Методическая статья

Гибридизация РНК in situ с последовательной иммунофлуоресценцией белков в тандемном анализе

914 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68615

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описана гибридизация РНК in situ с последовательной иммунофлуоресценцией белков в тканях на автоматизированной платформе для характеристики целевых пространственных множественных омиков на клеточном уровне.

Аннотация

Функциональность ячеек в организме хозяина не зависит от изолированных сигналов. Вместо этого все компоненты, от мельчайших молекул РНК до самых крупных белков, должны функционировать в гармонии и координации в организме человека. Таким образом, важность подходов, объединяющих пространственные исследования на клеточном уровне в нескольких омиксах, имеет первостепенное значение для понимания межклеточных взаимодействий и прогрессирования заболевания. Препарирование протеома и транскриптома в одном и том же пространственном анализе помогает нам понять, как не только то, что клетка должна выполнять (РНК), но и как она выполняет эти инструкции в контексте микроэкологической ниши, в которой она находится (белок). Эта рукопись посвящена интеграции последовательной иммунофлуоресценции (SeqIF) с гибридизацией РНК in situ (ISH) с тканевой микрофлюидной системой для высокопроизводительного исследования белков и РНК в пространственном контексте (seqRNA-ISH+seqIF), которая позволит создать до 12 РНК и 24 белковых мишеней за один прогон с возможностью добавления дополнительных белковых мишеней с помощью последовательные прогоны. Этот метод обеспечивает платформу последовательной целевой мультиомики, которая не требует рассмотрения совместимости флуорофоров и обширной оптимизации для более высокого плексирования. Это позволяет понять, какие сообщения клетка подгоняет или отправляет в свое микроокружение. Этот целенаправленный подход помогает проверить методы полного транскриптома, изучая при этом взаимодействие между РНК и белками более точным образом.

Введение

Сложное функционирование клеток в организме человека зависит от сложного взаимодействия сигналов, от малых молекул РНК до крупных белков, которые работают в координации1. Это взаимодействие подчеркивает важность интегративных подходов, которые изучают пространственные взаимодействия на клеточном уровне на различных омиксных уровнях 2,3. Такие методологии необходимы для понимания сложностей межклеточных взаимодействий и прогрессирования заболевания. Многие традиционные методы, такие как проточная цитометрия4 и секвенирование одиночныхклеток5, клеточные изоляты используются для исследования дезагрегированных образцов с целью выявления объемных соотношений фенотипов, присутствующих в конкретном образце. Тем не менее, выделение клеток для анализа может вызвать активацию или фенотипические изменения, которые могут неточно отражать их естественную биологию и функцию in situ6. Передовые методы пространственной биологии предлагают новые стратегии для изучения клеток и их микроокружения без ущерба для контекста архитектуры тканей и пространственных отношений с соседними клетками в нескольких молекулярных типах 2,7.

Интеграция транскриптомного и протеомного анализов в рамках одного пространственного анализа, без выделения отдельных клеток, дает всестороннее представление о клеточной функции. Этот метод основан на методах флуоресцентной иin situ гибридизации одной молекулы РНК (FISH), но не включает расщепление протеиназ, которое усложняет последовательные опросы белков8. Гибкость подхода, используемого для одного сечения, обеспечивает более высокое пространственное разрешение и меньшую обработку изображений для интеграции и выравнивания сечений. Этот подход позволяет получить представление как об инструкциях, получаемых клеткой (РНК), так и об их выполнении (белке) в ее конкретной нише микроокружения. Комбинируя эти слои информации, исследователи могут получить более глубокое представление о клеточном поведении и коммуникации.

Несмотря на существование ручных методов, последние достижения в технологиях пространственной омиксы позволили проводить более сложный анализ с большим количеством протеомных маркеров, изучаемых с использованием ручного мультиплексирования9. Эти подходы включают в себя усовершенствование как белковых, так и РНК-ISH анализов 10,11,12,13,14, а также автоматизированные методологии, требующие системно-специфических конъюгированных антител 15,16,17, визуализационную массовую цитометрию (IMC)18,19,20 и другие автоматизированные флуоресцентные последовательные протеомные методики, в которых используются готовые первичные и вторичные антибактериальные препараты 2,21,22. Эти технологии упростили либо протеомику, либо комбинированную транскриптомику и протеомику с использованием таргетных подходов и обычно визуализируют как РНК с помощью зондов, так и белки с помощью антител на основе аналогичных конъюгатов, что позволяет одновременно или последовательно детектировать РНК и белок с использованием одной и той же методологии или инструментов. Предоставляя всестороннее представление о клеточной активности, эти типы подходов направлены на улучшение нашего понимания клеточной коммуникации между клетками и их микроокружением. Он предлагает ценный инструмент для расшифровки сложностей клеточного взаимодействия, потенциально открывая новое понимание нормальных физиологических процессов и механизмов заболеваний.

