Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Амплификация и распознавание микроРНК с помощью гибридизации заблокированных нуклеиновых кислот in situ как новый метод обнаружения и количественной оценки

744 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

7 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описывает метод тандемной иммунофлуоресцентной гибридизации с тканью, интегрированной в формалин-фиксированный парафин, для одновременного обнаружения и количественного определения микроРНК и мультиплексированных белков.

Аннотация

При использовании традиционных методов визуализации на основе зондов in situ (ISH) микроРНК (микроРНК) трудно захватить из-за их размера, который колеблется от 19 до 25 нуклеотидов. Однако, поскольку микроРНК являются ключевыми эпигенетическими регуляторами, которые способствуют нормальной физиологии и многочисленным патологическим состояниям, понимание пространственно-временного поведения микроРНК важно для раскрытия их функции на клеточном и субклеточном уровнях. Это создает явную потребность в адекватных методах обнаружения и визуализации. Поэтому мы создали технологию амплификации и распознавания микроРНК с помощью гибридизации заблокированных нуклеиновых кислот in situ (MARLIN), которая была разработана и оптимизирована с использованием мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания и зондов заблокированных нуклеиновых кислот (LNA), нацеленных на микроРНК. Этот метод позволяет количественно определять микроРНК с мультиплексной экспрессией белка, что позволяет количественно определять внутриклеточные и внеклеточные микроРНК в микроокружении опухоли (ТМЭ) с высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Совместное использование анализов обнаружения микроРНК и захвата белка также может обеспечить всестороннее понимание клеточных функций и регуляторных механизмов в этой TME.

Введение

МикроРНК
Несмотря на то, что микроРНК (микроРНК) невероятно малы, колеблясь от 19 до 25 нуклеотидов в длину, эти одноцепочечные молекулы РНК являются мощными регуляторами экспрессии генов, модулируя матричные РНК (мРНК) посттранскрипционно посредством последовательно-специфичных взаимодействий1. По сути, микроРНК действуют как негативные регуляторы, связываясь с мишенями мРНК, либо предотвращая их трансляцию, либо способствуя их деградации через расщепление мРНК, в зависимости от степени комплементарности, что в конечном итоге приводит к снижению выхода белка из целевого гена. В то время как микроРНК в основном являются некодирующими РНК, примерно 40% всех микроРНК все еще находятся в интронах или экзонах генов, кодирующихбелки2. Функциональное назначение микроРНК включает в себя несколько ключевых биологических процессов, таких как пролиферация клеток, ангиогенез, апоптоз и т. д. Примечательно, что нарушение регуляции микроРНК было вовлечено в онкогенез, поскольку аберрантная экспрессия специфических микроРНК и регуляция генов, опосредованная микроРНК, была связана с онкогенной трансформацией при множественных типах рака3.

С момента своего открытия микроРНК широко исследовались при различных заболеваниях из-за их тканеспецифической экспрессии и регуляторных функций, при этом их нарушение регуляции связано со многими заболеваниями, включая нейродегенеративные расстройства, аутоиммунные расстройства и различные виды рака. Паттерны экспрессии микроРНК могут коррелировать с типом рака, стадией и клиническими переменными, что делает профилирование микроРНК ценным инструментом для диагностики рака и прогноза 4,5,6,7. Открытие новых микроРНК также было ускорено благодаря достижениям в области технологий высокопроизводительного секвенирования, что углубило понимание участия микроРНК в различных биологических процессах8. Важность микроРНК была подчеркнута Нобелевской премией по медицине 2024 года, присужденной Виктору Амбросу и Гэри Рувкуну за открытие функции микроРНК в посттранскрипционной регуляции9.

