выражается в условных единицах (а.е.) оптической плотности (OD), измеренной при 550 нм. Мы не строили калибровочную кривую для связи значений a.u. с молярными концентрациями свободных жирных кислот, так как наши экспериментальные испытания показали, что жирные кислоты в органических растворителях при добавлении в водные растворы, содержащие коэнзим А и ацил-коэнзим А-синтетазу, не вызывали обнаруживаемого изменения OD при 550 нм. Это указывает на то, что такие жирные кислоты образуют мицеллы, а не связываются с коэнзимом А. Напротив, только мембранные жирные кислоты (вырабатываемые активностью PLA2 ) связываются с мембраноассоциированным коэнзимом А, что приводит к измеримому изменению OD. Амфипатическая природа коэнзима А, имеющего на своей молекулярной поверхности как гидрофобные, так и гидрофильные области, преимущественно локализует его на границе мембрана-вода, что способствует связыванию жирных кислот, вырабатываемых активностью PLA2 , с коэнзимом А. Однако в этих условиях анализа определение молярной концентрации жирных кислот не представляется возможным. По этой причине исследователи с помощью анализа коэнзима А экспрессируют гидролитическую активность PLA2 в условных единицах OD, измеренных при 550 нм20.

Наибольшее увеличение оптической плотности, соответствующее наибольшей гидролитической активности HDP-2P, наблюдалось в липосомах РС, обогащенных CL или PS. Это открытие хорошо согласуется с наибольшим числом сайтов связывания для CL и PS в активном центре HDP-2P. Гидролитическая активность HDP-2P в липосомах ФК, обогащенных ПХ, была в 3,0- и 2,5 раза ниже, чем в липосомах, обогащенных КЛ или ФС соответственно, но выше, чем в чистых липосомах ФК. Это говорит о том, что сродство связывания с активным центром HDP-2P PI выше, чем у PC, несмотря на то, что оба липида имеют одинаковое количество сайтов связывания в активном центре.

Это кажущееся несоответствие может быть объяснено структурными различиями в полярных головных группах PI и PC. В то время как ПК является нейтральной молекулой, его катионная триметиламмониевая группа распространяется наружу внутрь раствора, в то время как анионная фосфатная группа расположена ближе к гидрофобной области мембраны. Такое распределение заряда в головной группе ПК может создавать электростатическое отталкивание от основного HDP-2P, снижая его сродство к связыванию. Напротив, кислая природа PI делает его более привлекательным липидным видом для взаимодействия с основным HDP-2P, что может объяснить его более высокую гидролитическую активность по сравнению с чистыми липосомами PC.

Гидролитическая активность HDP-2P в липосомах PC, обогащенных PI-4-P, как показано на рисунке 5, предполагает минимальный каталитический гидролиз фосфолипидов. Примечательно, что кривая оптической плотности, полученная из липосом ФК, обогащенных PI-4,5-P, указывает на полное аннулирование гидролитической активности HDP-2P в данном образце липосом. Эти результаты хорошо согласуются с моделированием стыковки, которое предсказывает наличие одного сайта связывания для PI-4-P в активном центре HDP-2P, в то время как PI-4,5-P2 вообще не демонстрирует аффинности связывания с активным центром. Это говорит о том, что фосфатные группы, связанные с инозитоловым кольцом, препятствуют связыванию фосфолипида с активным центром HDP-2P. Мы предполагаем, что фосфатные группы на инозитоловом кольце распространяются наружу внутрь раствора и, связываясь с HDP-2P посредством ионных и ионно-полярных межмолекулярных взаимодействий, удерживают HDP-2P на расстоянии от поверхности мембраны, тем самым защищая мембрану от гидролитической активности HDP-2P. Это согласуется с недавними данными, показывающими, что цитозольные, кальций-независимые и секретируемые ферменты PLA2 человека проявляли едва обнаруживаемую гидролитическую активность по отношению к субстратам PI-4-P и PI-4,5-P2 35.

