Method Article

Последовательное обнаружение биомолекул в фиксированных формалином и залитых парафином образцах с помощью масс-спектрометрической визуализации

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол масс-спектрометрической визуализации для последовательного обнаружения метаболитов, N-связанного гликана и триптического пептида в образцах тканей, зафиксированных формалином и залитых парафином.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани представляют собой сложную клеточную среду, состоящую из огромного количества типов клеток и биомолекул, взаимодействующих друг с другом для выполнения функций органа. Традиционно, методы анализа биомолекул, таких как метаболиты, гликаны и белки, включали гомогенизацию тканей, разрушая всю пространственную информацию. Эти традиционные методы препятствовали полному пониманию сложных внутри- и внеклеточных молекулярных взаимодействий. Масс-спектрометрическая визуализация (MSI), с другой стороны, не только сохраняет пространственную информацию о биомолекулах в ткани, но и позволяет обнаруживать несколько классов аналитов из одного и того же участка ткани с помощью последовательного анализа с разрешением, близким к одноклеточному. Это позволяет нам получить более полную картину молекулярных взаимодействий между различными классами биомолекул. Представленный здесь протокол описывает этапы выполнения масс-спектрометрической визуализации метаболитов, N-связанных гликанов и триптических пептидов последовательно из одного и того же участка ткани с разрешением 20 мкм. Тщательное рассмотрение порядка отображения классов аналитов, наряду с тщательной обработкой сечений для обеспечения целостности, позволяет собирать несколько высококачественных изображений из одного и того же раздела. Эти данные впоследствии могут быть интегрированы с другими пространственными омиксными данными (транскриптомикой, иммуногистохимией и т. д.), собранными из серийных срезов, где та же клетка может быть проанализирована в этих смежных срезах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Масс-спектрометрическая визуализация (MSI) — это мощный метод, который позволяет обнаруживать и визуализировать сотни и тысячи биомолекул из тонких срезов тканей без необходимости априорного знания точных молекул, присутствующих в ткани, что делает его отличным инструментомдля обнаружения биомаркеров. В то время как в различных лабораториях используется несколько типов MSI, в том числе десорбционная электроаэрозольная ионизация (DESI)2,3, инфракрасная матричная лазерная десорбционная электроаэрозольная ионизация (IR-MALDESI)4 и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS)5, матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) остается наиболее часто используемой и универсальной. Большинство классов биомолекул могут быть обнаружены с помощью MSI путем индивидуальной подготовки образца, включая промывку/предварительную обработку ткани, ферментативное разложение и используемую матрицу/растворитель 6,7. MALDI MSI используется для обнаружения метаболитов, липидов, гликанов, белков и протеолитических пептидов.

Исследования MSI использовались в различных клинических и доклинических исследованиях для лучшего понимания механизмов заболевания 8,9, улучшения классификации и определения стадии рака10,11, прогнозирования исхода лечения12, улучшения диагностики13 и определения молекулярных границ опухоли14 и т.д. Большинство этих исследований были сосредоточены на обнаружении только одного класса аналитов. Тем не менее, часто представляет интерес анализ более одного класса биомолекул из одного и того же образца. Традиционно это делается с помощью серийных срезов тканей. Но совсем недавно были показаны примеры последовательного анализа нескольких классов аналитов из одного и того же участка ткани. Например, Yagnik et al. продемонстрировали визуализацию липидов замороженной ткани с последующей иммуногистохимией MALDI из того же раздела для классификации типов клеток15. Clift et al. продемонстрировали последовательное применение PNGaseF, коллагеназы и трипсина к фиксированным формалином, залитым парафином (FFPE) тканевым срезам для визуализации N-связанных гликанов, белков внеклеточного матрикса и общих белков соответственно16. Escobar et al. продемонстрировали последовательный анализ N-связанных гликанов, O-GlcNAc и триптических пептидов из одного и того же участка замороженной ткани17. Эти типы экспериментов достигаются путем тщательного планирования экспериментов, чтобы сначала проанализировать наиболее легко теряемые аналиты, а затем те, которые более стабильны в ткани. Во многих случаях смывки, используемые для удаления нежелательных классов молекул, помогают усилить другие классы молекул6, и этим свойством можно воспользоваться, когда каждая промывка, удаляющая ранее нанесенную матрицу, также помогает усилить сигнал следующего класса анализируемых веществ, подлежащих визуализации.

Недавно мы опубликовали схему последовательного анализа метаболитов, N-связанных гликанов и триптических пептидов из одного и того же участка ткани рака яичников FFPE18. Здесь мы подробно описываем рабочий процесс анализа этих трех классов биомолекул из одного и того же участка ткани; обзор протокола подробно представлен на рисунке 1. Насколько нам известно, это первый протокол, подробно описывающий этот рабочий процесс для последовательной визуализации из ткани FFPE. Вкратце, срезы тканей депарафинизируют ксилолом перед покрытием матрицей 1,5-диаминонафталина (10 мг/мл в 50% ацетонитриле) для визуализации метаболитов отрицательного ионного режима. Затем матрикс удаляют, срезы регидратируют и извлекают антиген, прежде чем распылять PNGase F (0,1 мкг/мкл в бикарбонате аммония) для высвобождения N-связанных гликанов in situ. После инкубации срезы покрывают матрицей α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) (10 мг/мл в 70% ацетонитриле, 0,1% трифторуксусной кислоте) и визуализируют в режиме положительных ионов. Затем матрикс снова удаляют, регидратацию и извлечение антигена повторяют, а срезы опрыскивают трипсином (0,075 мкг/мкл в бикарбонате аммония) и инкубируют перед тем, как их снова покрывают матрицей CHCA (10 мг/мл в 70% ацетонитриле, 0,1% трифторуксусной кислоте) и визуализируют в режиме положительных ионов. Все растворы должны быть сделаны свежими, непосредственно перед использованием, и, если это вообще возможно, эксперименты должны проводиться в течение 3 дней подряд. В случае задержек секции следует хранить в морозильной камере при температуре -80 °C под высыханием.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе используются фиксированные формалином ткани, залитые парафином (FFPE), собранные у ранее не леченных пациенток, перенесших первичную циторедуктивную операцию по поводу серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности. Все клинические данные были получены из репозитория рака яичников отделения гинекологической онкологии и репродуктивной медицины в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом им. М. Д. Андерсона Техасского университета. Письменное информированное согласие пациентов было получено персоналом регистратуры, а исследования проводились в соответствии с признанными этическими принципами.

1. Подготовка образцов для визуализации метаболитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что срезы фиксированной формалином и залитой парафином ткани (толщиной 4 мкм) уже были установлены на предметные стекла микроскопа, поскольку клинические образцы, как правило, должны быть срезы внутри ядра клинической патологии гистотехниками. Поскольку представленная здесь работа выполняется с помощью эталонного прибора TOF, ортогональное измерение TOF устраняет необходимость в проводящих предметных стеклах, традиционно используемых в экспериментах MSI. Использование стандартных предметных стекол микроскопа также в большей степени способствует стандартным рабочим процессам в лабораториях клинической патологии, а также позволяет использовать архивные ткани уже на предметных стеклах.

  1. Сделайте реперные отметки на четырех углах предметного стекла с помощью алмазного начертателя.
  2. Депарафинизируйте срезы путем погружения в гистологический ксилол на 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол вреден и должен использоваться в вытяжном шкафу для химических веществ.
  3. Погрузите секции в свежий ксилол на 3 мин.
  4. Дайте предметному стеклу высохнуть при комнатной температуре.
  5. Поместите предметное стекло в мишень адаптера слайдов.
  6. Получите оптическое изображение предметного стекла с помощью планшетного сканера с разрешением 4 800 точек на дюйм.
  7. Сделайте матрицу MALDI, растворив 15 мг 1,5-диаминонафталина (DAN) в 1,5 мл 50% ACN. Обработать ультразвуком до полного растворения, ~5 мин. Отфильтруйте матричный раствор перед загрузкой в контур образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DAN является подозреваемым канцерогеном и должен использоваться с надлежащими средствами индивидуальной защиты. Напыление матрицы следует выполнять в вытяжном шкафу для химикатов.
  8. Распылите на горку раствор DAN с помощью роботизированного распылителя реагентов со следующими параметрами: Track Speed - 1 200 мм/с; Расстояние между колеями - 3 мм; Температура сопла - 60 °C; Высота сопла - 40 мм; Расход - 100 μл/мин; Пропусков - 4; N 2 Давление - 10 psi; Узор - CC
  9. Внесите 0,5 мкл красного фосфора, взвешенного в метаноле, в известное место на предметном стекле.

2. Сбор данных визуализации метаболитов

  1. Поместите подготовленные предметные стекла в адаптер слайдов II и загрузите в масс-спектрометр timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. Загрузите соответствующий метод для сбора данных о режиме отрицательных ионов в timsControl с выключенными tims. Если прибор еще не находился в режиме отрицательных ионов, подождите не менее 25 мин после переключения полярности для уравновешивания перед калибровкой и сбором данных со следующими параметрами прибора по метаболитам: м/з диапазон - 50 - 600; Диапазон лазерного сканирования - 16,0 мкм как по X, так и по Y; Результирующий размер поля - 20,0 мкм как по X, так и по Y; Лазерные выстрелы - 150; Лазерный флюенс - ~30%; Воронка 1 RF - 150,0 В между пиками; Воронка 2 RF - 200,0 В между пиками; Мультипольные ВЧ - 200,0 В между пиками; Энергия столкновения - 10,0 эВ; Коллизионный RF - 500,0 В между пиками; Время передачи - 55,0 μс; Хранение PrePulse - 5,0 μс (дополнительный рисунок S1).
  3. Выполните функции « Профиль цели» (нажмите кнопку «Создать сейчас ») и «Настройка фокуса » (нажмите кнопку «Настроить сейчас ») на вкладке «Образец носителя». При необходимости отрегулируйте положение лазера по осям X и Y на лазерном язычке , чтобы убедиться, что лазер точно выровнен по перекрестию.
  4. Соберите спектр красного фосфора, сложив не менее пяти наборов лазерных выстрелов с места на слайде.
  5. Выполните калибровку, нажав кнопку «Калибровать» на вкладке «Калибровка». Удалите все пики с очень низкой интенсивностью или высокой погрешностью ppm.
    Примечание: Даже кластеры фосфора (P2 и P4) обычно дают очень слабый сигнал. Оценка калибровки должна быть равна 100% перед нажатием кнопки «Принять». Если нет, очистите суммированный спектр и приобретите новый.
  6. Запустите программное обеспечение flexImaging . Графический интерфейс пользователя для получения изображений запустится автоматически.
  7. Выберите Настроить новый прогон образа в окне Выбор прогона образа .
  8. Выберите Классический рабочий процесс в окне Выбор рабочего процесса.
  9. В окне Хранение данных укажите имя прогона создания образов и директорию результатов для данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробелы не должны использоваться в именах файлов.
  10. В окне Настройки сбора данных выберите Пользовательские области измерений и введите 20 в поле Ширина растра . Нажмите кнопку Обзор, чтобы выбрать ранее созданный метод timsControl .
  11. В окне Образец изображения нажмите кнопку Обзор , чтобы выбрать оптическое изображение, полученное с помощью планшетного сканера.
  12. В окне «Обучение образцу » выполните выравнивание по трем точкам между оптическим изображением и слайдом; Затем переместите держатель образца к первому вытравленному реперному знаку на предметном стекле и совместите перекрестие в timsControl с характерным элементом травления. Увеличьте изображение (рекомендуется 100% масштабирование), установите образец изображения на Установить точки обучения и щелкните по тому же месту на оптическом изображении. Повторите этот процесс еще 2 раза, чтобы получить в общей сложности три точки обучения. Нажмите кнопку Далее , чтобы завершить обучение.
  13. Нажмите кнопку OK , чтобы выйти из мастера создания новых образов.
  14. Проверьте точность обучения, нажав на кнопку «Положение носителя образца » в программном обеспечении. Увеличьте масштаб и щелкните по отличительной особенности четвертой (неиспользуемой) реперной точки на изображении; носитель образца переместится в это положение в timsControl. Убедитесь, что перекрестие совпадает с выбранным объектом. Если они не совпадают, очистите обучение в flexImaging и повторите процесс обучения для повышения точности.
  15. В программном обеспечении выберите инструмент «Добавить область измерения полигона » и обведите контур тканей для изображения. Каждый щелчок мыши будет создавать опорную точку. Нажмите кнопку Backspace на клавиатуре, чтобы удалить точки одну за другой. После того, как регион нарисован, дважды щелкните мышью, чтобы замкнуть многоугольник.
  16. Проверьте сигнал, выстрелив лазером в несколько мест внутри ткани. Нажмите на место на рисунке с помощью кнопки «Положение носителя образца », как в шаге 2.14, для проверки учения. В спектре будут преобладать матричные пики вокруг m/z 157 и 313; Увеличьте область M/Z ниже 154 и 250-300, чтобы показать множество пиков метаболитов и жирных кислот на малых молекулах соответственно. Регулируйте флюенс лазера по мере необходимости для оптимального сигнала.
  17. Сохраните метод timsControl.
  18. Запустите получение изображения, нажав кнопку Start AutoXecute Run в программном обеспечении
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация в режиме отрицательных ионов с матрицей DAN приводит к обнаружению многочисленных метаболитов из цикла ТСА, аминокислот и жирных кислот, среди прочего.