В качестве ценных биомаркеров для диагностики и прогнозирования заболеваний был изучен терапевтический потенциал микроРНК, что привело к разработке препаратов, нацеленных на микроРНК. Терапевтический потенциал микроРНК в лечении рака заключается в их способности координировать регуляцию модулей генов, потенциально восстанавливая нормальныеклеточные функции. Ранее противоопухолевая терапия на основе микроРНК разрабатывалась либо в качестве монотерапии, либо в сочетании с существующими таргетными методами лечения для усиления ответа на лечение и повышения показателей излечения11. Динамический спектр микроРНК позиционирует их как важный ресурс для инновационных стратегий лечения рака. В контексте терапевтической резистентности нацеливание на микроРНК показало многообещающие результаты в снижении рецидивов и устойчивости к традиционным методам лечения рака, потенциально улучшая выживаемость пациентов за счет нацеливания на раковые клетки12. Исследуя роль микроРНК в модуляции активности различных типов клеток в опухолевом микроокружении (TME), потенциально можно обнаружить уникальные и клинически значимые методы лечения рака.

Доступные анализы для обнаружения микроРНК
В настоящее время наиболее распространенным методом измерения микроРНК является извлеченная РНК для количественной ПЦР в реальном времени (q-RT-PCR) или секвенирования нового поколения (NGS), теряя пространственный контекст. Есть компании, которые предоставят анализы микроРНК TaqMan, в которых для синтеза кДНК используются специфичные для мишени праймеры стволовой петли, и химические вещества на основе красителя SYBR Green с универсальным синтезом кДНК. Эти анализы могут обладать высокой чувствительностью и специфичностью и могут проводиться с помощью ряда приборов q-RT-PCR. К сожалению, анализы TaqMan не могут обеспечить абсолютную количественную оценку, что может привести к таким проблемам, как ложноположительные результаты и вариабельность результатов13. Кроме того, несмотря на их высокую чувствительность, применение этих анализов в различных типах образцов может быть ограничено необходимостью обширной подготовки образцов и потенциальным вмешательством других компонентов в образце.

Секвенирование нового поколения (NGS): микроРНК-секвенирование становится все более популярным для дифференциального анализа экспрессии всего микроРНКома биожидкостей. Преимущество технологий NGS, таких как miRNA-seq, заключается в том, что они позволяют проводить массовый параллельный анализ экспрессии микроРНК по всему геному, что позволяет количественно определять отдельные микроРНК, идентифицировать вариации последовательностей и открывать новые микроРНК14. Существенным недостатком методов, основанных на секвенировании, таких как IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit, является индукция количественных смещений, влияющих на точность анализа дифференциальной экспрессии, в значительной степени из-за гомологии и меньшей длины считывания микроРНК14. Не только это, но и присутствие изомиР (вариантов, которые отличаются по последовательности или длине от канонической последовательности микроРНК) и технических артефактов может усложнить интерпретацию данных, потенциально приводя к неправильным обнаружениям и искажающим факторам в анализах биомаркеров. Кроме того, различные инструменты для анализа данных miRNA-seq, такие как sRNAbench и miRDeep2, могут давать различные результаты, влияющие на согласованность и надежность открытия новых микроРНК15,16. Даже что-то вроде технологии микрочипов может быть недостаточным в большинстве случаев. Несмотря на то, что она может обеспечить мощную высокопроизводительную платформу для обнаружения уровней экспрессии микроРНК или генов, что делает ее пригодной для полногеномных исследований, эта технология все еще ограничена количеством ранее идентифицированных микроРНК и не может напрямую проверить взаимодействия микроРНК с мишенью, что ограничивает их полезность вфункциональных исследованиях.

Наиболее важным фактором, который можно подчеркнуть здесь при сравнении всех этих доступных вариантов, является отсутствие пространственного контекста. Они не дают никакого контекста в отношении морфологии тканей или пространственно-временного распределения внутри клеток. Визуализация пространственно-временного поведения микроРНК необходима для раскрытия их функции на клеточном и субклеточном уровнях. В настоящее время доступны анализы гибридизации микроРНК in situ (ISH), обычно с использованием хромогенных методов обнаружения. Несмотря на то, что эти анализы позволяют визуализировать микроРНК с разрешением для одной клетки, результаты некачественные, что затрудняет дифференциацию экспрессии микроРНК и фона образца. Как правило, многие из них дают некачественные анализы, которые ненадежны и обычно требуют ручного количественного анализа.