HDP-2P-индуцированные изменения проницаемости в липосомальных мембранах ФХ, обогащенных PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS или CL: оценка с помощью реакции замещения лиганда в растворе CuSO4 с инкапсулированным NH₃

Влияние гидролитической активности HDP-2P на проницаемость мембран липосом, обогащенных PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS или CL, исследовали с помощью реакции замещения лиганда в комплексной ионной системе, где замещающий лиганд инкапсулировался во внутреннем объеме липосом. Этот простой и надежный метод основан на вытеснении четырех молекул воды, действующих как лиганды, в комплексе иона [Cu(H2O)6]2+ на NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

В процессе замещения NH3 молекул воды в комплексном ионе [Cu(H2O)6]2+ бледно-голубой цвет [Cu(H2O)6]2+ переходит в темно-синий цвет [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. В системе, в которой NH 3 инкапсулирован во внутреннем объеме липосом, а [Cu(H2O)6]2+ присутствует во внешнем растворе, это изменение цвета, контролируемое спектрофотометрически, указывает на увеличение проницаемости липосомальной мембраны до NH3.

Чтобы создать такую систему, мы провели ультразвуковую дисперсию фосфолипидов в буфере Tris-HCl, содержащемNH3, образуя ультразвук в липосомах с NH₃ внутри и снаружи липосом. Наружный NH3 удаляли путем диализа, после чего к образцу липосомы, содержащему NH3 во внутреннем объеме, добавляли раствор CuSO4. Затем мы обрабатывали липосомы HDP-2P и отслеживали изменения оптической плотности спектрофотометрически.

Чтобы определить оптимальную длину волны для измерения изменения оптической плотности, мы зарегистрировали спектры поглощения [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ в 0,025 М CuSO4, 0,100 М растворе NH3 и [Cu(H2O)6]2+ в 0,025 М растворе CuSO4 с использованием видимого света в диапазоне от 500 нм до 900 нм. Как показано на рисунке 6, облучение на длине волны 600 нм дало максимальное поглощение для [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ и минимальное поглощение для [Cu(H2O)6]2+, что привело нас к выбору 600 нм в качестве оптимальной длины волны для наших экспериментов по мембранной проницаемости.

На рисунке 7 показано, что мембранная проницаемость для NH₃ наиболее высока в липосомах PC, обогащенных анионными CL и PS. Это наблюдение согласуется с нашими ранее опубликованными данными, показывающими, что HDP-2P, группа IIA PLA2, эффективно взаимодействует с анионным фосфолипидом пальмитоилолеоил-глицерофоглицерином, что приводит к гидролизу субстрата – эффект, не наблюдаемый при использовании нейтрального фосфолипида пальмитоиллеоилглицерофосфохолина36. В целом, большинство ферментов группы IIA PLA2 проявляют значительно более высокую гидролитическую активность по отношению к анионным фосфолипидам 33,37,38. Проницаемость липосом PC+PI ниже, чем у липосом PC+CL и PC+PS, но остается выше, чем у чистых липосом. Эти результаты хорошо согласуются с результатами моделирования докинга и анализов гидролитической активности HDP-2P. Другими словами, ожидается, что липосомальные образцы с низкой проницаемостью будут структурно стабильными из-за неспособности HDP-2P гидролизовать фосфолипиды и из-за более низкого сродства HDP-2 к связыванию с PI и фосфоинозитидами, как и предсказывают данные молекулярного докинга (рис. 2, рис. 3 и рис. 4). Следовательно, гидролитическая активность фермента HDP-2P (рис. 5) и проницаемость мембраны, как показано на рисунке 7, должны быть положительно коррелированы.

Однако в липосомах PC+PI-4-P и PC+PI-4,5-P2 проницаемость не увеличивалась при лечении HDP-2P. В то время как результаты проницаемости в липосомах PC+PI-4,5-P2 хорошо коррелируют с моделированием стыковки и данными гидролитической активности HDP-2P для тех же липосом, отсутствие повышенной проницаемости в липосомах PC+PI-4-P не полностью согласуется с результатами гидролитической активности, поскольку в этих липосомах была зарегистрирована небольшая степень гидролитической активности. Эти данные свидетельствуют о том, что небольшое локализованное увеличение гидролитической активности в липосомах PC+PI-4-P не нарушает бислойную упаковку фосфолипидов до такой степени, которая могла бы изменить проницаемость мембраны до NH3.

figure-results-2
Рисунок 1: Обозначения заряженных и полярных фрагментов полярной головки фосфатидилинозитола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 2: Взаимодействие PI с активным центром HDP-2P, предсказанным для сайта связывания #6 с помощью программного обеспечения для молекулярного докинга. PI задается в виде палочек, а HDP-2P — в линейном (диаграмма слева) и молекулярной поверхности (диаграмма справа). Для изображений в виде палочек изумруд представляет углерод, оранжевый — фосфор, красный — кислород, а белый — водород. Для молекулярной поверхности и линий зеленый цвет представляет углерод, синий — азот, красный — кислород, белый — водород, а желтый — серу. Желтые ломаные линии обозначают межмолекулярные связи. Стрелки указывают на аминокислотные остатки в активном центре. Сокращения: PI = фосфатидилинозитол; HDP-2P = основная субъединица фосфолипазы яда гадюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 3: Взаимодействие PI-4-P с активным центром HDP-2P, предсказанным для сайта связывания #1 с помощью программного обеспечения для молекулярного докинга. PI-4-P представлен в виде палочек, а HDP-2P — в виде линий (диаграмма слева) и молекулярной поверхности (диаграмма справа). Для палочек изумруд представляет углерод, оранжевый — фосфор, красный — кислород, а белый — водород. Для молекулярной поверхности и линий зеленый цвет обозначает углерод, синий — азот, красный — кислород, белый — водород, а желтый — серу. Желтые ломаные линии обозначают межмолекулярные связи. Стрелки указывают на аминокислотные остатки в активном центре. Сокращения: PI-4-P = фосфатидилинозитол-4-фосфат; HDP-2P = основная субъединица фосфолипазы яда гадюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 4: Взаимодействие PI-4,5-P2 с молекулярной поверхностью HDP-2P, предсказанной для сайта связывания #6 с помощью программного обеспечения для молекулярного докинга. PI-4,5-P2 связывается с бороздчатой пещерой, расположенной ниже активного центра HDP-2P. Пять ключевых аминокислотных остатков в активном центре представлены в трехбуквенной нотации. PI-4,5-P2 представлен в виде палочек, а HDP-2P — в линейном (диаграмма слева) и молекулярной поверхности (диаграмма справа). Для палочек изумруд представляет углерод, оранжевый — фосфор, красный — кислород, а белый — водород. Для молекулярной поверхности и линий зеленый цвет обозначает углерод, синий — азот, красный — кислород, белый — водород, а желтый — серу. Сокращения: ПИ-4,5-2 = фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; HDP-2P = основная субъединица фосфолипазы яда гадюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 5: Кривые гидролитической активности из образцов липосом при различных соотношениях HDP-2P/фосфолипидные моляры. Липосомы состоят из PC+CL (темно-зеленый), PC+PS (оранжевый), PC+PI (темно-синий), PC+PI-4-P (синий), PC+PI-4,5-P2 (зеленый) и PC (фиолетовый). Значения оптической плотности в условных единицах представляют собой среднее значение тройных показаний на длине волны 550 нм. Полосы погрешностей указывают на SD тройных показаний. Статистическая значимость различий в значениях оптической плотности среди образцов липосом была оценена с помощью ANOVA, при этом все p-значения оказались значительно ниже 0,05. Сокращения: PC = фосфатидилхолин; CL = кардиолипин бычьего сердца ; PS = фосфатидилсерин; PI = фосфатидилинозитол; PI-4-P = фосфатидилинозитол-4-фосфат; PI-4,5-P2 = фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; a.u. = условные единицы; HDP-2P = основная