3. Подготовка образцов для визуализации N-связанного гликана

  1. После извлечения образца из масс-спектрометра удалите матрицу DAN, погрузив предметное стекло в 100% этанол (200 proof) на 1 минуту.
  2. Увлажните горку в банках Coplin: Свежий 100% этанол в течение 1 минуты; 95% этанол в течение 1 мин; 70% этанол в течение 1 мин; Вода в течение 3 мин; Пресная вода в течение 3 мин.
  3. Дайте предметному стеклу высохнуть в течение ~15 минут.
  4. Выполните извлечение антигена, погрузив предметное стекло в 100 мМ Tris буфер (полученный путем растворения 6,06 г Tris Base в 500 мл воды и регулировки pH по мере необходимости) pH 9 в банку Coplin с неплотно расположенной крышкой, которая помещается в камеру для снятия маскировки с 500 мл воды в камере. Нагревать до 95 °C в течение 20 минут.
  5. Выньте банку Coplin из камеры для снятия маскировки и поставьте ее на столешницу, чтобы она остыла в течение 20 минут.
  6. Буфер замените предметное стекло на воду в течение пяти смен. Для первых трех вылейте половину раствора и замените его водой. Для последних двух вылейте весь раствор и замените его водой.
  7. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть.
  8. Создайте камеру влажности для инкубации предметного стекла после внесения PNGaseF. Вырежьте круг из впитывающей салфетки, чтобы покрыть дно чашки Петри диаметром 100 мм. Сверните две лабораторные салфетки, чтобы получилась подушка по обе стороны от чашки Петри (Рисунок 2). Добавьте 8 мл воды, чтобы пропитать эти салфетки, накройте чашку Петри крышкой и поставьте в духовку при температуре 37 °C не менее чем на 30 минут для предварительного нагрева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя часть блюда должна казаться парной.
  9. Приготовьте PNGaseF путем восстановления 100 г лиофилизированного фермента в 200 μл 100 мМ бикарбоната аммония, pH 7,8 и вортекса для смешивания. Перелейте раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и разведите до 1 мл водой.
  10. Распылите на предметное стекло PNGaseF с помощью роботизированного распылителя реагентов со следующими параметрами. Используйте шприцевой насос для работы с малым объемом/низким расходом: скорость гусеницы - 1200 мм/с; Расстояние между колеями - 3 мм; Температура сопла - 45 °C; Высота сопла - 40 мм; Расход - 25 μл/мин; Пропуски - 15; N 2 Давление - 10 psi; Узор - CC
  11. Поместите предметное стекло в разогретую чашку Петри салфеткой вверх, одним концом на каждую из подушек для салфетки. Установите на место предметное стекло и заклейте чашку Петри клейкой герметизирующей пленкой. Поставьте в духовку при температуре 37 °C и поставьте грелку для рептилий, установленную на 40 °C, поверх чашки Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сохраняет крышку самой теплой частью посуды и предотвращает образование конденсата на крышке и его попадание на ткани, что может привести к появлению артефактов на изображениях.
  12. Инкубируйте предметное стекло в течение 2 часов, чтобы дать возможность пищеварению продолжаться.
  13. Снимите предметное стекло с чашки Петри и дайте высохнуть ~5 минут.
  14. Сделайте матрицу MALDI, растворив 15 мг α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) в 1,5 мл 70% ACN, 0,1% TFA, 10 мМ фосфата аммония.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ТЖК является едким веществом и его следует использовать в капюшоне с надлежащими средствами индивидуальной защиты.
  15. Обработать ультразвуком до полного растворения, ~5 мин.
  16. Отфильтруйте матричный раствор перед загрузкой в контур образца.
  17. Распылите на горку CHCA с помощью роботизированного распылителя реагентов со следующими параметрами: Скорость колеи - 1 200 мм/с; Расстояние между колеями - 3 мм; Температура сопла - 75 °C; Высота сопла - 40 мм; Расход - 120 μл/мин; Пропусков - 3; N 2 Давление - 10 psi; Выкройка - HH
  18. Внесите 0,5 мкл красного фосфора, взвешенного в метаноле, в известное место на предметном стекле.

4. Сбор данных визуализации N-связанного гликана

  1. Поместите подготовленный предметный стек (слайды) в мишень адаптера слайда и загрузите в масс-спектрометр MALDI QTOF.
  2. Загрузите соответствующий метод для сбора данных о положительном ионном режиме в timsControl. Если прибор еще не находился в режиме положительных ионов, подождите не менее 25 мин после переключения полярности для уравновешивания перед калибровкой и сбором данных со следующими параметрами прибора по гликанам: м/з диапазон - 700-3500; Диапазон лазерного сканирования - 16,0 мкм как по X, так и по Y; Результирующий размер поля - 20,0 мкм как по X, так и по Y; Лазерные выстрелы - 200; Лазерный флюенс - ~25%; Воронка 1 РФ - 450,0 В между пиками; Воронка 2 РФ - 500,0 В между пиками; Мультипольные ВЧ - 500,0 В между пиками; Энергия столкновения - 10,0 эВ; Коллизионное радиочастотное излучение - 2 700,0 В между пиками; Время передачи - 140,0 μс; Хранение PrePulse - 14,0 μс (дополнительный рисунок S2).
  3. Выполните функции « Профиль цели » (нажмите кнопку «Создать сейчас ») и «Настройка фокуса » (нажмите кнопку «Настроить сейчас ») на вкладке «Носитель образца ». Отрегулируйте положение лазера по осям X и Y, если это необходимо, на вкладке «Лазер », чтобы убедиться, что лазер совмещен с перекрестием.
  4. Соберите спектр красного фосфора, сложив не менее пяти наборов лазерных выстрелов с места на слайде.
  5. Выполните калибровку, нажав кнопку «Калибровать» на вкладке «Калибровка». Удалите все пики с очень низкой интенсивностью или высокой погрешностью ppm.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка калибровки должна быть 100% перед нажатием кнопки «Принять». Если нет, очистите суммированный спектр и приобретите новый.
  6. Откройте файл .mis, который ранее использовался для визуализации метаболитов в программном обеспечении.
  7. Сохраните файл с новым именем, указывающим, что это данные гликанов.
  8. В разделе «Правка» | Imaging Run Properties, измените метод сбора данных на желаемый гликановый метод.
  9. Очистите предыдущее обучение с помощью Правка | Четкие точки обучения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затвор не будет находиться в том же самом положении после его извлечения и повторной загрузки в адаптер слайда.
  10. Выполнение нового обучения с помощью функции «Правка» | Установите точки обучения; установите 3 точки , как это было сделано в оригинальном Мастере обработки изображений (Шаг 2.12).
  11. Проверьте точность обучения, нажав на кнопку «Положение носителя образца » в программном обеспечении. Увеличьте масштаб и щелкните по отличительной особенности четвертой (неиспользуемой) реперной точки на изображении. Носитель образца переместится в это положение в timsControl; Убедитесь, что перекрестие совпадает с выбранным объектом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если перекрестие прицела не совпадает, очистите обучение и повторите процесс обучения для повышения точности.
  12. Сохраните файл.
  13. Проверьте сигнал, выстрелив лазером в несколько мест внутри ткани. Нажмите на место на изображении с помощью кнопки «Положение носителя образца », как показано в шаге 4.11, чтобы проверить обучение. Подтвердите, что в спектре имеется большое количество гликановых пиков с доминирующими пиками, как правило, на m/z 1,663 и 1,809. Регулируйте флюенс лазера по мере необходимости для оптимального сигнала.
  14. Сохраните метод timsControl.
  15. Запустите получение изображения, нажав кнопку «Запустить AutoXecute Run ».

5. Пробоподготовка для визуализации триптического пептида

  1. Снимите матрицу CHCA, погрузив предметное стекло в 100% этанол (200 proof) на ~1 минуту
  2. Увлажните горку в банках Coplin следующим образом: Свежий 100% этанол в течение 1 минуты; 95% этанол в течение 1 мин; 70% этанол в течение 1 мин; Вода в течение 3 мин; Пресная вода в течение 3 мин.
  3. Дайте предметному стеклу высохнуть в течение ~15 минут.
  4. Выполните извлечение антигена, погрузив предметное стекло в 100 мМ Трис-буфер, pH 9, в банку Coplin с неплотно расположенной сверху крышкой, которая помещается в камеру демаскировки с 500 мл воды в камере. Нагревать до 95 °C в течение 20 минут.
    Примечание: Это второе извлечение антигена необходимо для денатурации белков для более эффективного доступа трипсина к сайтам расщепления.
  5. Выньте банку Coplin из камеры для снятия маскировки и поставьте ее на столешницу, чтобы она остыла в течение 20 минут.
  6. Буфер замените предметное стекло на воду в течение пяти смен. Для первых трех вылейте половину раствора и замените его водой. Для последних двух вылейте весь раствор и замените его водой.
  7. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть.
  8. Приготовьте трипсин, восстановив 100 г лиофилизированного фермента в 200 μл 100 мМ уксусной кислоты и перемешайте его вверх и вниз. Аликвот в подходящие для эксперимента размеры (обычно 40 мкл) и хранить при температуре -20 °C.
  9. Приготовьте аликвоту трипсина в 40 мкл, добавив 350 мкл 100 мкМ бикарбоната аммония, pH 7,8 и 39 мкл ACN. Хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетонитрил (10% ACN) повышает активность трипсина по сравнению с водным раствором и снижает поверхностное натяжение раствора для распыления19.
  10. Распылите на предметное стекло Трипсин с помощью роботизированного распылителя реагентов со следующими параметрами. Используйте шприцевой насос для работы с малым объемом/низким расходом: Скорость гусеницы - 750 мм/с; Расстояние между колеями - 3 мм; Температура сопла - 30 °C; Высота сопла - 40 мм; Расход - 10 μл/мин; Пассы - 12; N 2 Давление - 10 psi; Выкройка - HH
  11. Положите квадрат впитывающей салфетки на дно чашки Петри диаметром 100 мм; Следите за тем, чтобы углы соприкасались только с краем посуды, и распределите по салфетке 1 мл воды.
  12. Положите горку поверх салфетки салфеткой вверх, накройте чашку Петри крышкой и запечатайте чашку Петри клейкой герметизирующей пленкой.
  13. Инкубируйте предметное стекло в течение 4 часов при температуре 37 °C, чтобы дать возможность пищеварению продолжаться.
  14. Снимите предметное стекло с чашки Петри и дайте ему высохнуть в течение ~5 минут.
  15. Сделайте матрицу MALDI, растворив 15 мг α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) в 1,5 мл 70% ACN, 0,1% TFA, 10 мМ фосфата аммония.
  16. Обработать ультразвуком до полного растворения, ~5 мин.
  17. Отфильтруйте матричный раствор перед загрузкой в контур образца.
  18. Распылите на горку CHCA с помощью роботизированного распылителя реагентов со следующими параметрами: Скорость гусеницы - 1200 мм/с; Расстояние между колеями - 3 мм; Температура сопла - 75 °C; Высота сопла - 40 мм; Расход - 120 μл/мин; Пропусков - 4; N 2 Давление - 10 psi; Выкройка - HH
  19. Внесите 0,5 мкл красного фосфора, взвешенного в метаноле, в известное место на предметном стекле.

6. Сбор данных визуализации триптических пептидов

  1. Поместите подготовленные слайды в адаптер для слайдов и загрузите их в масс-спектрометр timsTOF MALDI QTOF.
  2. Загрузите соответствующий метод для сбора данных о положительном ионном режиме в timsControl. Если прибор еще не находился в режиме положительных ионов, подождите не менее 25 минут после переключения полярности для уравновешивания перед калибровкой и сбором данных с использованием следующих параметров прибора для пептидов: м/з диапазон - 600-4500; Диапазон лазерного сканирования - 16,0 мкм как по X, так и по Y; Результирующий размер поля - 20,0 мкм как по X, так и по Y; Лазерные выстрелы - 200; Лазерный флюенс - ~25%; Воронка 1 РФ - 450,0 В между пиками; Воронка 2 РФ - 500,0 В между пиками; Мультипольный ВЧ - 600,0 В между пиками; Энергия столкновения - 10,0 эВ; Коллизионный RF - 3400.0 Vpp; Время передачи - 180,0 μс; Хранение PrePulse - 18,0 μс (дополнительный рисунок S3).
  3. Выполните функции « Профиль цели» (нажмите кнопку «Создать сейчас ») и «Настройка фокуса » (нажмите кнопку «Настроить сейчас ») на вкладке «Образец носителя». При необходимости отрегулируйте положение лазера по осям X и Y на лазерном язычке , чтобы убедиться, что лазер совмещен с перекрестием.
  4. Соберите спектр красного фосфора, сложив не менее пяти наборов лазерных выстрелов с места на слайде.
  5. Выполните калибровку, нажав кнопку «Калибровать» на вкладке «Калибровка». Удалите все пики с очень низкой интенсивностью или высокой погрешностью ppm. Убедитесь, что оценка калибровки равна 100 %, прежде чем нажать кнопку «Принять». Если нет, очистите суммированный спектр и приобретите новый.
  6. Откройте файл .mis, ранее использовавшийся для визуализации гликанов.
  7. Сохраните файл с новым именем, указывающим, что это данные пептида.
  8. В разделе «Правка» | Imaging Run Properties (Свойства прогона визуализации) измените метод сбора данных на нужный пептидный метод.
  9. Очистите предыдущее обучение с помощью Правка | Четкие точки обучения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затвор не будет находиться в том же самом положении после его извлечения и повторной загрузки в адаптер слайда.
  10. Выполнение нового обучения с помощью функции «Правка» | Установите точки обучения; установите три точки, как это было сделано в оригинальном Мастере обработки изображений (Шаг 2.12).
  11. Проверьте точность обучения, нажав на кнопку «Положение носителя образца ». Увеличьте масштаб и щелкните по отличительной особенности четвертой (неиспользуемой) реперной точки на изображении. Носитель образца переместится в это положение в timsControl; Убедитесь, что перекрестие совпадает с выбранным объектом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если перекрестие прицела не совпадает, очистите обучение и повторите процесс обучения для повышения точности.
  12. Сохраните файл.
  13. Проверьте сигнал, направив лазер в несколько мест внутри ткани. Нажмите на место на изображении с помощью кнопки «Положение носителя образца », как показано в шаге 6.11 для проверки обучения. Подтвердите, что спектр имеет обильные пептидные пики с доминирующими пиками, как правило, на m/z 944, 1,105 и 1,198. Регулируйте флюенс лазера по мере необходимости для оптимального сигнала.
  14. Сохраните метод timsControl.
  15. Запустите получение изображения, нажав кнопку «Запустить AutoXecute Run ».

7. Гистологическое окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько методов лечения гематоксилина и эозина. Здесь представлен модифицированный метод Карацци, часто используемый в этой лаборатории.

  1. Снимите матрицу CHCA, погрузив предметное стекло в 100% этанол на 1 минуту.
  2. Затворное стекло окрасить следующим образом: 95% этанол в течение 30 с; 70% этанол в течение 30 с; Вода на 30 с; Гематоксилин в течение 2 мин; Вода на 30 с; 70% этанол в течение 30 с; 95% этанол в течение 30 с; Эозин в течение 1 минуты; 95% этанол в течение 30 с; 100% этанол в течение 30 с; ксилол в течение 2,5 мин; Покровное стекло с монтажным материалом.
  3. Дайте предметному стеклу высохнуть в течение >1 часа и удалите все пузыри, осторожно надавливая на покровное стекло.
  4. Оцифровывайте с помощью цифрового сканера слайдов.

8. Визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует обширный анализ, который может быть проведен с помощью SCiLS Lab и выходит за рамки этого протокола. Здесь мы просто опишем основы создания файлов, визуализацию данных и поиск пиков в базах данных для предполагаемой идентификации.

  1. Запустите SCiLS Lab 2025b и выберите «Создать».
  2. Выберите файл (файлы) данных, которые будут загружены в программное обеспечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью SCiLS Lab Pro несколько файлов данных, собранных с одинаковыми параметрами, могут быть загружены вместе для нормализации друг к другу и одновременной визуализации.
  3. Расположите образцы в предпочтительном макете. Переместите образцы, щелкнув левой кнопкой мыши и перетащив их. Поверните образцы, щелкнув правой кнопкой мыши и перетащив их. Нажмите кнопку Далее.
  4. В окне «Настройки оси массы » внесите необходимые корректировки. Значения по умолчанию обычно хорошо работают для данных timsTOF. Нажмите Далее.
  5. В окне "Поиск функций " задайте соответствующие значения для автоматического выбора пиковых значений во время импорта. Нажмите Далее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это не очень хорошо работает для данных о метаболитах из ткани FFPE, и его следует пропустить.
  6. Настройки импорта будут визуализированы в окне «Сводка по импорту ». Нажмите «Импорт».
  7. Укажите имя файла и место для сохранения файла SCiLS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера файла, импорт может занять от нескольких минут до нескольких часов.
  8. По завершении будет видно окно сводки . Нажмите кнопку «Открыть импортированный набор данных » для взаимодействия с файлом SCiLS.
  9. В правом верхнем углу программного обеспечения щелкните раскрывающийся список рядом с пунктом «Нормализация » и выберите «Среднеквадратичный корень».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это наиболее подходящий метод для данных timsTOF, учитывая разреженность импортируемых данных центроида, и он обеспечит наилучшую визуализацию.
  10. В разделе Файл | Свойства файла, установите ширину интервала на соответствующее значение, обычно 10 - 15 ppm для данных timsTOF. Убедитесь, что значение является приемлемым, оценив, охватывает ли оно ширину пика в среднем спектре.
  11. Увеличьте средний спектр в нижней части программного обеспечения, щелкнув и перетащив или прокрутив колесико мыши вперед.
  12. Выберите пик для визуализации, расположив перекрестие на вершине и щелкнув левой кнопкой мыши колесико мыши.
  13. Добавьте интересующие ионы в список активных ионных изображений, нажав клавиши Control + пробел.
  14. Сохраните курируемый список функций, нажав кнопку «Сохранить как список функций » в нижней части окна ионных изображений в правой части программного обеспечения.
  15. Откройте сохраненный список функций, нажав на Файл | Таблица характеристик и поиск с помощью MetaboScape предполагаемых идентификаторов метаболитов или гликанов, если MetaboScape установлен и настроен в той же сети. В качестве альтернативы можно преобразовать файлы SCiLS в файлы .imzML для импорта в METASPACE (https://metaspace2020.org/) для предполагаемой идентификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полное описание возможностей SCiLS Lab можно найти в Руководстве пользователя в пункте меню «Справка ».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Завершение этого протокола должно привести к получению трех надежных наборов данных MSI из одного и того же участка ткани. При визуализации полного спектра метаболитных данных в спектре будут преобладать матричные пики в m/z 157 и 315. Это нормально для тканей FFPE. Многие сигналы метаболитов и жирных кислот можно будет наблюдать при увеличении м/з в диапазоне <155 и от 250 до 300. На рисунке 3 показаны примеры полного спектра и увеличенных диапазонов, подчеркивающие спектры сложных метаб...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сбор последовательных данных MSI из одного среза ткани требует тщательного внимания к деталям. Есть несколько шагов, которые абсолютно необходимы для получения высококачественных данных. Во-первых, следует соблюдать осторожность, если одновременно готовится более одного предметного стекла. При размещении слайдов в банках Coplin или перемещении между ними будьте осторожны, чтобы не поместить два предметных стекла в одно и то же положение в банке. Это приведет к недостаточному воздействию ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS и Центр масс-спектрометрической визуализации Техасского университета в Остине получили награду Техасского института профилактики и исследований рака (RP240559). Это исследование было частично профинансировано Альянсом по исследованию рака яичников (OCRA 811621 и 891490), Фондом Sie и Фондом Стефани К. Стелтер. Это исследование было проведено в сотрудничестве с Центром проточной цитометрии и клеточной визуализации, который частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения через грант P30 CA016672 Онкологического центра М. Д. Андерсона и специалиста по исследованиям NCI Джареда Беркса 1 R50 CA243707-01A1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-диаминонафталинНаучный центр ФишераD010125GMALDI Matrix для визуализации метаболитов
АцетонитрилНаучный центр ФишераА955-4Растворитель марки LC-MS, используемый для подготовки матрицы
&альфа;-циано-4-гидроксикоричная кислотаСигма-Олдрич70990-1Г-ФМатрица MALDI для визуализации гликана и пептидов
Бикарбонат аммонияНаучный центр ФишераА643-500Буфер для ферментов
Фосфат аммонияСигма-Олдрич467782-50ГАддитивный для уменьшения матричных кластеров во время визуализации
Камера для демаскировки NxGenБиокаре МедикалН/ДИспользуется для забора антигена из тканей
ЭтанолНаучный центр Фишера04-355-223Растворитель марки LC-MS, используемый для подготовки матрицы и окрашивания
M5 Роботизированный распылитель реагентовВизуализация HTXН/ДИспользуется для нанесения ферментов и матриц на ткани
МетанолНаучный центр ФишераА456-4Растворитель марки LC-MS для приготовления суспензии красного фосфора
Трипсин MS классаНаучный центр ФишераPI90058Фермент для переваривания белка
Адаптер MTP Slide IIBruker Daltonics8235380Адаптер для вставки предметных стекол в масс-спектрометр
Цифровой сканер слайдов NanoZoomer SQКорпорация ХамамацуН/ДИспользуется для создания цифровых микроскопических изображений окрашенных тканей
Планшетный сканер Perfection V600ЭпсонН/ДИспользуется для формирования оптического изображения предметного стекла для сбора данных MSI
Петри-силНаучный центр Фишера50-212-518Для укупорки чашки Петри во время ферментативного пищеварения
PNGaseFБиография бульдогаNZPP550LYФермент для расщепления N-связанных гликанов из белков
Красный фосфорСигма-Олдрич04004-250ГКалибр MALDI для режима положительных и отрицательных ионов
Лаборатория SCiLS (2025b)Bruker DaltonicsН/ДПрограммное обеспечение для визуализации данных MSI
timsTOF fleX Масс-спектрометр QTOFBruker DaltonicsН/ДИспользуется для сбора данных масс-спектрометрии
Трифторуксусная кислотаНаучный центр Фишера85183Матричная добавка для снижения pH для визуализации в положительном ионном режиме
База ТрисНаучный центр ФишераБП152-500Буфер для забора антигена
ВодаНаучный центр ФишераШ64Растворитель класса LC-MS, используемый для матриц, ферментов и окрашивания
ВайпАлл Х60Научный центр Фишера19-413-113Абсорбирующая салфетка для инкубации увлажненных ферментов
КсилолНаучный центр ФишераX3P-1GALОчищающее средство для окрашивания

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles