Методическая статья

Молекулярная картография с двойной модальностью: интеграция мультиплексного детектирования мРНК с масс-цитометрией с визуализацией белков

DOI:

10.3791/68616

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описана методология детектирования мультиплексной мРНК с помощью массовой цитометрии с визуализацией белка в срезах ткани, залитых формалином и фиксированным парафином.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность обнаруживать белок и мРНК в одном и том же анализе помогает нам понять, как клетка готовится к прибытию и какие сигналы она получает, путешествуя и взаимодействуя в окружающей среде, в которой она находится. Визуализация с более высоким уровнем плекса теперь позволяет одновременно характеризовать мРНК с пространственным разрешением (пространственная транскриптомика) и белок (пространственная протеомика). Чтобы избежать избыточности, эти аналиты могут быть проанализированы в одном срезе ткани. Существует множество технологий, которые позволяют использовать много белков и мало мРНК или наоборот, но поскольку центрально действующими аналитами являются белки, эта рукопись сосредоточена на интеграции белковой визуализационной массовой цитометрии (IMC) с гибридизацией мРНК in situ (ISH) с использованием металлических зондов. Это позволяет нам понять, какие сообщения клетка посылает или быстро отправляет в мир, когда она общается в своем микроокружении. Он также преодолевает ограничения, связанные с обнаружением секретируемых белков или сложных маркеров, которые обычно трудно количественно оценить и визуализировать с использованием только антител. Этот протокол также сводит к минимуму потребность в компенсациях или постобработке, наблюдаемых в методах на основе флуоресцентной лампы с более высоким уровнем плекса, поскольку в системе детектирования на основе металлического зонда нет флуоресцентного спектрального рассеивания, а также нет тканеспецифичных автофлуоресцентных соображений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раковые опухоли демонстрируют структурное и функциональное разнообразие у разных пациентов. Опухолевое микроокружение (ТМЭ), состоящее из нормальных и злокачественных клеток, у пациентов неоднородно. Метастазирование возникает в результате того, что остатки первичной опухоли попадают в кровоток в виде клеточных кластеров и отдельных клеток, что дает подсказки о прогрессировании заболевания и терапевтическом ответе 1,2. Необходимо понимать сложность этих микросред1. Несмотря на то, что опухоли включают в себя большое количество типов клеток, клинический стандарт гистологически основан на одном маркере, который начинает меняться 1,2. Технологии мультиплексной визуализации открыли новые направления в патологии. Пространственно разрешенная протеомика, геномика, метаболомика и липидомика рака человека теперь возможны при разрешенииодной клетки 3,4,5,6 или близком к нему.

Эти технологии могут препарировать гетерогенные клеточные местоположения и взаимодействия в опухолях. Использование соответствующей методологии биовизуализации одиночных клеток позволяет создавать профили многих биомаркеров белка, ассоциированных с заболеванием, в биопсии пациента для разработки методов лечения рака. Выводы, полученные на основе пространственных клеточных карт, смогут помочь при выборе комбинированной терапии, которая может эффективно устранить рак с уменьшением побочных эффектов, резистентностии рецидивов. Речь идет о возможности объединить эти многочисленные разнообразные технологии, которые обычно не работают гармонично на одном и том же участке ткани. Этот протокол, визуально представленный на рисунке 1, дает возможность пространственно исследовать как протеомику, так и целевое подмножество мРНК в одном и том же участке ткани и одной и той же клетке одновременно с более высокой плексивностью, чем это возможно при одновременном флуоресцентном белке + РНК-ISH8. Это также может служить мостом для параллельного анализа 3,4,6 с целью деконволюции анализа данных. Несмотря на наличие двойного обнаружения, можно также исследовать клетки, которые быстро инициировали выработку мРНК, но для которых секретируемый белок остается неопределяемым из-за ограниченной чувствительности и отсутствия амплификации сигнала, присущей методам первичного антитела с прямой меткой, что делает обнаружение секретируемых молекул особенно сложным. Приведенный ниже протокол адаптирован на основе 12-плексного флуоресцентного/хромогенного детектирования и применим для металлодетектирования с помощью модифицированных зондов, восстановленных тиолом, для одновременного детектирования в IMC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе используются фиксированные формалином ткани, залитые парафином (FFPE), собранные у ранее не леченных пациенток, перенесших первичную циторедуктивную операцию по поводу серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности. Все клинические данные были получены из репозитория отделения гинекологической онкологии и репродуктивной медицины в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом им. М. Д. Андерсона Техасского университета. От пациентов было получено письменное информированное согласие, а исследования проводились в соответствии с признанными этическими принципами.

1. Меры предосторожности и подготовка

  1. Всегда используйте воду без нуклеазы (NFW) для приготовления всех необходимых реагентов.
  2. Выполняйте все этапы с использованием пластиковых контейнеров и без использования стекла, чтобы уменьшить связывание металла со стеклом и металлические загрязнения.
  3. Содержите рабочую зону в чистоте и распылите на поверхности и пипетки раствор для обеззараживания РНКазы, а затем 70% этанол, приготовленный с использованием NFW.
  4. Конъюгированные тиолированные зонды детектирования мРНК (T1-T12) с соответствующими металлами через малемидный линкер, как описано Schulz et al.7, более подробно описано в protocol.io в Таблице материалов.
    Примечание: Белковые мишени должны быть выбраны таким образом, чтобы указать расположение клетки в ткани (структурные маркеры), определить, какие клетки присутствуют (фенотипические маркеры) и что клетки делают (функциональные маркеры). Поскольку некоторые функциональные маркеры экспрессируются временно, включение мишеней мРНК позволяет идентифицировать клетки, генерирующие эти мишени.

2. Подготовка и предварительная обработка образцов

  1. Выпекать срезы салфеток в течение ночи в сухой духовке при температуре 60 °C.
  2. Выполните депарафинизацию: три раунда ксилола в течение 5 минут каждый раунд и 10 раундов регидратации (100% этанол (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), в течение 3 минут каждый раунд. Умывайтесь 1x трис-буферным физиологическим раствором (TBS) в течение 2 минут, один раз. В зависимости от того, сколько образцов обрабатывается одновременно, используйте конические пробирки объемом 50 мл (максимум 2 предметных стекла) или кассеты для окрашивания ИГХ объемом 350 мл (максимум 24 предметных стекла).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап депарафинизации, хотя и рекомендуется, является необязательным и зависит от типа ткани.
  3. Нанесите раствор 3,7% параформальдегида (PFA) в течение 10 минут, инкубируя предметные стекла в пробирке объемом 50 мл с достаточным количеством раствора PFA, чтобы покрыть участок ткани.
  4. Извлечение антигенов, индуцированных теплом (HEIR) с использованием микроволновой печи: Используя микроволновую печь с контролем температуры, заполните один лоток буфером для извлечения антигена pH 6 HEIR (350 мл), а остальные лотки - NFW. Поместите срезы тканей в штатив для окрашивания предметных стекол микроскопа и добавьте их в лоток с буфером для извлечения антигена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении забора антигена перед использованием убедитесь, что буфер для извлечения антигена имеет комнатную температуру (RT).
  5. Проведите забор антигена при 107 °C в течение 15 минут, затем дайте тканевым предметным стеклам остыть при температуре RT в течение 20 минут в химическом колпаке.
  6. Во время забора антигена промойте увлажняющую бумагу в воде, поместите ее в лоток для окрашивания предметного стекла с контролем влажности и поместите противень в гибридизационную печь при температуре 60 °C.
  7. Промойте предметные стекла в TBS, не содержащем РНКазы, в течение 3 минут, затем высушите предметные стекла в течение 3 минут.

3. Лечение протеазой

  1. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг каждого участка ткани с помощью гидрофобной барьерной ручки. Дайте барьеру полностью высохнуть в течение примерно 2 минут.
  2. Загрузите сухие салазки в держатель слайдов лотка для влажности, открыв поворотный зажим.
  3. Добавьте достаточное количество капель протеазы, чтобы полностью покрыть участок ткани. Извлеките предварительно нагретый лоток для контроля влажности (60 °C, шаг 2.6) из печи для гибридизации и вставьте держатель слайдов в лоток для контроля влажности. Снова закройте противень для контроля влажности и верните его в печь для гибридизации. Выдерживать при температуре 40 °C в течение 30 минут.
  4. Во время этой инкубации подготовьте материалы анализа RNA-ISH.
    1. Приготовьте 500 мл 1x RNA-ISH промывочного буфера, разбавив 50x запас NFW. Хранить в RT до одного месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в буфере для стирки 50x образовались осадки, восстановите суспендию, нагрев буфер до 40 °C в течение 10-20 минут перед приготовлением буфера для промывки 1x.
  5. Приготовьте 1 л DTBS-T (0,5% Tween) в NFW, добавив 5 мл Tween к 1 л DPBS-T.
  6. Подготовьте зонды-мишени, спаренные с РНК-ИШ:
    1. Прогрейте запасы мРНК-зонда и разбавитель RNA-ISH при 40 °C в сухой духовке в течение 10 минут. Сделайте щупы вихревыми и раскрутите их в настольной мини-центрифуге.
    2. Приготовьте 1x смесь (до 12 зондов, Таблица 1), разбавив 50x зондов в разбавителе RNA-ISH, убедившись, что конечный объем достаточен для покрытия всего участка ткани.
    3. Хорошо переборщите и оставьте смешанные зонды и разбавитель РНК-ISH на RT до использования.
  7. Извлеките противень для контроля влажности из печи для гибридизации и снимите держатель слайдов. Верните противень в духовку.
  8. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте слайды в NFW с легким помешиванием в течение 5 минут.
  9. Повторите шаг стирки со свежим NFW в течение 5 минут.

4. Гибридизация целевых зондов

  1. Удалите лишнюю жидкость со слайдов. Выньте противень для контроля влажности из духовки и поместите держатель в противень.
  2. Добавьте достаточное количество подходящей смеси зондов, чтобы полностью покрыть каждый участок ткани. Закройте противень и поставьте его в духовку на 2 часа при температуре 40 °C.
  3. Поместите реагент RNA-ISH Amplifier 1 (ZZ tail trees for tails T1 - T4) для уравновешивания при RT за 30 минут до окончания инкубации, чтобы использовать на шаге 5.2.
  4. После завершения инкубации извлеките лоток контроля влажности из печи для гибридизации и снимите держатель предметных стекол. Верните противень в духовку.
  5. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x с небольшим перемешиванием в течение 2 минут.
  6. Повторите шаг стирки со свежим буфером для стирки 1x в течение 2 минут при RT.

5. Гибридизация усилителя РНК-ISH 1

  1. Удалите лишнюю жидкость со слайдов и поместите слайды в держатель слайдов лотка для влажности. Вставьте держатель слайдов в лоток для контроля влажности.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 и добавьте его, чтобы полностью покрыть каждую секцию. Закройте противень и поставьте его в печь для гибридизации на 30 минут при температуре 40 °C. Поместите реагент RNA-ISH Amplifier 2 (ZZ tail trees for tails T5 - T8) на RT для использования на шаге 6.2.
  3. Извлеките противень для контроля влажности из печи для гибридизации и снимите держатель слайдов. Верните противень в духовку.
  4. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x с небольшим перемешиванием в течение 2 минут.
  5. Повторите шаг стирки со свежим буфером для стирки 1x в течение 2 минут при RT.

6. Гибридизация усилителя РНК-ISH 2

  1. Удалите лишнюю жидкость со слайдов. Извлеките противень для контроля влажности из духовки и поместите держатель слайдов в противень
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 и добавьте его, чтобы покрыть каждую секцию. Закройте противень и поставьте его в печь для гибридизации на 30 минут при температуре 40 °C.
  3. Поместите реагент RNA-ISH Amplifier 3 (хвостовые деревья ZZ для хвостов от T9 до T 12) в RT для использования на шаге 7.2. Извлеките держатель слайдов из лотка. Поставьте противень обратно в духовку.
  4. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x с небольшим перемешиванием в течение 2 минут.
  5. Повторите шаг стирки со свежим буфером для стирки 1x в течение 2 минут при RT.

7. Гибридизация усилителя РНК-ISH 3

  1. Удалите лишнюю жидкость со слайдов. Извлеките противень для контроля влажности из духовки и поместите держатель слайдов в противень
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 и добавьте его, чтобы полностью покрыть каждую секцию. Закройте противень и поставьте его в печь для гибридизации на 30 минут при температуре 40 °C.
  3. Во время инкубации приготовьте смесь металлических олигонусов для шага 8. Каждый олиго используется в концентрации 1:15 (из 10 мкМ, при этом конечный объем должен быть достаточным для покрытия всего участка ткани). Хорошо перемешайте и оставьте смешанные металлические олигонухиды на RT до использования. Достаньте противень для контроля влажности из духовки, затем извлеките из противня держатель для слайдов. После этого верните противень в духовку
  4. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x с небольшим перемешиванием в течение 2 минут.
  5. Повторите шаг стирки со свежим буфером для стирки 1x в течение 2 минут при RT.

8. Гибридизируйте металлические олигопласты

  1. Удалите лишнюю жидкость со слайдов. Выньте противень для контроля влажности из духовки и поместите держатель в противень. Добавьте смешанные металлические олигопласты, приготовленные на шаге 7.3 (вортекс перед использованием).
  2. Закройте противень и поставьте его в гибридизационную печь на 45 минут при температуре 40 °C.
  3. Извлеките противень для контроля влажности из печи для гибридизации и снимите держатель слайдов. Верните противень в духовку.
  4. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x с небольшим перемешиванием в течение 2 минут.
  5. Повторите шаг стирки со свежим буфером для стирки 1x в течение 2 минут при RT.

9. Металлические конъюгированные антитела

  1. Чтобы блокировать неспецифические участки, нанесите достаточный объем блокирующего буфера, чтобы покрыть весь участок ткани, и инкубируйте в течение 30 минут при ЛТ.
  2. Во время инкубации готовят смесь антител для использования на этапе 10.1 путем разведения антител (табл. 1) в буфере для разбавителя антител.

10. Инкубация с металлическими конъюгированными антителами

  1. После инкубации блокирующего буфера удалите блокирующий буфер из предметных стекол и дозируйте достаточное количество смеси Ab (из шага 9.2), чтобы покрыть весь участок ткани.
  2. Поместите предметное стекло в камеру с влажностью и выдерживайте в течение ночи (~16 часов) при температуре 4 °C.

11. Окрашивание ДНК

  1. Приготовьте свежий раствор Ик-интеркалятора.
    1. Из исходного раствора 500 мкМ приготовьте рабочий раствор в масштабе 1:2000 в ТБС, не содержащем РНКазы. Рабочий раствор можно аликвотировать и хранить при температуре -20 °C (не замораживать-размораживать).
  2. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере TBS-T с небольшим перемешиванием в течение 5 минут.
  3. Повторите стирку в TBS-T.
  4. Закрасьте предметные стекла рабочим раствором Ir (с шага 11.1.1) в течение 5 минут при температуре RT.
  5. Поместите слайды в прозрачный держатель слайдов, предварительно вымытый NFW. Промойте предметные стекла в буфере TBS-T с небольшим перемешиванием в течение 5 минут.
  6. Повторите стирку в TBS-T.
  7. Стирать дважды в TBS, 5 мин (медленно помешивать).
  8. Быстро опустите предметное стекло в ddH2O, чтобы избежать кристаллизации солей, присутствующих в TBS, на ткани.
  9. Высушите предметное стекло под химическим колпаком (10 минут) и храните при температуре 4 °C до получения изображения.

12. Получение изображения

  1. Загрузите предметное стекло в абляционную камеру ИМК.
  2. Сделайте панорамное изображение, чтобы определить область интереса (ROI).
  3. Составьте план окупаемости инвестиций в программном обеспечении для получения изображений.
  4. Примените шаблон приобретения.
  5. Отрегулируйте мощность лазера (энергию абляции) в зависимости от типа образца. Значение по умолчанию установлено на уровне 0 дБ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверять энергию абляции с несколькими небольшими участками тканей (30 мкм x 30 мкм), увеличивая мощность каждый раз на 1 дБ. Выберите самую низкую энергию абляции, при которой образец очищается без прогорания в предметном стекле. Обычно это приводит к мощности лазера 3-4 дБ. Иногда, если ткань толще, чем рекомендуется, мощность лазера увеличивается до 5 дБ.
  6. Начните лазерную абляцию. Система направляет лазер на ROI и аблятирует белки, помеченные металлами, генерируя аэрозольные шлейфы, которые переносятся на факел с индуктивно связанной плазмой (ICP), где шлейфы испаряются, распыляются и ионизируются в плазме.
  7. Измерьте количество каждого изотопа, которое измеряется детектором и преобразуется в данные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность обнаруживать белок и мРНК в одном и том же анализе помогает нам понять, как клетка готовится к прибытию, а также какие очереди она получает при перемещении и взаимодействии с окружающей средой. Как видно из репрезентативных данных, обнаружение мРНК и белков является критически важным компонентом в исследованиях в области пространственной биологии, поскольку нижние пределы обнаружения могут быть довольно сложными в зависимости от того, как продвигаются этапы мечения, детектора...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексная мультиомика является критически важной эволюцией в собираемых данных, нацеленной на межклеточные и межклеточные взаимодействия, которые влияют на прогрессирование заболевания и лечение. Анализ этих данных в одном и том же образце и, следовательно, в одной и той же клетке имеет решающее значение, поскольку многие белковые мишени экспрессируются временно или различаются по уровню экспрессии мРНК и белка, таким образом, обнаружение целевой мРНК в сочетании с белком позволяет ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джаред К. Беркс является консультантом компании Standard BioTools.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в сотрудничестве с Центром проточной цитометрии и клеточной визуализации, который частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта P30 CA016672 Онкологического центра им. М. Д. Андерсона. Это исследование также было частично поддержано премией MD Anderson's Cancer Center's Support Grant Development Award, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. Усилия JKB были частично поддержаны CA016672 P30 и специалистом по исследованиям NCI 1 R50 CA243707-01A1. Усилия SFB были частично поддержаны Альянсом по исследованию рака яичников (OCRA 811621 и 891490), Фондом достопочтенной Тины Брозман по исследованию рака яичников, Программой исследований развития спор яичников MDACC, NIH 1R01CA261952-01A1. Усилия SFB, JKB и BG были частично поддержаны грантом 1U01CA294459-01. Авторы выражают признательность Сэмюэлю Моку, который разделил и предоставил использованные образцы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Конъюгация олигонуклеотида и полимера для массовой цитометрии визуализации V.2 
10x TBS без РНКThermo Fisher Scientific J62780. K7Для прерывистых промывочек между этапами
Гибридная система ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Духовка для слайдов для выпечки салфеток
Разбавление антителДакоS0809 Буфер разбавления антител
Антитела: B7-H3БетилA700-025CF, A700-026CFКлон: BLR025F, BLR026F
Антитела: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Клон: H74
Антитела: BRD4(6F11)БетилA700-005CFКлон: BL-151-6F11
Антитела: CCR6R& DMAB195-100Клон: 53103
Антитела: CD11bAbcam ab209970Клон: EPR1344
Антитела: CD25Abcam ab215378Клон: EPR6452
Антитела: CD278/ICOSCST 89601BFКлон: D1K2T
Антитела: CD31Abcam ab207090Клон: EPR3094
Антитела: CD33Abcam ab238784Клон: SP266
Антитела: CD3e CST85061BFКлон: D7A6E
Антитела: CD4AbcamAB181724Клон: EPR6855
Антитела: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Клон: IM7
Антитела: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Клон: CD45-2B11
Антитела: CD8aCST 85336BFКлон: D8A8Y
Антитела: CXCL13R& DAF801Клон: Поликлональный
Антитела: CXCR5R& DMAB190-100Клон: CXCR5
Антитела: гамма-H2AXБетилA700-053CFКлон: BLR053F
Антитело: Гранзим BСанта-КрусSC-8022 XКлон: 2C5
Антитела: KAP1БетилA700-014CFКлон: BL-248-2G6
Антитела: Ki67БетилA700-021CFКлон: BLR021E
Антитела: LCK CST2984BFКлон: D88
Антитела: MFAP5Н/ДН/ДPMID: 31332047 / Клон: 130A  (Примечание: индивидуально разработано) 
Антитела: SMACST56856BFКлон: 1A4
Антитела: VEGFSTB-Fluidigm3163028DКлон: G153-494
Антитела: VISTACST64953BFКлон: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKБуфер для извлечения антигена
Этиловый спирт 100% (200 proof)Pharmco111000200Для депарафинизации
EZ – Ретривер ИКBioGeneXMW016-IRАнтигенная система для срезов тканей FFPE
Гибридизационная система HybEZ IIACD Biotechne321710Система включает: духовку HybEZ (PN 321710/321720), лотка для контроля влажности (PN 310012) и увлажняющую бумагу HybEZ (2 листа PN 310025), лоток для мытья EZ-batch (PN 321717), держатель для слайда EZ-batch (PN 321716)
ImmEdge гидрофобный барьерный PAP Pen VectorLabsH-4000Гидрофобный барьерный загон
Решение ИК-интеркалятораThermo Fisher Scientific NC1038184Используется для идентификации ядерных клеток
КЕРАТИН 8/18CST 4546BFКлон: C51
Metal OligosРазличныеРазличныеМеталлическая метка варьируется от T1 до T12 в зависимости от того, что требуется
Вода без нуклеазы (NFW)Corning 46-000-CM Чистить и готовить всё оборудование, а при необходимости использовать его как разбавитель
РНКскоп протеаза плюс ACD Biotechne322331 Используется для проникновения клеточных мембран образцов
Держатель затвора RNAscope EZ-batchACD Biotechne310017Разработан для эффективной обработки до 20 слайдов в пакетном режиме вручную
Набор реагентов RNAscope HiPlex12 v2 ACD Biotechne324409Реагенты для RNAScope
RNAscope HiPlex зонд — целевые зондыACD BiotechneРазличныеДиапазон от T1 до T12 в зависимости от того, что требуется
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZapТермо Фишер СайентификAM9782Раствор для дезактивации поверхности, уничтожающий РНазы
Стойка для окрашивания микроскопа Держатель для корзины 24 Положите химически устойчивый пластикOptimal Scientific3028Для окрашивания нескольких стеклов
Tween 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APДля прерывистых промывочек между этапами
Блок ультразрельным белкомThermo Fisher Scientific TA125PBQБлокирующий буфер

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situCD8

Похожие статьи