субъединица фосфолипазы яда гадюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 6: Спектры поглощения водных растворов комплексов меди. Комплексы меди [Cu(H2O)6]2+ (оранжевая линия) и [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (синяя линия), облучаемые видимым светом в диапазоне от 500 нм до 900 нм. Медный комплекс [Cu(H2O)6]2+ получали в растворе 0,025 MCuSO4 , а медный комплекс [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ получали в растворе 0,025 M CuSO4, содержащем 0,100 MNH3. Значения поглощения на этом рисунке для каждой точки данных являются средними значениями абсорбции, полученными в трех экземплярах. Полосы погрешностей представляют собой SD из трех показаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 7: Кривые проницаемости мембран из образцов липосом. Липосомы состоят из PC+CL (фиолетовый), PC+PS (синий), PC+PI (темно-синий), PC+PI-4-P (темно-зеленый), PC+PI-4,5-P2 (оранжевый) и PC (зеленый) с различными молярными соотношениями HDP-2P/фосфолипиды. Значения проницаемости мембраны выражаются в значениях оптической плотности в условных единицах (а.е.), измеренных на длине волны 600 нм. Каждая точка данных представляет собой среднее значение тройных показаний. Полосы погрешностей указывают на SD тройных показаний. Статистическая значимость различий в значениях оптической плотности среди образцов липосом была оценена с помощью ANOVA, при этом все p-значения оказались значительно ниже 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Прогнозируемые энергии аффинного связывания для потенциальных молекулярных комплексов HDP-2P с PI. Молекулярное моделирование было использовано для прогнозирования типов связей и аффинностей к сайту связывания, а также заряженных и полярных фрагментов как головной группы фосфатидилинозитола, так и аминокислотных остатков HDP2P, которые участвуют в их межмолекулярных взаимодействиях. Заряженная и полярная группы фосфатидилинозитола выделены на рисунке 1. Обратите внимание, что Pb в NHpbδ+ обозначает пептидную связь. Сокращения: PI = фосфатидилинозитол; HDP-2P = основная субъединица фосфолипазы яда гадюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Прогнозируемые энергии аффинного связывания для потенциальных молекулярных комплексов HDP-2P с PI-4-P. Молекулярное моделирование было использовано для прогнозирования типов связей и аффинностей к сайту связывания, а также заряженных и полярных фрагментов как головной группы фосфатидил-инозитол-4-фосфата (PI-4-P), так и аминокислотных остатков HDP2P, которые участвуют в их межмолекулярных взаимодействиях. Обратите внимание, что Pb в NHpbδ+ обозначает пептидную связь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Рабочий процесс молекулярного докинга. Обзор процедуры молекулярного докинга с использованием AutoDock, включая конструирование лигандов, подготовку рецепторов, настройку сетчатого бокса и выполнение моделирования докинга для прогнозирования взаимодействий PI-HDP-2P. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом исследовании мы изучали, могут ли фосфатные группы, ковалентно связанные с инозитоловым кольцом в фосфатидилинозитоле (ПИ), предотвращать деградацию фосфолипидных мембран ферментом фосфолипазойА2 (PLA2). Чтобы оценить прогрессирование деградации фосфолипидной мембраны, вызванной гидролитической активностью PLA2, мы разработали простой, но высокочувствительный и точный метод измерения изменений проницаемости мембраны, которая должна увеличиваться по мере прогрессирования структурной деградации.

Метод основан на реакции замещения лиганда с участием комплекса гексааквамеди(II) [Cu(H2O)6]2+, взвешенного в водной среде вне фосфолипидных липосом, в то время как аммиак (NH3) инкапсулируется внутри липосом. Аммиак имеет более высокое сродство к Cu2+ , чем молекулы воды, но NH3 должен проникать через липосомальную мембрану для доступа к внешней водной фазе, где он замещает молекулы H2O в [Cu(H2O)6]2+. Если структурная целостность липосомальной мембраны нарушена из-за гидролиза фосфолипидов, катализируемого PLA2, повышенная проницаемость мембраны до NH3 будет способствовать замещению лиганда, что приведет к изменению цвета с бледно-голубого [Cu(H2O)6]2+ на темно-синий [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. Мы провели количественный мониторинг этого преобразования, используя спектрофотометрию для регистрации изменения оптической плотности на длине волны 600 нм.

Ранее мы использовали 1H-ЯМР с парамагнитным ионом ферроцианидом, [Fe(CN)6]3-, для изучения изменений проницаемости мембраны, на которые влияют HDP-2P24 и кардиотоксины яда кобры 24,25,26,27,28,39. Мы также использовали ряд флуоресцентных и фосфоресцирующих зондов для изучения влияния кардиотоксинов яда кобры на проницаемость липосомальных мембран 20,23,40. Тем не менее, ферроцианиды и флуоресцентные/фосфоресцирующие зонды являются крупными нефизиологическими молекулярными образованиями, которые проникают через липидные мембраны при значительном повреждении целостности мембраны. В отличие от этого, в нашем новом анализе замещения лиганда используется NH₃ – небольшой естественный клеточный метаболит, способный проникать через липидные мембраны при тонких возмущениях, связанных с упаковкой липидов. Эта повышенная чувствительность нашего нового метода мембранной проницаемости подтверждается его способностью обнаруживать изменения мембранной проницаемости при соотношении HDP-2P/липидные моляры 0,001 по сравнению с 0,004, требуемым для обнаружения ¹H-ЯМР/ферроцианид23.

В том же исследовании мы использовали гашение эритрозина фосфоресценцией ферроценом для изучения влияния HDP-2P на межмембранный липидный обмен, оцениваемого по изменению отношения времени жизни эритрозина в испытуемых образцах (τn) к таковому в контрольном образце (τ0)23. При соотношении HDP-2P/липидные моляры 0,004 значение τn/τ0 уменьшилось до 0,423, что указывает на состояние текучести мембраны, проницаемой для двухвалентных катионов24. Таким образом, наш анализ замещения лиганда на основе NH₃ обнаруживает проницаемость мембраны при соотношении HDP-2P/липидные моляры 0,001, в то время как обычные анализы (1H-ЯМР/ферроцианид и гашение фосфоресцентного зонда) обнаруживают проницаемость мембраны только при молярном соотношении 0,004. Это свидетельствует о том, что наш анализ на основе NH3 в четыре раза более чувствителен, чем обычные анализы.

Исключительная чувствительность нашего анализа на основе NH3 позволила получить данные о проницаемости, которые тесно коррелировали с измерениями гидролитической активности, с одним очевидным несоответствием: липосомы PC+PI-4-P показали незначительный гидролиз без изменений проницаемости, что позволяет предположить, что минимальная локальная продукция лизофосфолипидов/жирных кислот не влияет на глобальную упаковку липидов, которая не влияет на структурную целостность и проницаемость мембраны. Таким образом, данное исследование показало, что реакция замещения лиганда в сложной ионной системе с участием лиганда, инкапсулированного во внутреннем объеме липосом, дает результаты, которые отлично согласуются с данными о гидролитической активности HDP-2P. Эти результаты, в свою очередь, сильно согласуются с исследованиями in silico по связыванию PI и фосфоинозитидов с молекулярной поверхностью HDP-2P.

В целом, моделирование AutoDock в настоящем исследовании показало, что PI связывается с активным центром в четырех из девяти идентифицированных сайтов связывания, в то время как PI-4-P связывается с активным центром только в одном из девяти предсказанных сайтов. Гидролитическая активность HDP-2P в липосомах PC+PI-4-P была примерно в 5 раз ниже, чем в липосомах PC+PI. Кроме того, исследования in silico не предсказывали связывания PI-4,5-P2 с активным центром HDP-2P. Последовательно, анализы активности PLA2 и эксперименты по реакции замещения лиганда показали, что PI-4,5-P2 полностью ингибирует как гидролиз фосфолипидов, так и увеличение проницаемости мембраны, в то время как PI-4-P проявляет меньшую, незначительную гидролитическую активность и полностью предотвращает изменения проницаемости мембраны. Эти наблюдения хорошо согласуются с исследованиями in vitro активности цитозольных, кальций-независимых и секретируемых ферментов PLA2 человека по отношению к PI, PI-4-P и PI-4,5-P235. Эти исследования показали, что только цитозольный PLA2 группы IVA проявлял относительно высокую каталитическую активность по отношению к PI и PI-4-P, в то время как его активность по отношению к PI-4,5-P2 была едва заметной. Все остальные исследованные ферменты PLA2 не показали активности по отношению к PI-4,5-P235. Это отсутствие активности было связано с высокогидрофильными фосфатными группами на инозитоловом кольце, которые препятствуют продуктивному взаимодействию между поверхностью мембраны и ферментами PLA2 35. Мы предполагаем, что распространение фосфатных групп на инозитоловом кольце наружу в раствор и их способность образовывать ионно-полярные и водородные связи с остатками бороздчатой полости HDP-2P, вероятно, не позволяет HDP-2P приближаться к поверхности мембраны достаточно близко, чтобы проявлять свою гидролитическую активность, тем самым стабилизируя мембрану и уменьшая деградацию фосфолипидных мембран под действием HDP-2P, которая может быть вредной для клеток, активируя пути гибели клеток. Этот механизм, по-видимому, согласуется с потенциальной защитной ролью фосфоинозитидов при заболеваниях, связанных с аберрантной активностью фермента.

Сильная корреляция между результатами, полученными при анализе проницаемости мембраны, измерениях гидролитической активности и исследованиях молекулярного докинга in silico , подчеркивает надежность метода реакции замещения лиганда. Этот подход, использующий лиганд, инкапсулированный в липосомы, оказался точным и эффективным инструментом для оценки изменений проницаемости мембраны, вызванных структурными возмущениями в организации стабильных бислоев фосфолипидов. Хотя мы признаем, что исследования молекулярного докинга с использованием AutoDock, представленные в этой статье, не дают полного понимания того, как фосфолипиды могут взаимодействовать с HDP-2P в динамическом и продольном режиме, в будущем необходимо провести исследования молекулярной динамики для выявления дополнительных молекулярных механизмов того, как HDP-2 может проникать в фосфолипидные бислои, состоящие из различных фосфолипидов. Важно отметить, что проведение исследований молекулярной динамики требует больших вычислительных ресурсов, таких как высокопроизводительные компьютеры и кластеры, которые недоступны во многих академических учреждениях с ограниченными ресурсами и финансированием исследований. Наконец, мы признаем использование жесткого рецептора (HDP-2P) в настоящей методике и отсутствие растворителя/мембранной среды. Тем не менее, мы хотим подчеркнуть, что выполнение молекулярных докингов HDP-2P с различными фосфолипидами с использованием жесткого рецептора является традиционным подходом к проведению первоначальных исследований докинга для идентификации первого прохода докинговых структур-кандидатов, которые могут быть продолжены в будущем с помощью гибкого рецептора, как только будут идентифицированы критические аминокислотные остатки на каталитической стороне, которые связываются с субстратами, чтобы сосредоточиться на молекулярных областях, которые могут быть сделаны гибкими в Следите за исследованиями молекулярного докинга и в сольватированной среде. Следовательно, использование сотрудничества с другими учреждениями, которые имеют больше ресурсов, может помочь подтвердить некоторые из первоначальных выводов, предоставленных AutoDock, и выявить дополнительные молекулярные механизмы взаимодействия субстрата и фермента.

В заключение следует отметить, что результаты данного исследования демонстрируют, что метод реакции замещения лиганда с использованием лиганда, инкапсулированного в липосомы, может быть эффективно применен для изучения проницаемости мембран в различных мембраноопосредованных процессах. К ним относятся, в частности, лиганд-рецепторные взаимодействия, липидно-белковые взаимодействия, межмембранный обмен, слияние и деление мембран, нервно-мышечные сокращения и другие. Кроме того, этот подход обладает значительным потенциалом для исследования мембранотропных фармацевтических препаратов. В то же время мы признаем, что, хотя новые методы в модельных мембранах бесценны для анализа конкретных механизмов мембранных взаимодействий, присущие им упрощения ограничивают их способность полностью воспроизводить структурную, композиционную и функциональную сложность биологических мембран in vivo. Поэтому важно с осторожностью интерпретировать данные модельных систем и по возможности проверять результаты с использованием клеточных или организменных моделей.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Исследования, представленные в этой статье, были поддержаны грантом на запуск от Пекинской академии Чаоян КайВэнь (E.S.G.) и премией SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). Работы по подготовке ПНД-2 выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда No 24-15-00280 (Ю.Н.У.). Авторы выражают признательность доктору Марьям Баранчешмех за написание сценария и разработку видео о применении молекулярного докингового моделирования, которое было подготовлено после публикации этой исследовательской статьи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Базовая субъединица HDP-2P яда гадюки V. nikolskii PLA2, HDP-2, чистота 98,5%  Институт биоорганической химии, МоскваHDP-2 выделен по потоколю в PMID:18083205. HDP-2P, очищенный из HDP-2 с помощью DEAE Sephadex A-50   
Кардиолипин (сердце, бычий рогатый скот) (соль натрия), >99%МаклинC916138
Коэнзим А, FUJIFILM Wako' s комплект NEFA Лексингтон, Массачусетс, США
Отсечение молекулярной массы мембраны для мембраны диализа 1,0 кДаSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Шанхай, Китай  
Термостат с цифровым управлением водяным баком;YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Пекин, Китай  
Электронный высокоточный аналитический вес FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., Китай
JingHua 752 УФ-видимый спектрофотометр Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Шанхай, Китай
L-α-фосфатидилхолин (яйцо, курица),≥ 95%МаклинL799415
L-α-фосфатидилинозитол (печень, бычий скот) (соль натрия) и т.д.; 99%МаклинL780292
L-α-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (мозг, свинина) (аммонийная соль),≥ 99%МаклинL996223
L-α-фосфатидилинозитол-4-фосфат (мозг, свинина) (аммонийная соль), 99%МаклинL970250
L-α-фосфатидилсерин (мозг, свинина) (соль натрия), >99%МаклинL864755
Магнитный мешалка JB-3 Shanghai Leici JB-3
pH-метр PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., Китай
Микроцентрифуга TGL-16B Shanghai 3 Anting Co., Шанхай, Китай
Ультразвуковой диспенсер Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd., Китай
Вакуумный насос TW-1MTingwei Co. Ltd., Вэньлин, Китай

Ссылки

  1. De Matteis, A., De Camilli, P. Phosphoinositides. Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).
  2. Hokin, M. R., Hokin, L. E. Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices. J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).
  3. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices. Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).
  4. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices. J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).
  5. Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease. J Biol Chem. 300, 105757(2024).
  6. Powis, G., et al. Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease. Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).
  7. Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).
  8. Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights. FEBS J. 287, 222-238 (2020).
  9. Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling. Life Sci. 301, 120596(2022).
  10. Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. Cracking the context-specific PI3K signaling code. Sci Signal. 13, eaay2940(2020).
  11. Wills, R. C., Hammond, G. R. V. PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane. Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).
  12. Epand, R. M. Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction. J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).
  13. De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways. Int J Mol Sci. 18, E634(2017).
  14. Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).
  15. Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. Phospholipases in Physiology and Pathology. 2, Academic Press. 139-158 (2023).
  16. André, S., et al. Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).
  17. Trotter, A., et al. The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).
  18. Schaloske, R. E., Dennis, E. A. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).
  19. Petrovic, U., et al. Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell. Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).
  20. Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance. J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).
  21. Harris, J. B., Scott-Davey, T. Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry. Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).
  22. Ramazanova, A. S., et al. Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).
  23. Chaudary, A. S., et al. Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance. J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).
  24. Li, M., Gasanoff, S. E. Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study. J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).
  25. Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure. Toxins. 16, 287(2024).
  26. Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane. Toxins. 12 (7), 425(2020).
  27. Zhang, B., et al. Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function. Toxins. 11, 152(2019).
  28. Gasanov, S. E., et al. Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins. PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).
  29. Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes. Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).
  30. Weast, R. C. CRC Handbook of Chemistry and Physics. , 62nd ed, CRC Press. (1982).
  31. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).
  32. Ford, M. G., et al. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).
  33. Khan, S. A., Ilies, M. A. The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles. Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).
  34. De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation. Toxins. 16 (2), 71(2024).
  35. Hayashi, D., Dennis, E. A. Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).
  36. Alekseeva, A. S., et al. Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon. 133, 169-179 (2017).
  37. Burke, J. E., Dennis, E. A. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).
  38. Dennis, E. A., et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  39. Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).
  40. Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ проницаемости мембраны липосомы для изучения влияния фосфатидилинозитолфосфатных групп на мембранотропное действие яда PLA2
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.