Поэтому мы разработали амплификацию и распознавание микроРНК с помощью заблокированной нуклеиновой кислоты in situ hybridizatioN (MARLIN) с использованием мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания (с помощью окрашивания опаловым белком) и зондов заблокированных нуклеиновых кислот (LNA), нацеленных на микроРНК в тканях, залитых формалином и залитым парафином (FFPE). Мы добились этого путем внедрения системы усиления тирамидного сигнала (TSA), которая активируется конъюгированным антителом против дигоксигенина (DIG) пероксидазы хрена (HRP). HRP действует как катализатор для TSA, в то время как Anti-DIG присоединяется к зонду LNA. Этот анализ особенно полезен для понимания сущностной природы miR в посттранскриптомной модификации с белками и, возможно, с другими РНК одновременно. Кроме того, из-за отсутствия коммерчески доступного анализа, который мог бы количественно оценить экспрессию как микроРНК, так и белка, MARLIN обеспечивает эффективный способ понимания взаимоотношений in situ miR и белков в образцах FFPE.

Первоначальные результаты количественного определения miR-181c-3p с использованием MARLIN продемонстрировали возможность параллельного анализа микроРНК и белков в нативном пространственном контексте ткани FFPE яичников человека. Помимо данного примера, основываясь на компонентах MARLIN, теоретически возможно расширить до четырех белков с использованием коммерческих флуоресцентных мультиплексирующих флуорофоров, таких как Alexa Fluor, или других низкомолекулярных красителей18.

Кроме того, поскольку эта методология использует вариации стандартных методов гистологии, она должна быть совместима с другими тканями FFPE млекопитающих, при условии соответствующего отбора зонда и антител. Эта методология сохраняет пространственную архитектуру и позволяет количественно оценить клеточную и субклеточную микроРНК и колокализацию белков. Этот подход устраняет критический пробел в пространственной биологии путем картирования паттернов совместной экспрессии микроРНК и белка и пространственного распределения, которые могут быть непосредственно контекстуализированы в архитектурах нативных тканей. Здесь мы представляем MARLIN с подробным графическим обзором на рисунке 1. В то время как представленный протокол оптимизирован для miR-181c-3p, другие miR можно изучить при условии соответствующей конструкции зонда. Критические параметры для этого метода включают: оценку качества тканей и оптимизацию концентраций зондов. Рекомендуется оценивать целостность РНК тканевого блока с помощью метрики DV200 путем использования двух участков по 10 мкм и извлечения РНК с использованием протокола, который сохраняет все размеры фрагментов РНК. Образцы с оценкой DV200 более 50 или выше, а также концентрациями по протоколу должны подвергаться систематическому тестированию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом протоколе используются фиксированные формалином залитые парафином (FFPE) ткани участков опухолевой ткани яичников человека от пациентов с HGSC. Эти образцы были собраны у ранее не леченных пациенток, перенесших первичную циторедуктивную операцию по поводу рака яичников. Все образцы и клинические данные были получены из репозитория рака яичников отделения гинекологической онкологии и репродуктивной медицины в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом Техасского университета им. М. Д. Андерсона. Письменное информированное согласие пациентов было получено персоналом регистратуры, а исследования проводились в соответствии с признанными этическими принципами.

1. Подготовка тканей

  1. Выпекайте все образцы FFPE в течение ночи при температуре 60 °C и очищайте каждую единицу оборудования и инструментов водой, не содержащей РНК. Убедитесь, что толщина секций составляет около 5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для опухолей яичников, но потенциально может быть использован с другими типами тканей после дальнейшего тестирования.
  2. Проведите депарафинизацию тремя раундами ксилола в течение 5 минут каждый раунд и 10 раундами регидратации в течение 3 минут каждый раунд (100% этанол (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Умывайтесь 1x трис-буферным физиологическим раствором (TBS) в течение 2 минут, один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап депарафинизации, хотя и рекомендуется, является необязательным и зависит от типа ткани.
  3. После депарафинизации и регидратации нанесите раствор 3% перекиси водорода (H2O2) на 10 минут. Стирать 2 минуты 1x TBS, 2x. Затем нанесите раствор 3,7% параформальдегида (PFA) на 10 минут. Стирать 2 минуты 1x TBS, 2x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и должен рассматриваться только для жировых тканей или образцов, склонных к отслоению.
  4. Перейдите к первому раунду забора антигена. Этот протокол использует ИК-систему EZ-Retriever. Следуя инструкциям системы, нагрейте образцы в микроволновой печи, погрузив их в свежий буфер EZ-AR1 при температуре 95 °C на 15 минут. Оставить остывать на 20 минут.
  5. Стирайте в течение 2 минут с 1x TBS. Затем в течение 2 минут с 1x TBS-T (1x TBS с 0,1% Tween), 2x.

2. Применение белка

  1. Нарисуйте барьер вокруг каждого участка ткани с помощью гидрофобной барьерной ручки.
  2. Добавьте 1x раствор, блокирующий антитела (достаточно, чтобы покрыть всю область ткани) и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в камере влажности (при комнатной и неконтролируемой влажности).
  3. Впоследствии разведите первое первичное антитело тем же блокирующим раствором, нанесите достаточно, чтобы покрыть весь участок ткани, и оставьте инкубироваться на 1 ч при комнатной температуре в камере влажности.
    Примечание: Во время разработки этого протокола Anti-CD8 использовался в разведении 1:75.
  4. Стирать 2 мин в 1x TBS-T, 3x. Затем добавьте Anti-Ms + Rb HRP и оставьте образцы инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре в камере влажности (при температуре окружающей среды и при неконтролируемой влажности).
  5. Стирать 2 мин в 1x TBS-T, 3x. Разведите первый флуорофор с усилительным разбавителем в соотношении 1:100 и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре в камере влажности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке данного протокола использовался эмиссионный флуорофор с длиной волны 690 нм. С этого момента рекомендуется использовать минимальное освещение до конца процедуры после применения первого раунда флуорофора.
  6. Стирать 2 мин в 1x TBS-T, 3x. Начните второй раунд окрашивания антител со второго раунда извлечения антигена в микроволновой печи, снова погрузив образцы в свежий буфер EZ-AR1 при температуре 95 °C на 15 минут, а затем охладив в течение 20 минут.
  7. Стирайте в течение 2 минут с 1x TBS. Затем умывайтесь в течение 2 минут 1x TBS-T, 2x.
  8. Снова нанесите раствор, блокирующий антитела 1x в течение 30 минут в камере влажности при комнатной температуре (окружающая среда и неконтролируемая влажность).
  9. Разведите второе первичное антитело тем же блокирующим раствором, нанесите достаточно, чтобы покрыть весь участок ткани, и оставьте инкубироваться на ночь при 4 °С в камере влажности не менее чем на 16 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке этого протокола Anti-EpCAM использовался в разведении 1:200.
  10. Начните следующий день с стирки в течение 2 минут в 1x TBS-T, 3x. Затем добавьте Anti-Ms + Rb HRP и оставьте образцы для инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре в камере влажности (при температуре окружающей среды и неконтролируемой влажности).
  11. Стирать 2 мин в 1x TBS-T, 3x. Второй флуорофор развести разбавителем амплификации в соотношении 1:100 и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре в камере влажности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке данного протокола использовался эмиссионный флуорофор с длиной волны 620 нм.

3. Применение зонда

  1. Стирать 2 мин в 1x TBS-T, 3x.
  2. Начните третий и последний забор антигена с помощью EZ-AR1 Elegance в микроволновой печи при температуре 107 °C в течение 15 минут. Оставить остывать на 20 минут. Стирать 3 минуты в 1x TBS.
  3. Нанесите РНК-скоп Protease Plus (достаточно, чтобы покрыть всю область ткани) и держите при температуре 40 °C в течение 30 минут. Используйте духовку. Стирать 5 минут в 1x TBS, 2x.
  4. Проводят подготовку зонда путем денатурации при 90 °C в течение 4 мин зонда микроРНК LNA. Затем сразу же разведите зонд с помощью буфера miRNA-ISH. Закрутите и раскрутите раствор зонда.
    Примечание: При разработке данного протокола был использован целевой зонд miR-181c-3p в соотношении 1:250.
  5. Нанесите зонд (достаточно, чтобы покрыть весь участок ткани) и поставьте обратно в духовку на 1 час при температуре 60 °C. Мойте в течение 5 минут в 5-кратном буфере с солевым цитратом натрия (SSC).
  6. Выполните пять строгих стирок в SSC, предварительно подогретом до 60 °C в следующем порядке и разведениях в течение 5 минут каждый раунд: один раунд 5x SSC, два раунда 1x SSC и два раунда 0,2x SSC.
  7. Стирать в течение 5 минут в 0,2x SSC при комнатной температуре. Инкубировать с блокирующим буфером в течение 30 минут при комнатной температуре во увлажненной камере. Используйте комбинацию 1x TBS и 0,5% порошка блокирующего реагента, обязательно сделайте завихрение и вращение блокирующего раствора перед нанесением.
  8. Нанесите конъюгат HRP против дигоксигенина (мышиного) (для этих образцов использовали разведение 1:500) и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре во увлажненной камере.
  9. Промыть в течение 5 минут в 1x TBS-T, 3x Нанесите рекомендуемое разбавление 1:50 флуорофора Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) в течение 10 минут в камере влажности при комнатной температуре (окружающая среда и неконтролируемая влажность). Перед применением обязательно сделайте вихревой и вращающий раствор TSA+Cy3.
  10. Стирать 5 мин в 1x TBS-T, 3x.

4. Ядерное окрашивание и монтаж

  1. Нанесите рабочий раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (достаточно для покрытия всей площади тканей) в течение 5 мин при комнатной температуре во влажной камере (окружающая среда и неконтролируемая влажность).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовалось разведение в соотношении 1:1000, при этом рабочий запас DAPI был разведен в TBS.)
  2. Стирать 5 мин в 1x TBS-T, 3x. По завершении наклейте покровные стекла с помощью монтажного материала и дайте предметным стеклам высохнуть в течение 10 минут. Хранить предметные стекла при температуре 4 °C в темноте в период от 24 до 72 часов до визуализации и до трех месяцев после.

5. Визуализация и анализ

  1. Для получения изображений используйте слайдовый сканирующий микроскоп (предпочтительно) с 40-кратным увеличением.
  2. Выполните последующий количественный анализ для перечисления точек с использованием DAPI и противоокрашивания белков для сегментации клеток и фенотипирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого протокола мы использовали визуализацию с помощью Phenoimager HT. Полные сканирования слайдов были сняты с 40-кратным увеличением с использованием соответствующих фильтров для присутствующих флуорофоров, а мультиплексные изображения затем были экспортированы в виде файлов OME-TIFF. Затем отсканированные изображения были загружены в программное обеспечение для анализа изображений Visiopharm для количественного анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При тестировании этого протокола важно иметь два последовательных среза одного и того же репрезентативного образца для точности и сравнения. В этом случае для сравнения результатов был использован образец рака яичников высокой степени злокачественности (HGSC). Использовали контрольное стекло (рис. 2A-B), которое проходило только через окрашивание микроРНК, и тестовое стекло, которое подвергалось окрашиванию к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на то, что важность микроРНК признается и понимается, наблюдения как за нормальным развитием, так и за состоянием болезни в настоящее время затруднены из-за сложности изучения микроРНК с использованием стандартных методов. Дефицит методов in situ привел к разработке MARLIN (miRNA FISH assay). Учитывая гомологию и короткую длину микроРНК, визуализация их местоположения и влияния на посттранскриптомную регуляцию становится сложной задачей. В этой разработке протокола испо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность следующим людям, Чи Лам Ау Юнг и Манджунатху Ниммакаялу, которые входили в состав диссертационного комитета Басанта во время разработки анализа. Также Сэмюэл Мок, который сделал срез и предоставил использованные образцы. Наконец, мы выражаем признательность Йохану Доре и Дану Винковски, которые оказали всестороннюю помощь во время анализа и использования программного обеспечения Visiopharm. Это исследование было частично профинансировано Альянсом по исследованию рака яичников (OCRA 811621 и 891490), Фондом Sie и Фондом Стефани К. Стелтер. Это исследование было проведено в сотрудничестве с Центром проточной цитометрии и клеточной визуализации, который частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения через грант P30 CA016672 Онкологического центра М. Д. Андерсона и специалиста по исследованиям NCI Джареда Беркса 1 R50 CA243707-01A1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pH 10x с TRIS-буфером (TBS) pH 7,6 Термо Фишер Сайентифик  J62662  K7Для прерывистых промывочек между этапами
1x разбавитель/блок антитела к опаловому антителу;Akoya BiosciencesARD1001EAРаствор, блокирующий белок
Разбавитель усиления автоматизации 1x PlusAkoya Biosciences FP1609Используется для разбавления опальных флуорофоров
20x Концентрат  Буфер из солевого цитрата натрия (SSC)Сигма-ОлдричS6639-1LДля миРНК-промывок после гибридизации зонда
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Для ядерного окрашивания
Гибридная система ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Духовка, используемая для регулирования температуры в протоколе miRNAscope
Анти-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAbТехнологии сотовой сигнализации85336SПример первичного антитела, используемого для оптимизации этого протокола
Антидигоксигенин (мышиной) конъюгат HRPRevvity Health Sciences IncNEF832001EAВторичный реагент, используемый для обнаружения миРНК
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbТехнологии сотовой сигнализации93790Пример первичного антитела, используемого для оптимизации этого протокола
Порошок блокирующего реагентаAkoya Biosciences FP1012Решение для блокировки miRNA
Этиловый спирт 100% (200 proof)Pharmco111000200Для депарафинизации
Буфер EZ-AR1BioGeneXHK521-XAKИспользуется для антигенного извлечения срезов ткани FFPE на стадии белка
Буфер элегантности EZ-AR1BioGeneXHK546-XAKИспользуется для извлечения антигенов из срезов ткани FFPE на этапе миРНК-зонда
ИК-система EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRМикроволновка, используемая для извлечения антигенов из срезов ткани FFPE
раствор перекиси водорода 30% Sigma-Aldrich HX0640-5 Для подготовки тканей. Помогает блокировать активность эндогенной пероксидазы и получать ярко окрашенные продукты
miR-181c-3p миРНК-зондЦягэн339112Пример миРНК-зонда, используемого для оптимизации этого протокола
miRCURY LNA miRNA ISH Буферный набор (FFPE)Цягэн339450 Используется для разведения миРНК-зонда
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTФлуорофор для выявления первичных антител
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTФлуорофор для выявления первичных антител
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EAВторичные антитела, используемые в качестве агента обнаружения
Pierce 16% формальдегида (в/), без метанолаТермо Фишер Сайентифик28908Для получения 3,7% PFA для подготовки тканей
ProLong Diamond AntifadeТермо Фишер СайентификP36970Монтажные носители
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331Для проникновения срезов ткани  путём частичного переваривания белков и экспонировать молекулы миРНК
Вода без РНКа Corning 46-000-CM Очищать и готовить всё оборудование, а при необходимости использовать его как разбавляющее средство   
Tween 20Сигма-ОлдричP1379-25MLСоздать TBS-T
Усиление сигнала тирамида плюс цианин 3Akoya Biosciences NEL744001KTФлуорофор для идентификации миРНК
Зонды U6 и Scramble miRNAЦягэн339459Опциональные управляющие зонды
Гистологический класс ксиленТермо Фишер СайентификUN1307Для депарафинизации

Ссылки

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FFPEEpCAM
Амплификация и распознавание микроРНК с помощью гибридизации заблокированных нуклеиновых кислот in situ как новый метод обнаружения и количественной оценки
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.