Этот протокол содержит рекомендации по интеграции гибридизации РНК in situ (ISH) с последовательной иммунофлуоресценцией (SeqIF) с тканевой микрофлюидной системой. Это обеспечивает высокопроизводительный инструмент для исследования РНК и белка в их естественном пространственном контексте. Этот метод (seqRNA-ISH+seqIF) позволяет использовать до 12 РНК и 24 белковых мишеней за один прогон, при этом дополнительные белковые мишени могут быть добавлены с помощью последовательных прогонов. Несмотря на то, что данный протокол ориентирован на одну конкретную микрофлюидную систему, предоставленные рекомендации по обработке тканей, обеспечению качества РНК, а также выбору антител и титрованию могут быть адаптированы к другим методологиям. Тем не менее, этот метод использует извлечение антигена pH 9,0 для эффективного, свободного от протеазы эпитопа, улучшая стабильность протеомики и обеспечивая некоторую целевую транскриптомику, в отличие от традиционной РНК-ISH при pH 6,0 с протеазой для увеличения доступности РНК-зонда, но не сохраняет протеом8. Метод seqRNA-ISH+seqIF визуально представлен на рисунке 1, демонстрируя амплификацию РНК FISH с последующим расщеплением перед использованием метода спаривания первичных и вторичных антител, в котором используется щадящее химическое удаление первичных и вторичных антител. Последовательный характер seqIF и детектирования позволяет преодолеть многие ограничения, связанные с совместимостью флуорофоров, за счет использования последовательных методологий23. Это снижает потребность в обширной оптимизации, необходимой для одновременного окрашивания в методологиях с высоким уровнем плекса, требующих компенсации спектрального перекрытия23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом протоколе используются фиксированные формалином срезы парафина, залитые парафином (FFPE), собранные у пациентов с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности, ранее получавших лечение, которым была проведена первичная циторедуктивная хирургия. Все клинические данные были получены из репозитория рака яичников отделения гинекологической онкологии и репродуктивной медицины в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом им. М. Д. Андерсона Техасского университета. Письменное информированное согласие пациентов было получено персоналом регистратуры, а исследования проводились в соответствии с признанными этическими принципами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, если не указано иное, разведены в деионизированной воде, не содержащей нуклеаз.

1. Исправление и встраивание образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор фиксативной и фиксирующей длительности сильно влияет на эффективность анализов, и в целом пространственные анализы чаще всего проводятся с помощью FFPE, поскольку он сохраняет патологическую архитектуру. В этом протоколе описывается использование ткани FFPE, поэтому для образцов тканей FFPE рекомендуется следующий протокол. Однако на качество РНК влияют процессы фиксации, как и на белковые эпитопы, но в меньшей степени. Эти методы фиксации, неполная фиксация и деградация образца могут увеличивать неспецифическое связывание в протеомике на основе антител. В-третьих, конститутивная флуоресценция обычно гасится во время обработки FFPE, но некоторые флуорофоры сохраняются умеренно и требуют испытаний, чтобы убедиться, что они гасятся.

  1. Разрежьте ткань на толщину ≤ 5 мм для обеспечения равномерной фиксации и предотвращения диффузионных барьеров, вызванных жиром. Немедленно зафиксируйте срезы в 10% фосфатно-буферном формалине (pH 7,0) при 4 °C в течение 24 ч для оптимизации РНК и белка24.
  2. Обработайте неподвижные ткани в тканевом процессоре или вручную, выполнив следующие шаги
    1. Обезвоживайте срезы тканей в молекулярном этаноле в воде, свободной от нуклеазы (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x в течение 1 ч каждый).
    2. Затем погрузите ткань в ксилол 2 раза на 1 час каждый раз при комнатной температуре (~23 °C).
  3. Разогрейте парафин до 60 °C. Погрузите тканевый ящик в парафин на 2 раза на 1 час каждый.
  4. Поместите надутую ткань и сориентируйте ткани в форму, заполните свежим парафином, и быстро остудите до 4 °C25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты для РНК будут получены при выполнении всех этапов в течение 48 часов.

2. Оценка качества РНК

  1. Используйте три последовательных секции, выполняя либо все три слайда параллельно, либо запуская слайды управления перед целевой панелью, чтобы убедиться в достаточности блокировки. Парные положительные контрольные зонды нацелены на гены хозяйствования для оценки качества ткани и пространственной целостности ткани, на которую могут влиять различия в персиментности. Обычно используемые контрольные группы включают UBC (ген с высокой экспрессией), PPIB (умеренная экспрессия) и POLR2A (низкая экспрессия)26. Используйте наборы зондов отрицательного контроля, такие как Dab1 (РНК почвенных бактерий) на каждом канале обнаружения. При необходимости можно включить все положительные и отрицательные контрольные щупы на одном образце вместе с целевыми пробниками. В этой конфигурации поместите отрицательные элементы управления Dab1 в каналы T2–T4, назначьте положительные элементы управления от наименьшей до высшей экспрессии T1, T5 и T9 и убедитесь, что целевые зонды занимают остальные каналы.
    НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Кроме того, для образцов с неизвестным качеством РНК может быть полезно определить значение распределения 200 (оценка DV200). Настоятельно рекомендуется набрать более 30 баллов по шкале DV200, а для более высокого качества — 50 или выше —27. Эта оценка является показателем качества РНК, а более высокое качество образца увеличивает вероятность эффективной работы РНК-ISH27.

3. Меры предосторожности и подготовка к РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обеззараживать область РНКаз и протирать ее, а затем распылять на рабочую зону 70% этанола перед обработкой, в дополнение к использованию зоны, свободной от РНКазы, всегда надевайте чистые перчатки, лабораторный халат и маску, чтобы свести к минимуму попадание РНКаз через кожу или дыхание. Используйте только воду и расходные материалы, не содержащие РНКазы, и не лезьте в пакеты с расходными материалами. Эти меры предосторожности, а также сохранение тканей/предметных стекол в прохладе и сухости, необходимы для поддержания целостности РНК во время экспериментов.

  1. Разрежьте срезы на положительно заряженных стеклянных предметных стеклах с помощью микротома и поместите интересующую область в центр предметного стекла, который совпадает с областью изображения (зависит от системы; здесь она составляет примерно 12,5 мм x 12,5 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что идеальная толщина каждого участка составляет от 4 до 6 мкм для тканей FFPE.
  2. Выпекать FFPE Скользит в сухой духовке без РНК тканью вверх при температуре 60 °C в течение минимум 1 часа и до ночи для жировых тканей или тканей, которые иным образом склонны к отслоению.
  3. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ предварительная обработка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что предварительная обработка не является обязательной, некоторые шаги также являются необязательными, как описано ниже.
    1. Приготовьте 3% перекись водорода: В коническую пробирку объемом 50 мл добавьте 5 мл 30% перекиси водорода к 45 мл 1x PBS. Оставшуюся перекись водорода хранить при комнатной температуре (~23 °C), закрыв крышкой парапленкой, до трех месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перекись водорода является сильным окислителем. Держите вдали от горючих материалов, источников тепла и металлов. Используйте в зоне вытяжного шкафа с химическими веществами со средствами индивидуальной защиты (СИЗ; например, очки, перчатки и лабораторный халат). Избегайте контакта с кожей, глазами и вдыхания. Промойте кожу водой в течение 15 минут, если она подверглась воздействию. Обратитесь за медицинской помощью при проглатывании или вдыхании. Более высокие концентрации могут вызвать серьезные ожоги и могут воспламениться или взорваться органическими материалами или некоторыми металлами. Всегда добавляйте перекись водорода в воду, чтобы избежать бурных реакций.
    2. Приготовьте 3,7% формальдегид: В вытяжной шкаф для химикатов добавьте 1 мл 16% формальдегида на 3,3 мл 1x PBS. Хранить формальдегид, обернутый парапленкой, до трех месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид может вызвать серьезное повреждение глаз, раздражение дыхательных путей и подозревается в возникновении рака. Длительное или повторное воздействие может привести к сенсибилизации кожи и аллергическим реакциям. Используйте только в вытяжном шкафу для химических веществ и надевайте соответствующие СИЗ (перчатки, защитные очки/лицевой щиток, маска, лабораторный халат и т. д.). Избегайте контакта с кожей, попадания в глаза и вдыхания. Держите вдали от источников тепла и открытого огня. Утилизируйте параформальдегид и загрязненные материалы как опасные отходы и по возможности подготавливайте только необходимое количество для немедленного использования.
    3. Депарафинизируйте путем промывания предметного стекла путем помещения его в конические пробирки объемом 50 мл, содержащие следующее: ксилол (40 мл) на 3 промывки по 5 мин каждая в вытяжном шкафу для химикатов.
      ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Вместо ксилола можно использовать гистологический очищающий агент, не содержащий ксилола, но он потенциально может оставить следы парафина и повлиять на качество изображения. Это включает в себя помещение срезов в конические пробирки объемом 50 мл, содержащие следующее: гистологический очищающий агент без ксилолового основания (40 мл) на два промывки по 15 минут каждое. Секции из блоков, изготовленных с использованием пчелиного воска, могут быть затруднены для депарафинизации без использования ксилола. Для неизвестных смесей воска и парафина рекомендуется использовать ксилол с соблюдением правильных мер предосторожности. Ксилол является опасным и легковоспламеняющимся веществом, и длительное воздействие может привести к повреждению центральной нервной системы, печени и почек. Используйте только в вытяжном шкафу для химических веществ и носите СИЗ (например, перчатки, маски и лабораторные халаты). Утилизируйте ксилол и загрязненные материалы как опасные отходы. В случае контакта немедленно обратитесь за медицинской помощью.
    4. Повторите гидратацию, промыв предметное стекло, поместив в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую: 100% этанол (40 мл) на 2 промывки по 3 мин каждая; 95% этанол (40 мл) на 2 стирки по 3 мин каждая; 70% этанол (40 мл) на 2 стирки по 3 мин каждая; 50% этанол (40 мл), на 2 промывки по 3 мин каждая; 30% этанол (40 мл) на 2 стирки по 3 мин каждая; 1x PBS для стирки (40 мл) на 1 стирку в 2 мин.
    5. Пероксидаза блокирует ткань, помещая ее во влажностную камеру при комнатной температуре (~23 °C) и покрывая ткань примерно 100-200 мкл 3% перекиси водорода, на 1 промывку в 10 мин, затем промывайте ткань 1x PBS (40 мл), в течение 2 стирок по 2 мин каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование пероксидазы является необязательным и гасит остаточные ферменты пероксидазы в тканях, уменьшая неспецифическое окрашивание и может снижать аутофлуоресценцию тканей. Это особенно важно для тканей с высокой аутофлуоресценцией, таких как костный мозг, почки, печень, легкие, кишечник и мозг, где сильные фоновые сигналы могут мешать визуализации в диапазонах излучения TRITC и FITC 28,29,30,31,32.
    6. Проведите фиксацию формальдегида, поместив салфетку в камеру с влажностью при комнатной температуре и покрыв ткань примерно 100-200 мкл 3,7% формальдегида на 1 промывку в 10 мин, затем промойте салфетку 1x PBS (40 мл) в течение 2 стирок по 2 мин каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязателен, но рекомендуется для тканей с высоким содержанием жира или других тканей, которые имеют проблемы с прилеганием к стеклянным предметным стеклам.

4. Забор антигена

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый и описанный здесь метод депарафинизации и извлечения антигена отличается от метода, рекомендованного производителем для seqRNA-ISH+seqIF, в котором используется устройство для контролируемого нагрева антигена большой емкости.

  1. Извлечение антигена, индуцированного теплом (HEIR) с помощью микроволновой печи
    1. Используя микроволновую печь с контролируемой температурой, добавьте достаточное количество коммерчески доступного буферного раствора pH 9,0 HEIR (приблизительно 250 мл) для покрытия предметных стекол в держателе предметного стекла под термометром, если это применимо.
      Примечание: Извлечение антигена для РНК обычно осуществляется при pH 6,0, однако следующие методики предназначены для pH 9,0 для более высокой эффективности связывания антител.
  2. Вставьте предметные стекла в буферный раствор в микроволновую печь и уравновесьте пустые камеры, если это применимо, двойной дистиллированной водой. Нагрейте в микроволновой печи в течение 15 минут при температуре 107 °C (общее время обычно составляет 30 минут, чтобы буфер HEIR нагрелся).
  3. Охладите предметные стекла, поместив их под вытяжной шкаф с химическими веществами при комнатной температуре примерно на 20 минут.
  4. Промойте предметные стекла в 1x PBS в конической трубке объемом 50 мл (40 мл), на 1 стирку в течение 2 минут.
  5. Храните предметные стекла в почтовой машине с винтовой крышкой или конической трубке объемом 50 мл, заполненной 1x PBS (или коммерческим буфером для мультиокрашивания) и продолжайте немедленно, или храните при температуре 4 °C до 7 дней, но в идеале менее 72 часов перед началом использования seqRNA-ISH+seqIF.

5. Приготовьте исходные растворы

  1. Подготовка 40-кратного буфера для визуализации РНК
    1. Приготовьте 40-кратный буфер для визуализации РНК, смешав 400 мг порошкового буфера для визуализации РНК и 25 мл свободной нуклеазной деионизированной воды
    2. Полученный раствор перемешать вихрем до полного растворения и впоследствии аликотировать в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (1 мл на пробирку)
    3. Заморозьте и храните при температуре -20 °C до трех месяцев, избегая циклов замораживания-оттаивания.
  2. Приготовьте 20x соляно-натриевый цитратный буфер (SSC)
    1. Растворите 157,3 г хлорида натрия (NaCl) и 88,2 г цитрата натрия (Na3C6H5O7) в 800 мл свободной нуклеазы деионизированной воды.
    2. Измерьте pH и титруйте до pH 7,0 по каплям с помощью 1 М соляной кислоты (HCl).
    3. Автоклав для стерилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Sterile 20x SSC также можно приобрести в разных компаниях. После вскрытия хранить при комнатной температуре до 4 °C.
    4. Приготовьте 4x буфер SSC, смешав 1 мл 20x запаса SSC с 4 мл деионизированной воды без нуклеазы

6. Последовательная РНК-ISH + последовательная иммунофлюоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные здесь этапы адаптированы из протокола производителя для seqRNA-ISH+seqIF, описанного в Таблице материалов, поскольку большинство реагентов идентифицированы как системосовместимые, коммерческие, реагенты. Эти реагенты идентифицируются и/или поставляются производителем и разработаны таким образом, чтобы быть совместимыми с системой. Изменения возможны и описаны в обсуждении, но могут потребовать дополнительного тестирования и промывки жидкостью для предотвращения накопления. Программное обеспечение рассчитает общий объем необходимых реагентов после того, как панель и протокол будут разработаны и введены в действие. Тем не менее, представлены рекомендуемые модификации. Общий объем всегда будет варьироваться в зависимости от количества циклов и целевых объектов, используемых для каждого протокола. Тем не менее, разведения антител и РНК-ISH не будут рассчитаны системой, если каждая отдельная комбинация не будет введена в качестве уникального элемента в базу данных. Для этого протокола требуется 400 мкл коктейля антител на одно предметное стекло.

  1. Подготовка системы
    1. Перед проведением seqRNA-ISH+seqIf тщательно промойте все микрофлюидики водой, не содержащей нуклеаз.
    2. Распылите снаружи системы раствор для обеззараживания РНКазы, а затем 70% этанол.
  2. Подготовка реагентов общего назначения
    1. Буфер для промывки: 50 мл 20-кратно совместимого с системой, коммерческого, мультиокрашивающего буфера + 950 мл деионизированной воды без нуклеаз
    2. Вода: 100 мл деионизированной воды без нуклеаз.
    3. Этанол: 100 мл 70% этанола.
    4. Буфер для визуализации: 16 мл 10-кратно совместимого с системой, коммерческого, решения для визуализации + 140 мл деионизированной воды без нуклеазы + 4 мл совместимого с системой, коммерческого, исходного изображения.
    5. Буфер элюирования: 152 системо-совместимый, коммерческий, Elution Solution 1 + 8 системо-совместимый, коммерческий, Elution Solution 2
    6. Буфер для гашения: 130 мл деионизированной воды без нуклеазы + 14 мл совместимой с системой, коммерческий, раствор для гашения 1 + 16 мл совместимый с системой, коммерческий, раствор для гашения 2.
  3. Подготовка окрашивающих реагентов по протоколу RNA-ISH
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно завершить накануне вечером и хранить при температуре 4 °C в темноте. Несмотря на то, что в рекомендациях производителя указано, что объединенные зонды можно использовать в течение одного года, не рекомендуется объединять зонды более чем за неделю из-за опасений загрязнения. Для зондов лучше всего постукивать или осторожно делать пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать, и аккуратно центрифугировать их для вращения перед использованием.
    1. Совместимый с системой, коммерческий, не содержащий протеиназ раствор для пермеабилизации со скоростью 500 μл на предметное стекло в совместимую с системой микроцентрифужную пробирку.
    2. Пуловые усилители РНК-ISH на основе цикла (Таблица 1) в общей сложности 500 мкл на предметное стекло на каждый из следующих элементов в совместимой с системой микроцентрифужной пробирке: i) хвостовые деревья ZZ для хвостов T1 - T4, ii) хвостовые деревья ZZ для хвостов T5 - T8, iii) хвостовые деревья ZZ для хвостов T9 - T 12.
    3. Флюорофоры для особого дерева пула, согласованные с усилителем, в общей сложности 500 мкл на предметное стекло на каждый из следующих элементов в системно-совместимой микроцентрифужной пробирке: i) Флуорофор для деревьев от T1 до T4, ii) Флуорофор для деревьев от T5 до T8, iii) Флуорофор для T9 до T12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг светочувствителен
    4. Приготовьте 1 мл разведения коммерческого DAPI в соотношении 1:200 (исходная концентрация 1 мг/мл) в коммерческом мультиокрашивающем буфере, изготовленном из деионизированной воды, не содержащей нуклеаз, на предметное стекло
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проводилась в соответствии с требованиями производителя, который включает DAPI в состав стандартных реагентов. При использовании специальных составов DAPI, разбавленных N,N-диметилформамидом (DMF), разведения могут варьироваться, и необходимо будет провести тесты на титрование. Тем не менее, рекомендуется использовать концентрацию около 1:1000-1:2000 от исходной концентрации 1 мг/мл. Как правило, концентрация этого метода выше, чем обычно, по сравнению с протоколами ручного окрашивания, поскольку она должна выдерживать несколько раундов визуализации и зачистки. Свежеприготовленные составы DAPI в DMF, как правило, ярче, чем коммерчески доступные составы DAPI. Реагенты с формамидом, такие как DAPI, должны размещаться под химическим вытяжным шкафом. Формамид может вызывать репродуктивную токсичность и повреждение органов и подозревается в канцерогенности. Используйте соответствующие СИЗ (например, перчатки и лабораторный халат).
    5. Непосредственно перед использованием приготовьте буфер для визуализации РНК-ISH из 12,125 свободной нуклеазы деионизированной воды, 1,5 мл 10-кратного буфера для визуализации B и 275 мкл 40-кратного буфера для визуализации A (размороженного или свежеприготовленного)
    6. Приготовьте до 10 пар первичных антител (первичные белковые антитела приведены в таблице 2) для seqIF в соответствии с разведениями, протестированными на титрование, в коммерческом мультиокрашивающем буфере в общей сложности 400 мкл на предметное стекло в системной микроцентрифужной пробирке. Убедитесь, что каждый цикл seqIF содержит только одно первичное антитело на каждый вид хозяина.
    7. Подготовьте вторичные флуорофоры (Таблица 3) и DAPI в соответствии с первичными комбинациями антител на шаге 6.3.7 для seqIF в соответствии с разведениями, протестированными при титровании. Разведите в мультиокрашивающем буфере в общей концентрации 400 мкл за цикл в конической пробирке объемом 50 мл с минимальным мертвым объемом 1 мл. Примеры концентраций для вторичных антител Alexa Fluor и DAPI следующие: 1:200 разведение для Alexa Fluor 555, 1:400 разведение для Alexa Fluor 647, 1:1800 разведение для DAPI (от 1 мг/мл DAPI в DMF)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг чувствителен к свету. Добавление DAPI к вторичным компонентам не соответствует протоколу производителя, так как это может помочь в поддержании экспрессии DAPI на протяжении нескольких циклов seqIF, что помогает выравнивать изображения после прогона. Большинство программ обработки изображений, входящих в состав этой системы, используют сигнал DAPI для подтверждения выравнивания циклической визуализации для флуоресцентной колокализации.
  4. Инициализация системы
    1. Загрузите каждый из реагентов из шага 6.3 в порядке, указанном системой. Обратите внимание, что обычно порядок будет таким, как указано выше, но всегда следите за тем, чтобы реагенты совпадали с местом их загрузки
    2. Загрузите полученный антиген предметный стекал в держатель и убедитесь, что окно визуализации предметного стекла выровнено по центру пространства визуализации, прежде чем поместить совместимый с системой микрофлюидный чип сверху и зафиксировать его на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микросхемы Microfluidics можно повторно использовать для испытаний на титрование seqIF при условии очистки и надлежащего хранения до одного дополнительного раза, при условии, что прокладки остаются неповрежденными. Чипы Microfluidics нельзя использовать повторно при работе с панелью РНК из-за потенциального загрязнения.
    3. Приготовьте расщепляющий раствор, смешав 1,35 мл 4x SSC и 150 мл коммерческого 10x расщепляющего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10-кратный расщепляющий раствор быстро окисляется и хранится в стеклянной ампуле, которую следует разбивать только непосредственно перед использованием в экспериментальном цикле seqRNA-ISH+seqIF.

7. Запуск системы

  1. Прогоните систему в соответствии с инструкциями производителя, приблизительное время выполнения двух слайдов на 12-плексной seqRNA-ISH с 20-плексным белком seqIF составляет 48 часов для окна визуализации размером 12,5 см x 12,5 см.
  2. После завершения прогона seqRNA-ISH+seqIF предметное стекло может быть извлечено и сохранено в 1x PBS или немедленно использовано для дополнительного seqIF (до 40 белков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно очищать и промывать микрофлюидную систему с использованием воды, не содержащей нуклеаз, до и после каждого запуска, чтобы снизить вероятность загрязнения.

8. ОПЦИОНАЛЬНО: Анализ изображений и статистический анализ

  1. Продолжайте анализ изображений и статистический анализ с помощью инструментов анализа изображений или патологоанатомического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера этого метода мы прогнали следующую seqRNA-ISH (Таблица 1) + SeqIF (Таблица 2 и Таблица 3) на двух предметных стеклах из серозной карциномы яичников человека высокой степени злокачественности.

На рисунке 2 показано наложение seqRNA-ISH+seqIF на образец ткани опухоли яичников. Структурные белковые маркеры, такие как коллаген 1, используются для идентификации опухолевых областей, в то время как фен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным этапом подготовки и обработки образцов является снижение контаминации РНКазы. Этого можно достичь, используя маски для предотвращения загрязнения от дыхания и протирая рабочие поверхности раствором для обеззараживания РНКазы и 70% этанолом, полученным из воды, не содержащей нуклеаз. Для слайдов FFPE лучше всего вырезать несколько смежных слайдов из блоков FFPE для seqRNA-ISH+seqIF и хранить их при температуре 4 °C с помощью адсорбента. Для контроля качества, в дополнение ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично профинансировано Альянсом по исследованию рака яичников (OCRA 811621 и 891490), Фондом Sie и Фондом Стефани К. Стелтер. Это исследование было проведено в сотрудничестве с Центром проточной цитометрии и клеточной визуализации, который частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения через грант P30 CA016672 Онкологического центра М. Д. Андерсона и специалиста по исследованиям NCI Джареда Беркса 1 R50 CA243707-01A1.

Мы также хотели бы поблагодарить Эмили Мартерстек из Lunaphore за техническую помощь и обучение.

Автор(ы) получил набор таргетных и контрольных зондов RNAScope в рамках программы раннего доступа от Bio-Techne по сниженной цене, а некоторые реагенты были предоставлены бесплатно для использования в этом исследовании. Производитель не играл никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ ИнвитрогенEN62248 / 62248Для ядерного окрашивания (продукт, использованный во время этого исследования, 62247 был снят с производства)
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 млThermo Fisher Scientific339652Используется для аликвот и смешанные вторичные растворы
70% стерильный изопропаноловый спиртТексвайпТХ3270Для обеззараживания поверхностей
АнтителаРазличныйРазличныйИспользуется для основных целей, зависит от используемого канала
APOE - Хост: Мышь, Клон: 960318НИР DMAB41443-100(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
aSMA - Хост: Мышь, Клон: 1A4САНТИСТОКС69319СФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Микротом с авторезкойЛейка14051956472Рассечение тканей
CD10 - Хозяин: Кролик, Клон: E5P7SСАНТИСТОКС65534С(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD11c - Хозяин: Кролик, Клон: D3V1EСАНТИСТОКС93233СФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD163 - Хозяин: Кролик, Клон: D6U1JСАНТИСТОКС93498С(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD163 - Хозяин: Кролик, Клон: ja51-30ИнвитрогенМА5-32684(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD20 - Хост: Мышь, Клон: L26БетилА500-017АКФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD31 - Хост: Мышь, Клон: 3F8E2ПротеинТек66065-2-Ig(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD33 - Хозяин: Кролик, Клон: BLR061GБетилА700-061CF(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD4 - Хозяин: Кролик, Клон: EPR6855АбкамАБ181724(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD45 - Хозяин: Кролик, Клон: BL-178-12C7БетилА700-012(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD45RO - Хост: Мышь, Клон: UCHL1БетилА500-020АКФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD56 - Хозяин: Кролик, Клон: BLR152JБетил99746(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD66b - Хозяин: Кролик, Клон: BLR111HИнвитрогенМА5-44413(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD68 - Хост: Мышь, Клон: KP-1Биолегенда916104(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD8 - Хост: Мышь, Клон: C8/144BБиолегенда372902(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
CD86 - Хозяин: Кролик, Клон: E2G8PСАНТИСТОКС76755СФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Col 1A1 - Хост: Мышь, Клон: E3E1XСАНТИСТОКС66948С(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Пробирки DNA LoBind 2 млЭппендорф22431048Используется для растворов зондов для смешанных РНК
Дриерит 21005, указывающий на влагопоглотительКоул-Палмер21005Влагопоглотитель для влагопоглотителя
Лезвия для микротомов Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Инвитроген4280ЛГистология - используется при срезировании образцов
Этиловый спирт 100% (200 proof)Фармко111000200Для депарафинизации
Буфер EZ-AR2 EleganceБиоГенексHK547-XAKИспользуется для забора антигена из срезов тканей FFPE
FOXP3 - Хозяин: Кролик, Клон: ПоликлональныйБетилА700-034CF(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Козий антимышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ ИнвитрогенА-21425(примечание: Специально для данного исследования) F(ab')2-козье антимышиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor™ 555
Козий антимышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ ИнвитрогенА-48289/А-21237(примечание: Специально для данного исследования) F(ab')2-козье антимышиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor™ Плюс 647
Козий антикролик IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ ИнвитрогенА-21430(примечание: Специально для данного исследования) F(ab')2-козье анти-кроличьи антитела IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor™ 555
Козий антикролиачий IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ ИнвитрогенА-21246(примечание: Специально для данного исследования) F(ab')2-козье анти-кроличьи антитела IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Хозяин: Кролик, Клон: ПоликлональныйПротеинТек13588-1-АП(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
ХС-ПОЛР2А-Т1ACD Biotechne310457-Т1Человеческий зонд с низкой экспрессией
ХС-ППИБ-Т5ACD Biotechne313907-Т5Управление датчиком со средней экспрессией человека
ХС-УБК-Т9ACD Biotechne310047-Т9Высокий контроль экспрессии у человека
Раствор перекиси водорода 30%Сигма-ОлдричХС0640-5Для подготовки тканей. Помогает блокировать активность эндогенной пероксидазы и получать продукты с высокой окраской. Для приготовления 3% раствора перекиси водорода
Ker8/18 - Хост: Мышь, Клон: ПоликлональныйПротеинТек66187-1-PBS(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
LRP5 - Хозяин: Кролик, Клон: HPA030505СигмаHPA030505-100УЛ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Lunaphore 20x Буфер для мультиокрашиванияБио-ТехнеБУ06Используется в качестве разбавителя и для смывок для COMET
Чип Lunaphore COMETБио-ТехнеМК03Чип mcirofluidics для прибора COMET
Лунафорная кометаБио-ТехнеКМ10-САвтоокрашиватель Seq-IF
Набор буфера для элюирования лунафораБио-ТехнеБУ07-ЛРешение 1 & Решение 2 для ступеней элюирования COMET
Буферный комплект для визуализации LunaphoreБио-ТехнеБУ09Растворенные и Растворитель, используемый для визуализации во время прогона COMET
Буферы для гашения лунафораБио-ТехнеБУ08-ЛРешение 1 & Решение 2 для стадий закалки COMET
МикропипеткаРазличныйН/Ддля приготовления реагентов
Periostin - Хозяин: Мышь, Клон: 1A11A3ПротеинТек66491-1-PBS(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Пирс 16% формальдегид (мас./об.), без метанолаThermo Fisher Scientific28908Для получения 3,7% PFA для подготовки тканей
Пробник 320102 вход (канал T2)ACD Biotechne300040Отрицательное управление DapB в T2
Пробник 320102 вход (канал T3)ACD Biotechne300040Отрицательный контроль DapB в T3
Вход пробника 320102 (канал T4)ACD Biotechne300040Отрицательное управление DapB в T4
Решение для расщепления РНК HiPlexБио-ТехнеНомер по каталогу 324399Реагент для расщепления при анализе RNAScope
РНК-скоп HiPlex Pro для COMET 12-plex, 20-slide KitБио-Техне322075Реагенты и реагенты Буферы для RNAScope
Зонд для РНК HiPlex- Hs-APOE-T2ACD Biotechne433093-Т2(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS- Hs-APOE-T2
Зонд для РНК HiPlex- Hs-ARG1-T4ACD Biotechne401581-Т4(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS- Hs-ARG1-T4
Зонд для РНК HiPlex- Hs-CD274-T1ACD Biotechne600863-Т1(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS- Hs-CD274-T1
Зонд для РНК HiPlex- Hs-CD40-T6ACD Biotechne445973-Т6(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS - Hs-CD40-T6
Зонд для РНК HiPlex- Hs-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-Т12(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS- HS-CXCL1-01-T12
Зонд для РНК HiPlex- Hs-GZMB-T7ACD Biotechne468453-Т7(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS- Hs-GZMB-T7
Зонд для РНК HiPlex- Hs-IFNG-T3ACD Biotechne310503-Т3(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Зонд HiPlex CS- Hs-IFNG-T3
Зонд для РНК HiPlex- Hs-IL23a-T8ACD Biotechne562853-Т8(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS - Hs-IL23a-T8
Зонд для РНК HiPlex- Hs-IL6-T9ACD Biotechne400883-Т9(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Датчик HiPlex CS - HS-IL6-T9
Зонд для РНК HiPlex- Hs-TNFa-T11ACD Biotechne310423-Т11(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Зонд HiPlex CS - Hs-TNFa-T11
Зонд для РНК HiPlex- Hs-VEGFa-T5ACD Biotechne423163-Т5(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Зонд HiPlex CS- Hs-VEGFa-T5
Зонд для РНК HiPlex- Hs-VISTA-T10ACD Biotechne491513-Т10(примечание: Специально для данного исследования) Ранний доступ к РНКоскоп и торговля; Зонд HiPlex CS- Hs-VISTA-T10
РНК-скоп HiPlex12 CS Зонд с отрицательным контролемACD Biotechne324347Полная отрицательная панель управления 12 плексов, рекомендованная производителем. DapB в Т1-Т12.
РНК-скоп HiPlex12 CS Positive Control Probe-HsACD Biotechne324317Полная 12-уровневая панель управления Human Positive рекомендована производителем. Hs -RTU для следующих генов хозяйствования в каналах от T1 до T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Вода без РНКазыКорнинг46-000-СМДля очистки и подготовки всего оборудования, а также для использования в качестве разбавителя при необходимости
Решение для обеззараживания РНКазы ZapThermo Fisher ScientificАМ9782Решение для обеззараживания поверхностей, разрушающее РНКазы
Комплект RNeasy FFPEЦягэн73504 & 19093Для экстракции РНК и Измерение DV200
Почтовая рассылка слайдовSimport ScientificM9504MAДля хранения предметных стекол в жидком буфере.
Хирургическая конструкция Универсальное промышленное бритвенное лезвиеThermo Fisher Scientific / Инвитроген13-812-236Гистология - используется при срезировании образцов
TOX 1/2 - Хост: Кролик, Клон: E613QСАНТИСТОКС62886СФ(примечание: Специально для данного исследования) Антитела к первичному белку
Ксилол гистологической степениThermo Fisher ScientificООН1307Для депарафинизации

Ссылки

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи