Потенциальная роль сигнальной оси PGE 2-EP4-Ca2+ при посттравматическом остеоартрозе

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол для систематического изложения методов создания и оценки моделей остеоартрита крыс путем сравнения, предоставляя научные доказательства различий в патогенезе между острым механическим повреждением и хроническим остеоартритом, вызванным метаболическими факторами окружающей среды. Основное внимание уделяется модели ACLT, в которой особое внимание уделяется изменениям в сигнальном пути EP4-Ca²⁺-митохондриальной дисфункции.

Аннотация

Посттравматический остеоартроз (ПТОА) — это дегенеративное заболевание суставов, вызванное травмой или интенсивным механическим напряжением, приводящее к дегенерации суставного хряща и функциональным нарушениям. Простагландин Е2 (PGE₂) вносит значительный вклад в деградацию хряща после механической травмы, активируя свой рецептор, рецептор простагландина Е 4 (EP4), на мембранах хондроцитов. Гомеостаз суставного хряща в первую очередь зависит от динамического баланса между деградацией и восстановлением хряща, процессом, тонко регулируемым хондроцитами. Было показано, что сигнальный путь Ca²⁺/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CAMKII) играет решающую роль в опосредовании восстановления функции хондроцитов. В этом исследовании мы наблюдали повышенную экспрессию EP4, рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R) и фосфорилированного CaMKII в интерлейкин-1 бета (IL-1β) хондроцитах, что позволяет предположить возможную связь между передачей сигналов EP4 и нарушением регуляции кальция. Тем не менее, прямые доказательства, подтверждающие участие оси EP4-Ca²⁺/CaMKII в PTOA, до сих пор отсутствуют. Необходимы дальнейшие исследования с использованием генетических или фармакологических вмешательств, чтобы прояснить этот потенциальный механизм. Эти результаты обеспечивают предварительную основу для изучения гомеостаза кальция и передачи сигналов EP4 в качестве мишеней для лечения PTOA.

Введение

Несмотря на то, что физическая активность широко пропагандируется из-за ее пользы для здоровья, она остается основной причиной травм опорно-двигательного аппарата нижних конечностей, которые могут привести к различным неблагоприятным исходам¹. Среди них PTOA становится все более тяжелым бременем для подростков и молодых людей, которые получают травмы суставов в возрасте² лет. Вызывает тревогу тот факт, что примерно у 48-52% людей, получивших спортивные травмы суставов, развивается ПТОА в возрасте 11-17 ^лет3,4. Коленный сустав, один из наиболее часто травмируемых суставов в молодежных спортивных и развлекательных мероприятиях, особенно уязвим при прогрессировании от травмы сустава до PTOA. В проспективном исследовании сообщалось, что у людей с травмами коленного сустава риск развития рентгенологически подтвержденного остеоартрита коленного сустава через 12-20 лет после травмы в 10 раз^{выше, чем} у людей без травмы. Более того, рентгенологические исследования показали, что у молодых людей риск развития PTOA в течение 12 лет составляет 51%, в то время как у футболистов мужского пола риск развития PTOA составляет 41% в течение 14 лет^. Эти результаты подчеркивают долгосрочное негативное влияние травм суставов, связанных со спортом, на здоровье опорно-двигательного аппарата. Таким образом, понимание необратимых патологических механизмов, лежащих в основе развития PTOA, имеет решающее значение для определения соответствующих стратегий вмешательства, направленных на смягчение прогрессирования заболевания.

Ранняя дисрегуляция гомеостаза Ca²⁺ является одним из ключевых показателей инициации PTOA⁶. Ca²⁺ связывается с кальмодулином (CaM) с образованием комплекса Ca²⁺/CaM, который может взаимодействовать с CaMKII, ослабляя его аутоингибиторную конформацию и регулируя активность киназы⁷. Как при человеческом, так и при мышином ОА экспрессия фосфорилированного CaMKII (активированная форма CaMKII) повышена, в то время как использование ингибиторов CaMKII блокирует это повышение уровня фосфорилирования, что приводит^{к разрушению} суставного хряща8, демонстрируя важную регуляторную роль Ca²⁺/CaMKII в опосредовании гомеостаза хряща ОА. Как правило, на эти изменения в решающей степени влияет активация воспалительных механизмов в развитии PTOA. Высокие уровни PGE₂, как ключевого провоспалительного медиатора боли, влияют на прогрессирование ОА, активируя рецептор EP4. В частности, условный нокаут EP4 в суставном хряще усиливает образование хряща и анаболический метаболизм, одновременно подавляя гипертрофию хондроцитов и катаболизм, тем самым способствуя регенерации стабильного, зрелого суставного хряща вместо фиброзного хряща и облегчая боль в суставах⁹. Учитывая решающую роль сигнального пути Ca²⁺/CaMKII в физиологии хондроцитов и признанное участие рецептора EP4 в прогрессировании остеоартрита, данное исследование было направлено на изучение того, связана ли активация EP4 с изменениями в передаче сигналов кальция и митохондриальной дисфункции во время развития PTOA. Несмотря на то, что причинно-следственная связь между EP4 и дисрегуляцией Ca²⁺ еще предстоит определить, имеющиеся здесь данные свидетельствуют о возможной механистической связи, которая требует дальнейшего изучения.

Это исследование сосредоточено на потенциальных механизмах, связывающих активацию рецептора EP4 с передачей сигналов Ca²⁺ и митохондриальной дисфункцией во время развития PTOA. По сравнению с традиционными методами диагностики, такими как методы визуализации, которые обнаруживают прогрессирование PTOA, и современными терапевтическими подходами, такими как нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) для облегчения симптомов, наш подход направлен на выявление ранних внутриклеточных сигнальных нарушений в патогенезе PTOA. Это механистическое понимание обеспечивает более точное понимание начала и прогрессирования заболевания, предлагая новые возможности для ранней диагностики и целенаправленных вмешательств. Таким образом, в этом исследовании была создана модель крысы PTOA, индуцированная передним пересечением крестообразной связки (АКПП), чтобы имитировать механические травмы, обычно наблюдаемые у спортсменов с нарушениями двигательного контроля во время острой или хронической физической активности. Эта модель служит оптимальным представлением посттравматического механического повреждения суставов, предлагая воспроизводимую платформу для исследования как гистопатологических изменений, так и лежащих в их основе молекулярных механизмов. Диета с высоким содержанием жиров и воздействие влажной окружающей среды (FD) служит положительным контролем, направленным на моделирование метаболических и экологических факторов риска, связанных с хроническим остеоартритом. Первый моделирует острую травму, вызванную механической травмой, в то время как второй представляет собой естественную модель заболевания, вызванного нарушением обмена веществ и факторами окружающей среды, хотя окончательный патогенез в этой группе может не соответствовать митохондриальной оси EP4-Ca².

Протокол

Все экспериментальные процедуры с участием животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Больницы китайской медицины провинции Гуандун (номер этического одобрения: 2024014-2). Исследование проводилось в соответствии с правилами этичного использования лабораторных животных, установленными Государственным советом Китайской Народной Республики.

1. Животные

1. Используйте беспородных крыс с SPF Sprague-Dawley (SD) для уменьшения потенциальных искажающих эффектов, связанных с эстральным циклом. Для этого эксперимента выберите в общей сложности девять самцов крыс SD в возрасте 4 недель и весом от 90 г до 100 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти крысы были получены от лицензированного поставщика лабораторных животных в Китае (номер сертификата: 20240410Aazz0619000774).
2. Поддерживайте всех животных в определенной среде, свободной от патогенов (SPF). Поддерживайте контролируемую среду при температуре 24 ± 2 °C со средней влажностью 60 ± 1% и 12-часовым циклом света/темноты.
3. Обеспечьте крысам свободный доступ к подкисленной воде и стандартному рациону грызунов.

2. Конструирование животных моделей и вмешательство

1. Акклиматизируйте крыс в течение 2-недельного периода в центре кормления. Случайным образом разделите крыс на три группы в возрасте 6 недель: контрольную группу, группу PTOA и группу FD, по три крысы в каждой группе.
2. Поддерживайте контрольную группу в стандартных условиях.
3. Обезболить группу ПТОА изофлураном (4% для индукции и 1%-2% для поддерживающей терапии).
4. Хирургическое обнажение двусторонних коленных суставов через продольный разрез кожи с использованием медиального парапателлярного доступа.
5. Выполните ACLT с помощью скальпеля и подтвердите полное пересечение, выполнив положительный тест переднего ящика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Двусторонняя пересечение передней крестообразной связки было выполнено для обеспечения согласованности модели и снижения индивидуальной вариабельности. Данные с обоих коленей были усреднены для получения одного значения на животное для анализа.
6. Периодически переводите крыс из групп FD в камеру с климат-контролем, расположенную в том же помещении. Подвергните этих крыс диете с высоким содержанием жиров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диета с высоким содержанием жиров содержала 20% сахарозы, 15% сала, 1,2% холестерина, 0,2% холата натрия, 10% казеина, 0,6% гидрофосфата кальция, 0,4% известнякового порошка, 0,4% премикса и 52,2% основного корма. Профиль питательных веществ контрольного корма был следующим: 19% белка, 31% жира и 50% углеводов, при калорийном соотношении 17% белка, 37% жира и 46% углеводов.
7. Поддерживайте условия окружающей среды в климатической камере при температуре 24 ± 2 °C, уровне влажности 90 ± 4% и 12-часовом суточном световом цикле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с повышенным риском роста бактерий в условиях такой высокой температуры и влажности, стерилизуйте питьевую воду и продукты питания и пополняйте их ежедневно, чтобы свести к минимуму загрязнение. Общая продолжительность экспериментального вмешательства составила 12 недель.

3. Анализ походки (следы)

1. Проведите анализ следа на модельных крысах через 12 недель после начала лечения, используя метод, описанный ранее¹⁰.
2. Обмазать брюшные поверхности задних лап крыс красными чернилами, и им разрешалось ходить по тропинке длиной 100 см и шириной 8 см, которая была покрыта белой бумагой.
3. Чтобы побудить крыс двигаться, поместите темную камеру в конце дорожки, чтобы стимулировать движение вперед.
4. Проведите три последовательных измерения, чтобы получить средние значения по каждому параметру, включая длину шага и длину шага, которые использовались для оценки неравномерности.
5. Определите длину шага (см), измерив расстояние, пройденное одной и той же задней лапой между двумя последовательными шагами.
6. Определите длину шага (см) как горизонтальное расстояние между левой и правой задними лапами.
7. Измерьте угол лапы (°) как угол между вторым пальцем ноги и пяточной костью относительно горизонтальной линии¹¹.
8. Измеряйте длину шага, длину шага и угол наклона лапы непосредственно на отсканированных изображениях отпечатков ног с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus (версия 6.0) с использованием встроенных инструментов измерения расстояния и угла.
   Эти параметры походки имеют решающее значение для выявления незначительных функциональных нарушений на ранних стадиях остеоартрита. Пациенты могут демонстрировать уменьшенную длину шага и шага для защиты болезненных суставов, в то время как увеличенный угол носка и асимметрия походки часто возникают в качестве компенсаторных реакций на нестабильность суставов, вызванную болью.

4. Измерение диаметра соединения

1. Измерьте диаметр шва с помощью калиброванного спирального микрометра (мм) после моделирования в каждой группе.
   Примечание: По мере прогрессирования остеоартрита у пациентов обычно наблюдается отек суставов и боль. Более высокая степень отечности может свидетельствовать о более тяжелой стадии заболевания.

5. Измерение прочности хвата

1. Измерьте силу хвата задних конечностей с помощью цифрового измерителя силы хвата, оснащенного тракционной сеткой, измерителя прочности, оснащенного тяговой сеткой (90 мм × 90 мм).
   1. Аккуратно держите крысу за хвост и кожу на задней части шеи.
   2. Опустите животное до тех пор, пока его задние конечности крепко не схватятся за сетку, затем неуклонно тяните животное горизонтально вдоль оси датчика силы, пока оно не ослабит хватку.
   3. Повторите тест три раза для каждого животного. Запишите наибольшее значение в качестве максимальной силы хвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время проверки прочности захвата задних конечностей обездвижьте передние конечности, прикрепив их скотчем к картонной поверхности, чтобы предотвратить случайное зацепление передних конечностей с тракционной решеткой. Снижение силы хвата свидетельствует о снижении мышечной функции и потенциальном двигательном дефиците, связанном с болью, связанном с прогрессированием остеоартрита.

6. Выделение и бактериологическое исследование первичных хондроцитов

1. Выделите первичные хондроциты от 6-недельных самцов крыс Sprague-Dawley.
2. Рассеките головки бедренной кости и плато большеберцовой кости, чтобы собрать примерно 100-150 мг хрящевой ткани.
3. Дважды промойте ткань PBS, содержащим 1% пенициллин-стрептомицина.
4. Расщеплять хрящ в 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при 3 °C в течение 30 минут.
5. Разрежьте хрящ на^{1-2 мм на 3} части и далее расщепите в 10 мл 0,2% коллагеназы II при 37 °С в течение 4 ч на шейкере постоянной температуры.
6. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 мкм, центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Ресуспендировать клеточную гранулу в среде DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
8. Инкубируйте клетки при температуре 3 °C во влажной атмосфере с 5%_CO2.

7. Клеточная обработка

1. Подсчитайте выделенные хондроциты с помощью гемоцитометра.
2. Семена хондроцитов в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 10⁵ клеток в лунку в 0,1 мл полной питательной среды (DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина).
3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием CO₂ в течение 24 часов, чтобы обеспечить адгезию.
4. Чтобы установить in vitro модель воспалительного PTOA, обрабатывайте адгезивные хондроциты IL-1β (10 нг/мл) в течение 48 ч после того, как слияние клеток достигнет примерно 80%.
5. Для положительного контроля FD растворите пальмитиновую кислоту (PA, CAS No. 57-11-4) в хлороформе в соотношении 1:1000 для получения исходного раствора в концентрации 500 мкм.
   1. Когда слияние клеток достигнет приблизительно 80%, добавьте 1 мкл стокового раствора PA на 1 мл питательной среды, чтобы достичь конечной концентрации PA 500 нМ. Обрабатывайте хондроциты этим раствором в течение 48 ч.
6. Добавьте 1 мкл хлороформа (контроль транспортного средства) на 1 мл питательной среды для контроля клеток без ПА.

8. Забор образцов, декальцификация и подготовка к заделке

1. Усыпить животных через 12 недель после вмешательства путем ингаляции передозировки изофлурана (≥5%) в герметичной камере в течение не менее 5 мин и подтвердить полное прекращение дыхания и сердцебиения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был одобрен Комитетом по этике животных и соответствует национальным рекомендациям по гуманной эвтаназии лабораторных животных.
2. Соберите оба коленных сустава у трех крыс в группе (n = 3, всего = 6 колен) для гистологической оценки.
3. Фиксируйте образцы в 4% параформальдегиде (PFA) при соотношении ткани к фиксирующему объему более 1:20 в течение более 48 часов на вибростенде при °C.
4. Промойте салфетки под проточной водой в течение 1-2 ч для удаления остатков фиксатора.
5. Декальцинируйте ткани в 0,5 М растворе ЭДТА (pH 7,4, ~15%) при соотношении ткани к раствору 1:20 в течение 21 дня при 3 °C и заменяйте свежим раствором каждые 3 дня.
6. Оцените завершение декальцинации, прощупывая кость иглой для размягчения.
7. Очищенные от кальцина салфетки промыть под проточной водой из-под крана в течение 2 ч и поместить в закладные кассеты.
8. Обезвоживайте образцы с помощью сортированного этанола: 75% этанола в течение 2 ч (или в течение ночи), 80% этанола в течение 2 ч, 95% этанола в течение 0,5 ч и абсолютного этанола два раза в течение 60 мин. Затем погрузить в соотношении ксилол:этанол 1:1 на 20 минут.
9. Очистить салфетки в ксилоле дважды (10 мин и 60 мин).
10. Инфильтрировать ткани парафином в следующем порядке: ксилол:парафин (1:1) в течение 15 мин, мягкий парафин при 52-5 °С в течение 1 ч (дважды), затем твердый парафин при 56-5 °С в течение 30 мин.
11. Заложите салфетки с помощью системы заделки парафина (например, Leica, при температуре 6 °C) и перенесите блоки на холодную пластину при температуре -2 °C на 2 часа.
12. Сечение парафина сагиттально на толщине μм с помощью микротома.
13. Поместите ленты в водяную баню при температуре 4 °C и закрепите на чистых стеклянных предметных стеклах.
14. Смонтированные секции высушите на воздухе и запекайте их в духовке при температуре 60 °C в течение 2 часов, чтобы удалить остатки парафина.
15. Депарафинизируйте срезы путем последовательного погружения в ксилол (10 мин), свежий ксилол (10 мин), абсолютный этанол (5 мин), свежий абсолютный этанол (5 мин), 90% этанол (5 мин) и 75% этанол (5 мин), затем промойте водопроводной водой перед окрашиванием.

9. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)

1. Погруженные депарафинизированные и регидратированные срезы тканей погружали в 0,5% раствор окрашивания гематоксилина на 3-5 мин при комнатной температуре (RT; ~2 °C) с последующим тщательным промыванием под проточной водопроводной водой.
2. Кратковременно обработайте срезы раствором для дифференцировки гематоксилина в течение 2-5 с, и промойте под проточной водой из-под крана.
3. Воронение выполняют путем погружения срезов в раствор воронения гематоксилина на 2-5 с с последующим промывкой.
4. Срезы обезвоживают в 85% и 95% этаноле в течение 5 мин каждая, затем окрашивают в 0,05% эозин Y (спиртовой) в течение 5 мин.
5. Дважды обезвожьте в абсолютном этаноле (по 5 мин каждый), затем очистите в ксилоле (5 мин), а затем добавьте свежий ксилол (5 мин).
6. Закрепите секции нейтральным бальзамом и накройте покровным стеклом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В хорошо сохранившихся хрящах гематоксилин окрашивает ядра в синий цвет, а эозин окрашивает матрикс в розовый цвет. Поврежденный хрящ характеризуется потерей хондроцитов, фибрилляцией и дезорганизованным матриксом.

10. Safranin O - быстрое зеленое (SOFG) окрашивание

1. Срезы окрашивать 2% раствором Fast Green в течение 1-5 минут в RT. Промыть под проточной водой из-под крана до тех пор, пока хрящи не станут бесцветными.
2. Кратко дифференцируйте срезы в 1% соляной кислоте в течение 10-15 с, затем тщательно промойте проточной водой.
3. Срезы окрашивать 0,2% раствором сафранина О в течение 5-10 с, затем быстро обезвоживать путем четырех смен абсолютного этанола (по 3-5 с каждая).
4. Очистите срезы в ксилоле (5 минут), затем добавьте свежий ксилол (5 минут).
5. Установите горки с нейтральным бальзамом и накройте защитным стеклоподъемником.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Safranin O окрашивает хрящи протеогликанами в красный цвет, в то время как Fast Green окрашивает кости/фиброзные ткани в зеленый цвет. Потеря красного цвета указывает на истощение и дегенерацию протеогликанов.
6. Оцените гистологические изменения с помощью системы оценки Международного общества исследования остеоартрита (OARSI). Измерьте ширину суставного пространства и толщину хряща для оценки структурной дегенерации. Захватывайте изображения под световым микроскопом (например, ECLIPSE Ti2-E) с частотой 4× (масштабная линейка = 50 μм) и 20-кратная (масштабная линейка = 10 μм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте программное обеспечение системы для обработки изображений для захвата изображений и ImageJ (v1.48v) для анализа. Калибровка изображений с помощью функции «Анализ» > «Установка масштаба » с помощью микрометра. Для каждого сустава количественно оцените пять случайных полей из трех сагиттальных сечений, используя слепой анализ, проведенный тремя независимыми наблюдателями.

11. Микро-μ КТ

1. Препарировать коленные суставы крыс через 12 недель после вмешательства и немедленно зафиксировать их в 4% параформальдегиде в ЛТ в течение 24 ч для сохранения морфологии тканей.
2. Промойте зафиксированные образцы PBS и храните их в 70% этаноле до сканирования.
3. Перед сканированием установите каждый образец коленного сустава на специальный держатель для образцов. Выровняйте соединение по его длинной оси, чтобы свести к минимуму артефакты движения.
4. Выполнять микро-μКТ сканирование с помощью системы микро-μКТ со следующими параметрами сканирования: рентгеновское напряжение 70 кВ, ток 100 мкА и мощность 7 Вт.
5. Получите четыре кадра на проекцию и сложите их для улучшения качества изображения с шагом вращения 0,72°, завершив полный поворот на 360°.
6. Установите результирующий размер воксела (толщину среза) на 15 мкм, чтобы получить изображения с высоким разрешением, подходящие для анализа трабекулярной кости.
7. Определите область интереса (ROI) между проксимальной пластинкой роста большеберцовой кости и плато большеберцовой кости, уделяя особое внимание субхондральной кости бедренной и большеберцовой костей.
8. Реконструируйте необработанные данные сканирования в изображения поперечного сечения с помощью программного обеспечения для восстановления.
9. Импортируйте восстановленные стеки изображений в соответствующее программное обеспечение для количественного морфометрического анализа.
10. Оцените ключевые параметры, включая объемную фракцию костной ткани (BV/TV, %), минеральную плотность костной ткани (МПК, г/см³) и трабекулярное разделение (Tb.Sp, мм).
11. Для качественной и трехмерной визуализации используйте программное обеспечение для 3D-визуализации для создания объемных рендеров микроархитектуры костей.
12. Проведите визуальную оценку для подтверждения структурной целостности и морфологических изменений, наблюдаемых в количественных данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся обработка и анализ изображений проводились слепыми операторами для обеспечения объективных результатов.

12. Элиза

1. Обезболивайте крыс через 12 недель после вмешательства. Тщательно обнажите и рассеките брюшную аорту, чтобы собрать образцы крови.
2. Дайте собранной крови свернуться при RT в течение 30 минут, а затем центрифугируйте при 755 × g (эквивалентно 3000 об/мин, используя центрифугу с радиусом ротора 7,5 см) при °C в течение 15 минут.
3. Отделите и храните сыворотку для последующего измерения уровня PGE₂ с помощью имеющегося в продаже набора для ИФА.
4. Параллельно засеивают первичные хондроциты и культивируют их в течение 24 ч с последующей обработкой IL-1β и PA в течение 48 ч, согласно установленному протоколу клеточной обработки. После вмешательства соберите и проанализируйте супернатанты культуры на концентрацию PGE₂ с помощью того же набора ИФА.

13. Количественная ОТ-ПЦР

1. Извлечь общую РНК из образцов клеток с помощью коммерческого реагента для экстракции РНК (TRIzol).
2. Синтезируйте кДНК с помощью набора для обратной транскрипции (с устройством для удаления гДНК) и храните полученную кДНК при температуре -8 °C для последующего анализа.
3. Проводят количественную ПЦР с помощью SYBR Green, а относительные уровни экспрессии рассчитывают по методу 2−ΔΔCt.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались следующие последовательности праймеров: β-актин вперед: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-актин обратный: CTGACCCATACCCACCATCAC; Нападающий EP4: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; ЕР4 форвард: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; ЦОГ-2 впереди: GATGACGAGCGACTGTTCCA; ЦОГ-2 реверс: TGGTAACCGCTCAGGTTG.

14. Анализ вестерн-блоттинга

1. Лизировать клетки с помощью буфера RIPA на льду в течение 30 минут.
2. Разделите образцы белка с помощью SDS-PAGE на 90 минут, затем перенесите их на нитроцеллюлозные мембраны на 2 часа.
3. Заблокируйте мембраны 5% BSA и промойте их фосфатно-буферным раствором.
4. Проводят иммуноблоттинг с использованием специфических антител.
   Антитела и их соответствующие разведения были следующими: анти-MMP9 (1:1000), анти-коллаген II (1:1000), анти-COX2 (1:1000), анти-CaMKII (1:1000), анти-p-CaMKII (1:1000), анти-IP3R (1:1000), анти-Cyt-C (1:1000) и анти-β-актин (1:2000).
5. После ночной инкубации первичными антителами промыть мембраны TBST и инкубировать в течение 1 ч вторичными антителами: мышиным HRP (1:2000) или кроликом-HRP (1:2000) в темноте.
6. После еще одной промывки TBST выполните обнаружение белка с помощью расширенного набора для хемилюминесценции.
7. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.48v).

15. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Культивируют хондроциты на покровных листах в 12-луночных планшетах до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции.
2. После обработки IL-1β и PA в течение 48 ч или без обработки в качестве контроля фиксируют клетки с 4% параформальдегидом в PBS на 15 мин при ЛТ.
3. Пермеабилизируйте клетки PBS, содержащим 0,2% Triton X-100, в течение 15 минут.
4. Промойте клетки три раза PBS (по 5 мин каждый), затем инкубируйте их с первичным антителом (анти-IP3R, разведение 1:200) в буфере для разведения антител при °C в течение ночи.
5. Подвергните клетки воздействию в соотношении 1:500 флуоресцеина изотиоцианата меченного козьим вторичным антителом IgG к кролику в течение 1 ч.
6. Закрасьте клетки раствором DAPI в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные изображения были получены с помощью объектива с 40-кратным увеличением (масштабная линейка = 2 мкм). Все изображения были обработаны с помощью программного обеспечения ZEN и количественно оценены с помощью ImageJ (версия 1.48v) в соответствии с последовательными процедурами калибровки.

16. Статистический анализ

1. Проводите статистический анализ с помощью GraphPad Prism (версия 8.0.2).
2. Прежде чем применять параметрические тесты, оцените данные по нормальному распределению с помощью теста Шапиро-Уилка и по однородности дисперсии с помощью тестов Брауна-Форсайта и Бартлетта.
3. Используйте однофакторный ANOVA, за которым следует апостериорный тест Тьюки для сравнения между несколькими группами, и примените двухсторонний непарный t-критерий Стьюдента для сравнения двух групп.
4. Рассматривайте P-значение меньше 0,05 как статистически значимое.
5. Представьте все данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD) по крайней мере из трех независимых экспериментов.

Результаты

ВФЛТ-индуцированный ПТОА демонстрирует преждевременное разрушение хряща и поведенческий дефицит по сравнению с ФД-индуцированной хронической КОА (Рисунок 2 и Рисунок 3)
Сужение суставного пространства и дегенерация хряща являются основными последствиями остеоартрита. Предыдущие исследования определили избыточный вес и факторы окружающей среды (например, влажный климат) как потенциальные факторы, способствующи...

Обсуждение

По сравнению с хроническим ОА, вызванным факторами окружающей среды и диеты, травма сустава, вызванная АКТТ, приводит к более быстрому прогрессированию заболевания. Наши результаты, основанные на поведенческих оценках, включая отек суставов, силу захвата задних конечностей и анализ походки, выявили значительные различия между контрольной группой, группой PTOA и положительной контрольной группой, вызванными факторами окружающей среды и диеты. После 12 недель вмешательства в группе PTOA на...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,2% коллагеназа II	Сигма-Олдрич, США	Номер CAS: 9001-12-1	Выделение и бактериологическое исследование первичных хондроцитов
0,2% Тритон Х-100	Beyotime, Китай	СТ795	Иммунофлюоресценция
0,25% трипсин-ЭДТА	Ухань Бостер Биконъюнктура Ко., Лтд.	АР1071	Декальцинация
0,25% Трипсин-ЭДТА	Gibco, США	25200072	Выделение и бактериологическое исследование первичных хондроцитов
4% раствор фиксатора параформальдегида	Биюньтянь, Китай	П0099-3Л	Фиксация тканей
Антитела против CaMKII	Хуабио, Китай	ЭТ1608-47	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела против коллагена II	Abcam, Великобритания	АБ34712	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела к ЦОГ2	Abcam, Великобритания	АБ179800	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела против Cyt-C	Селлек, Китай	Ф2534	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела к IP3R (B-2)	Санта-Круз, США	СК-377518	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела против MMP9	Abcam, Великобритания	АБ76003	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела против p-CaMKII	Селлек, Китай	Ф0342	Вестерн-блот (1:1000)
Антитела к анти-&бета;-актину	Технология клеточной сигнализации (CST), США	8Х10Д10	Вестерн-блот (1:2000)
Решение для блокировки BSA	Сигма Олдрич, США	Н/Д	5% BSA для блокировки вестерн-блоттинга
Центрифуга (5424 R)	Эппендорф, Германия	Н/Д	755 и раз; g Скорость центрифугирования
Хлороформ	Сигма Олдрич, США	Н/Д	Растворитель для ПА
Камера с климат-контролем (RXZ-158A)	Отечественный производитель, Китай	Н/Д	Модель влажной среды
Набор для цветной обратной транскрипции	Invitrogen, Сучжоу, Китай	Н/Д	Синтез кДНК
Программное обеспечение CTAn	Брукер	Версии 1.9 и 4.1	Для количественного морфометрического анализа
Программное обеспечение CTVol	Брукер	Версия 2.0	Для качественной и трехмерной визуализации
Решение для окрашивания DAPI	Beyotime, Китай	Н/Д	Ядерное окрашивание (5 & микро; г/мл)
Цифровой измеритель прочности хвата	Инструмент Puxin	Н/Д	Измерение силы захвата задних конечностей
DMEM/F12 Средний	Corning, США	Н/Д	Среда для культивирования клеток
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)	Аладдин	Н/Д	Декальцинация костных тканей
Набор ИФА для PGE2	Elabscience, Ухань, Китай	ПГЕ2Э-ЭЛ-0034	Обнаружение ИФА
Набор для усиленной хемилюминесценции	Миллипор, США	WBKLS0500	Обнаружение вестерн-блоттинга
Этанол	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Обезвоживание тканей
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Corning, США	Н/Д	10% концентрация для культуры
Козий антикроличий IgG с маркировкой FITC	Beyotime, Китай	Комплект P0179	Иммунофлюоресценция (1:500)
ГрафПад Призма	Программное обеспечение GraphPad, США	Версия 8.0.2	Анализ данных
Гематоксилин и эозин (H& д) Набор для окрашивания	Servicebio, Ухань	Г1005	Гистология
ИЛ-1&бета;	PeproTech, США	400-01В	10 нг/мл для модели ячейки PTOA
ИзображениеJ	NIH, США	Версия 1.48v	Анализ изображений
Программное обеспечение Image-Pro Plus	Медиа Кибернетика	Версия 6.0	Количественный анализ походки по отсканированным следам ног
Изофлуран	Шанхай Ядзи Бикал	YS1412C	Анестезия при хирургии животных
Встраиваемый центр Leica	Leica Microsystems	ЭГ1160	Заделка парафина
Микротом Leica	Leica Microsystems	РИНГ2235	Секционирование тканей, залитых парафином
Водяная баня Leica	Leica Microsystems	ХИ1210	Плавучие парафиновые профили
Световой микроскоп (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Япония	Н/Д	Гистологическое наблюдение
Микрокомпьютерный томограф (ZKKS-MCT-Sharp)	Отечественный производитель, Китай	Н/Д	Визуализация костей
Вторичное антитело мыши-HRP	Технология клеточной сигнализации (CST), США	7076	1:2000 разбавление
Программное обеспечение для обработки изображений NIS-Elements	Компания Nikon	Н/Д	Захват и анализ изображений с микроскопа
Программное обеспечение NRecon	Bruker, Германия	Версия 1.6	Реконструкция компьютерной томографии
Пальмитиновая кислота (ПА)	Сигма Олдрич, США	П0500	500 &микро; Приклад M для модели ячейки FD
Парафин воск для среза, степень патологии, температура плавления 52-54 °°; C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500г	Используется для заделки парафина при обработке тканей
Парафин для среза, степень патологии, температура плавления 56-58 °°; C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500г	Используется для окончательного встраивания твердого воска в срезы тканей
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Gibco / Термофишер	C10010500BT	Промывка клеток и промывка тканей
Пенициллин-стрептомицин	Corning, США	Н/Д	1% для клеточных культур
Мембрана из ПВДФ (0,45 &; m)	Миллипор, США	IPVH00010	Западная блот-мембрана
Вторичное антитело Rabbit-HRP	Технология клеточной сигнализации (CST), США	7074	1:2000 разбавление
Красные чернила	ГЕРОЙ	ГЕРОЙ 204	Отслеживание следов при анализе походки
Буфер для лизиса RIPA	Keygen, Китай	Н/Д	Экстракция белка
Safranin O– Быстрый набор для окрашивания в зеленый цвет	Servicebio, Ухань	Г1053	Гистологическое окрашивание
Спиральный микрометр (штангенциркуль)	Хуаншань, Китай	Н/Д	Измерение ширины шва
Программное обеспечение для анализа субхондральной кости (CTAn)	Bruker, Германия	Версии 1.9 и 4.1	Морфометрический анализ
SYBR Green PCR Master Mix	AG Scientific, Китай	Н/Д	Анализ количественной ПЦР
Реагенты вестерн-блоттинг (буфер RIPA, компоненты геля SDS-PAGE, загрузочный буфер, TBST и др.)	Beyotime Biotechnology (Китай)	Н/Д (используется в качестве групповой записи)	Все стандартные реагенты, используемые для процедур вестерн-блоттинга
Ксилол	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Очищение тканей