Method Article

Комплексное пространственное профилирование видонезависимых транскриптомов с помощью стереосеквенирования

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен протокол для выполнения комплексного пространственного транскриптомного профилирования РНК хозяина, вируса, гриба и микробиома из фиксированных формалином парафинных срезов тканей с использованием Stereo-seq, что позволяет картировать различные транскриптомы с высоким разрешением при сохранении архитектуры тканей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственный состав клеток в организме хозяина, а также бактериальная или вирусная нагрузка в тканях могут влиять на взаимодействие типов клеток и аналитов, которые управляют клеткой через процессы, специфичные для клеточного типа. Стереосеквенирование для тканей FFPE использует случайный прайминг до пространственных штрих-кодов, что отличается от стандартных методов пространственной транскриптомики, которые используют A'tailing для захвата матричной РНК (мРНК) или на основе зондов для захвата видоспецифичных транскриптов. Эти методы не охватывают более современные знания о влиянии и важности других типов РНК из длинных некодирующих РНК, митохондриальных РНК, микроРНК или других видов РНК, таких как микробные, вирусные и грибковые. Здесь описана пошаговая процедура, начиная с разреза ткани и заканчивая подготовкой библиотеки к пространственному видонезависимому применению стереосеквенирования с детектированием РНК с использованием методологической методики случайного зонда, которая совместима с тканями, встроенными в фиксированный парафин формалином (FFPE). Этот метод стереосеквенирования имеет случайный захватывающий шов размером 0,22 мкм, который повторяется в массиве каждые 0,5 мкм, что позволяет получить субклеточное разрешение с помощью технологии, основанной на секвенировании. Поскольку этот метод обнаруживает как РНК хозяина, так и РНК, не являющуюся хозяином, протокол требует особых соображений, позволяющих определить, что находится внутри ткани, в отличие от того, что было отложено на ткани в процессе сбора, сохранения, разрезания и обнаружения (т.е. загрязнения окружающей среды и обработки). Наконец, этот протокол позволяет получить высокое (одноклеточное) разрешение мульти-РНК видов в пространственном контексте, обеспечивая понимание интра- и интерактома типов клеток и патологических видов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственно-омиксные технологии произвели революцию в изучении клеточной гетерогенности тканей, позволив одновременно количественно определять несколько мишеней: ДНК (геномика), РНК (транскриптомика), метаболитов (метаболомика) или белка (протеомика)1. Разрешающая способность этих различных анализов часто варьируется, что приводит к различным ограничениям при измерении аналитов, либо с повышенной разреженностью при измерении одиночных клеток 2,3, либо с нативным пространственным контекстом 4. В отличие от этого, объемные методы, такие как секвенирование РНК, обеспечивают только среднюю экспрессию генов во всех образцах и скрывают клеточную гетерогенность2, или секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq)2,3, которое требует диссоциации тканей для секвенирования одиночных клеток, часто требует фильтрации. Таким образом, эти методы исключают большие клетки и агрегаты, в то время как биоинформатические методы пытаются удалить фрагменты и дублеты, все из которых вызывают смещения 5,6,7. Пространственная транскриптомика сохраняет тканевую архитектуру, обеспечивая критически важное понимание клеточной организации и взаимодействий. Большинство методов нецелевого пространственного секвенирования не имеют разрешения для одной клетки, что требует деконволюции областей пространственного захвата, содержащих от 10 до 100 клеток 8,9,10. Тем не менее, в последнее десятилетие пространственная транскриптомика опередила потребности в этих методах, поскольку наблюдался прогресс в разрешении, расширении областей захвата и интеграции мультиомиксных подходов, как с использованием экспериментальной стратегии, так и с использованиемновых методов.

Пространственное омиксное секвенирование с повышенным разрешением (Stereo-seq) обеспечивает наноразмерное разрешение (500 нм) и область захвата в сантиметровом масштабе, а также видонезависимый полный транскриптомный захват, позволяющий захватывать кодирующую, некодирующую и не относящуюся к хозяину РНК13. Этот метод в настоящее время является самым высоким разрешением для пространственной транскриптомики и имеет опции для обеспечения самых больших полей зрения. Тем не менее, этот метод имеет некоторые заметные ограничения, в том числе затраты времени и труда около 15 часов на практическую работу, что составляет 4 дня для создания библиотек, готовых к секвенированию. Для сравнения, другие технологии пространственной транскриптомики, основанные на секвенировании, такие как пространственная транскриптомика на основе зондов, пространственная транскриптомика на основе массива PolyA-capture, Slide-seq и детерминированное штрихкодирование в тканях для пространственного омиксного секвенирования (DBiT-seq), обычно требуют от 5 до 8 часов практического времени в течение 2-3 дней (Таблица 1). Для многих исследователей эти достижения перевешивают технические проблемы и идеально подходят для создания полных транскриптомных пространственных атласов для изучения прогрессирования заболевания на клеточном и субклеточном уровнях, особенно если они сочетаются сдругими технологиями.

Протокол Stereo-seq имеет возможности, выходящие за рамки традиционной транскриптомики мРНК, которая опирается на поли-Т-зонды для захвата полиаденилированных транскриптов мРНК. Эти способы могут быть модифицированы путем добавления полиаденилирования к свежим тканям14 или видоспецифичных зондов для целевых предопределенных наборов генов15 для пространственного анализа экспрессии. Вместо этого Stereo-seq использует случайные нуклеотидные зонды для выбора различных РНК независимо от вида, включая микробные РНК, грибковые РНК, вирусные РНК и неполиаденилированные РНК, такие как энхансерные РНК, кольцевые РНК и длинные некодирующие РНК (днРНК)16. Теоретически возможно захват более мелких РНК или репаративных элементов, таких как малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК (микроРНК) и транспозоны17. Тем не менее, в настоящее время биоинформатика и картирование этих РНК остаются сложными и часто отфильтровываются во время первоначального выравнивания, которое обычно использует отсечку в 30.о.

Здесь описан подробный протокол с нашими модификациями для случайного захвата нуклеотидов производителем на чипах наношариков ДНК (DNB) для обеспечения лучшего понимания и работы с протоколом Stereo-seq, показанным на рисунке 1. Этот протокол включает в себя стратегии для молекулярных биологов по тестированию новых тканей FFPE на стереосеквенировании со случайным захватом нуклеотидов для получения более стабильных и высоких выходов из архивных образцов и жировых тканей более низкого качества. Изложенный протокол оптимизирован для образцов FFPE из большинства органов, независимо от вида происхождения. Однако этот протокол не включает в себя современные модификации, необходимые для работы со сложными тканями, такими как костный мозг, которые требуют декальцинации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной методической работе не представлены клинические данные по образцу пациента с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности. Тем не менее, соответствующие клинические данные были собраны в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом (IRB) в Онкологическом центре им. М. Д. Андерсона Техасского университета, отделение гинекологической онкологии и репродуктивной медицины, от участников, предоставивших письменное информированное согласие.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется носить хирургическую маску и перчатки в течение всего протокола, чтобы предотвратить заражение РНКазой. Исследователям с длинными волосами рекомендуется оттянуть их назад или даже надеть сетку для волос. Всегда используйте стерильную воду без нуклеазы (NFW) и пробирки без нуклеазы с низким уровнем связывания для максимального выхода. Ткани, не относящиеся к млекопитающим, такие как растительные ткани, могут потребовать оптимизации адгезии с использованием поли-L-лизина (PLL) и увеличения времени пермеабилизации из-за клеточных стенок. В то время как молекулярный захват остается теоретически возможным, необходима экспериментальная проверка, поскольку растительные ткани остаются непроверенными в нашем текущем рабочем процессе.

1. Оценка качества РНК и распределения фрагментов РНК 200 баллов

  1. Оцените качество РНК с помощью показателя распределения фрагментов РНК 200 (DV200), который измеряет процент РНК более 200.о.
  2. Используйте два участка по 10 мкм из одного и того же тканевого блока, предназначенные для обработки Stereo-seq.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальна немедленная обработка, но образцы могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели, при температуре -20 °C в течение 4 недель или при температуре -80 °C в течение 6 месяцев.
  3. Экстрагируйте РНК с использованием протокола экстракции селективной РНК без размера, как описано Patel et al.18 , чтобы обеспечить точную оценку распределения размеров фрагментов РНК.
  4. Оцените качество РНК с помощью одного из следующих методов, используя анализатор фрагментов, чтобы определить оценку DV200 или процент площади под кривой, представляющей фрагменты РНК длиной более 200.о. В идеале ткань должна иметь показатель DV200 (> 50%) и концентрацию (> 10 нг/мкл).

2. Уборка рабочего пространства

  1. Очистите все поверхности 30% отбеливателем. Дайте поверхностям высохнуть не менее 30 минут, чтобы предотвратить образование хлороформа в результате соединения отбеливателя и этанола.
  2. Протрите поверхности салфетками для обеззараживания ДНК (DDW). Распылите на все поверхности раствор для обеззараживания РНКазы (RDS), а затем 70% этанол, приготовленный с использованием NFW.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не смешивайте отбеливатель или любой другой алкоголь. Эта комбинация производит хлороформ, который очень токсичен и может привести к потере сознания, повреждению органов или смерти даже при низком воздействии.

3. Стереосеквенирование чипа случайного олигонуклеотидного захвата (N-чипа)

  1. Очистите рабочее пространство, как описано в шагах 2.1 и 2.2, включая все системы, используемые на этом шаге.
  2. Извлеките N-чип Stereo-seq из упаковки, запишите идентификатор чипа и очистите края N-чипа Stereo-seq и предметного стекла 100% этанолом, не касаясь чипа. Дайте полностью высохнуть на воздухе.
  3. Нанесение смолы для крепления чипа к предметному стеклу (опционально для пользователей, использующих Xylenes).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что коммерческие поставщики часто рекомендуют не содержащие ксилол очищающие агенты, было замечено, что нексилоловые очистители могут быть менее эффективными в зависимости от парафиновой смеси. Они часто несовместимы с некоторыми пластмассами, синтетическими смолами или тканями, содержащими пчелиный воск, и не обеспечивают эффективного удаления сильно сшитых или высокоплавких парафинов. При неуверенности в составе парафина, используемого для заделки образца, рекомендуется использовать ксилолы для оптимальной очистки. Кроме того, ксилолы лучше очищают жировые ткани, такие как грудь, яичники, яйцеклетки или ткани мозга.
    1. Хорошо встряхните или перемешайте смолу, чтобы убедиться, что она однородно белая. С помощью микропипетки осторожно нанесите 10 мкл УФ-отверждаемой керамической смолы по краю N-чипа Stereo-seq (рис. 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смола может вызвать раздражение кожи и глаз и может привести к аллергическим кожным реакциям при повторном воздействии. При пипетировании или работе с этой смолой всегда надевайте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Работайте в хорошо проветриваемом помещении и надевайте маску при использовании больших объемов или при нагревании раствора и избегайте прямого контакта с кожей или глазами.
    2. С помощью запечатанного поролонового тампона удалите излишки смолы, оставив лишь тонкую линию по краю скола. Поместите предметное стекло в устройство для УФ-отверждения, следя за тем, чтобы оно не касалось поверхности скола.
    3. Поместите нанесенный смолой чип поверх непрозрачной маски на источник ультрафиолетового излучения с длиной волны 405 нм, чтобы осветить заднюю часть предметного стекла и затвердеть в течение 5 минут. Это проиллюстрировано на рисунке 2B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте N-чип Stereo-seq воздействию ультрафиолетового света и не прикасайтесь к смоле на поверхности чипа, так как это может нанести вред наношарикам.
    4. После отверждения используйте запечатанные пенопластовые тампоны, пропитанные каждым из следующих компонентов: 100% молекулярный этанол; 70% этанола; и, наконец, NFW для очистки края, где была помещена смола. Если белые пятнышки отошли, снова очистите край. Никогда не прикасайтесь к поверхности стружки (Рисунок 2C).
    5. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть на воздухе. После осмотра храните чипсы в течение ночи при температуре 4 °C с влагопоглотителем, если это необходимо. Тем не менее, рекомендуется по возможности немедленно приступить к подготовке стружки и разделке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с ультрафиолетовым излучением всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе очки с защитой от ультрафиолета. Обрабатывайте этанол и смолу в хорошо проветриваемом помещении, желательно в вытяжном шкафу. Утилизируйте отходы в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  4. Подготовка чипсов с поли-L-лизином (опционально для жировых тканей или тканей с проблемами адгезии)
    1. Очистите рабочее пространство, как описано в шагах 2.1 и 2.2, включая все системы, используемые на этом шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не распыляйте химикаты непосредственно в ПЦР-машину. На всех этапах подготовки к ПЦР работайте в ПЦР-колпаке, если это возможно, чтобы предотвратить загрязнение, включая предыдущую амплификацию кДНК.
    2. Трижды погрузите чип в свежий NFW с помощью конической трубки объемом 50 мл.
    3. Высушите чип с помощью сжатого воздуха, используя всю силу сжатого воздуха под углом приблизительно от 60° до 80° по диагонали (45°) по поверхности чипа с расстояния около 5 см от поверхности чипа (рис. 2E). Если поверхность выглядит мутной, повторите промывку свежим NFW и снова высушите (поверхность облака обычно означает, что керамика не была достаточно смыта или отвержена на предыдущих этапах).
    4. Нанесите 150 мкл раствора ФАПЧ на всю поверхность стружки. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (от 22 °C до 25 °C). Это показано на рисунке 2D.
    5. Удалите раствор ФАПЧ и дважды промойте чип водой, не содержащей нуклеаз, в течение 10-15 с.
    6. Тщательно просушите края горки после второй промывки (не касаясь скола).
    7. Плотно высушите чип с помощью сжатого воздуха, используя всю силу сжатого воздуха под углом примерно от 60° до 45° по диагонали по поверхности чипа с расстояния около 5 см от поверхности чипа (рис. 2E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чип должен полностью высохнуть в течение 30 секунд или меньше. Если это займет больше времени, DNB будет нарушен, что приведет к артефактам при захвате.
    8. Приступайте к монтажу в течение 1 часа и держите стружку сухой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхность скола выглядит мутной после высыхания, промойте свежим NFW и повторите процесс сушки. Если после высыхания на поверхности чипа есть артефакты, это может вызвать проблемы с захватом в этих областях. Избегайте использования ФАПЧ для приклеивания, если ткань этого не требует. Прикосновение к чипу может привести к царапинам и потере областей захвата до высвобождения кДНК или неравномерного захвата после высвобождения. Смола на поверхности чипа приводит к крапчатой потере участков захвата. Размещение чипа слишком близко к соплу сжатого воздуха может привести к образованию кристаллов и разбрызгиванию поврежденных меток DBN на поверхности чипа; Однако это случается редко и обычно происходит только в том случае, если сопло почти касается стружки, а баллон со сжатым воздухом слишком холодный. Рекомендуется попрактиковаться в этой процедуре несколько раз с оценочными чипами, так как этот шаг технически сложен.

4. Разрезание и монтаж тканей

  1. Убедитесь, что рабочее пространство чистое, как описано в шагах 2.1 и 2.2. Убедитесь, что новые лезвия и NFW используются для всех водяных бань и льда во время разрезания и монтажа тканей. Не прикасайтесь к чипу напрямую, а только 80% скола покрывайте тканью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать толщину 5 мкм для стандартной ткани или 4 мкм для ткани с высоким содержанием жира. Используйте ленту последовательных секций для сопоставления модальностей в образцах, если это применимо.
  2. Сушите предметные стекла при температуре 42 °C в течение 3 часов в духовке или на ПЦР-машине с открытой крышкой. Затем переложите предметные стекла или измените температуру в духовке или ПЦР-машине до 37 °C и выпекайте в течение ночи 12-48 часов. Рекомендуется использовать около 18 часов.
  3. Дополнительная точка остановки: После высыхания запечатайте стекла в алюминиевых пакетах с влагопоглотителем при температуре 4 °C на срок до 1 недели, прежде чем продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время высыхания может снизить целостность РНК. Слишком короткая сушка приведет к снижению адгезии тканей к предметному стеклу. Запекание при более высокой температуре может снизить целостность РНК. Слайды могут быть отправлены для внешней обработки (например, для анализа хостов). Тем не менее, транспортировка не рекомендуется для анализа микробиома из-за повышенного потенциального загрязнения во время транспортировки.

5. Депарафинизация предметных стекол

  1. Убедитесь, что рабочее пространство чистое, как описано в шагах 2.1 и 2.2.
  2. Подготовьте реагенты для депарафинизации и протокола Stereo-seq.
    1. Необходимые реагенты: два 30 мл ксилолов в конических пробирках по 50 мл, два 30 мл 100% этанола в конических пробирках по 50 мл.
    2. Приготовьте следующие разведенные реагенты с помощью NFW: 96% этанола на чип (требуется 2 конических или 1 мл), 90% этанола на чип, 80% этанола на чип, 70% этанола на чип, 50% этанола на чип, 30% этанола на чип, 2,5 мл 5-кратного цитрата солевого раствора и натрия (SSC) из 20-кратного раствора, 5 мл 0,01N HCl (разбавьте 0,1 N HCl с NFW до pH 2). Для разведения этанола приготовьте либо один раствор объемом 30 мл в конических пробирках объемом 50 мл, либо раствор объемом 500 мл в пробирке объемом 1,5 мл, если вы используете силиконовые прокладки.
    3. Приготовьте следующие растворы и держите их на льду: i) 32,5 мл 0,1x SSC из 5x раствора (держите 30 мл раствора в конической пробирке, а остальные 2,5 мл поместите в 5 мл пробирки для дальнейшего использования), ii) 400 мкл 0,1x SSC с 5% RI, держите на льду.
    4. Приготовьте следующие разведенные реагенты с 0,1 Н HCl.
      1. Приготовьте 10-кратный раствор реагента для пермеабилизации (PR), добавив 1 мл 0,1 Н HCl к коммерчески предоставленному лиофилизированному реагенту.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Держите на льду только 1 час, обязательно используйте его для будущего использования и заморозьте при температуре -20 °C.
      2. Приготовьте 500 μл 1x раствора PR (разбавьте 10x раствор раствора PR аликвотой с 0,01 Н HCl, держите на льду до 6 часов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы pH 0,01 N HCl находился в пределах 10% от pH 2,0, так как ферменты на основе пепсина оптимально работают при pH 2.
  3. Депарафинизируйте предметные стекла, замочив их в ксилолах (рекомендуется) на 2 раунда по 20 минут каждый.
  4. Немедленно регидратируйте образец этанолом (100%, 96%, в течение 2 раундов по 5 мин каждый, затем 90%, 70%, 50% и 30% в течение 1 раунда, 2 мин). Наконец, регидратируйте с помощью NFW в течение 1 минуты. Для разведения этанола используйте 30 мл раствора в конической пробирке объемом 50 мл для каждого предметного стекла при подготовке образцов для исследований микробиома или используйте 30 мл для каждых двух стекол при подготовке образцов, не относящихся к микробиому. Для всех последующих разведений приготовьте 30 мл раствора в конической пробирке объемом 50 мл или, если используете силиконовые прокладки, используйте 500 мл раствора на 1 см2 чипа для полного покрытия области чипа.
    НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Рекомендуется размещать силиконовую камеру из 3-камерного ползуна вокруг чипа для создания уплотнения после стадии 100% этанола, как показано на рисунке 2F-H. Это позволяет использовать меньшие объемы реагентов и снижает риск повреждения чипа. В качестве альтернативы можно использовать конические трубки объемом 50 мл для полного погружения Stereo-seq Slide на протяжении всей процедуры.

6. (Опционально) Ядерная визуализация и окрашивание одноцепожной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте сшивающему реагенту FFPE нагреться до комнатной температуры (~25 °C) перед использованием в 6.1. Возможны и другие решения для окрашивания, но в настоящее время требуется флуоресцентное ядерное окрашивание для сегментации одиночных клеток и связывания клеток транскриптомных данных.

  1. Флуоресцентное окрашивание с использованием одноцепочечного красителя ДНК (ssDNA)
    1. Приготовьте 2 мкл окрашивающего раствора ssDNA в буфере SSC, разбавив реагент Qubit ssDNA 5x буфером SSC в соотношении 1:1 на 1–2 чипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение одноцепочечной ДНК может изменяться в зависимости от микроскопа, используемого при визуализации.  Поэтому новые микроскопы следует тестировать с набором разведений красителей ssDNA с использованием оценочного чипа и тестовой ткани для определения наилучшего динамического диапазона.
    2. Создают мастер-смесь окрашивающего раствора (200 мкл на чип) с использованием разведения ингибитора РНКазы (RI) в соотношении 1:20, разведения одноцепочечной ДНК в соотношении 1:200 и оставшегося 5-кратного раствора SSC.
    3. Добавьте раствор для окрашивания (150 μл на чип) и выдерживайте в темноте в течение 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите красящий раствор с угла чипа с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете съемную силиконовую камеру, снимите ее перед окрашиванием чипа смесью красителей ssDNA.
    4. Дважды промойте чип 0,1x SSC (150 μл на чип каждый раз) в течение 10-15 секунд. После второй промывки тщательно просушите края предметного стекла бумагой для линз (не касаясь скола).
    5. Добавьте ~3-5 μL глицерина (используйте меньше для инвертированного микроскопа) для крепления клевера (будьте осторожны с пузырьками).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на область предметного стекла нанесен правильный объем глицерина, обычно около 4 мкл для скола размером 1 см2 мкм. Использование слишком большого количества глицерина может привести к смещению покровного стекла при вертикальном удержании предметного стекла. Использование слишком малого количества глицерина увеличивает риск повреждения тканей при удалении покровного стекла и может привести к образованию пузырьков, которые могут негативно повлиять на результаты визуализации и сегментации отдельных клеток.
    6. Опустите покровное стекло с высоты примерно 1 см на сколу. Если вы используете микроскоп с вмешательством, убедитесь, что покровная крышка не соскальзывает при вертикальном удержании. Если он все-таки восстановится, не добавляя больше глицерина.
    7. Получение флуоресцентных изображений окрашенных одноцепочечной ДНК тканей с помощью широкопольного микроскопа с перекрытием 10% между фрагментами изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать карту ручной фокусировки из 9-13 точек с помощью широкопольного микроскопа с использованием 10-кратного объектива. Можно использовать конфокальный микроскоп, но он гораздо более чувствителен к очаговым изменениям в тканях и чипе.
    8. Сшивайте в программах обработки изображений, таких как ImageJ, используя теоретическое перекрытие для создания приблизительного позиционирования каждого элемента изображения, а затем выполняйте вычислительное перекрытие с сопоставлением пикселей для тонкой настройки разбиения изображений на листы.
    9. Обработайте изображения в программном обеспечении StereoMap и убедитесь, что контроль качества изображений пройден, прежде чем продолжить.
    10. Погрузите предметное стекло Stereo-seq в 30 мл 0,1x SSC до тех пор, пока покровное стекло не отсоединится.

7. Процесс декросслинкинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к чипу или наклона его во время этого шага и осторожно проводите пипетку.

  1. Убедитесь, что сшивающий реагент FFPE имеет теплую комнатную температуру (~25 °C), и проверьте, чтобы убедиться в отсутствии частиц, которые делают раствор мутным. Если частицы видны, нагрейте до 55 °C и охладите до 30 °C перед использованием.
  2. Включите амплификатор со следующими настройками: 30 °C для балансировки (крышка с подогревом 85 °C); 95 °C для 30-минутной инкубации; Бесконечное время выдержки 4 °C.
  3. Соберите прокладку кассеты, затем поместите ползунок для микросхемы Stereo-seq в кассету.
  4. Добавьте сшивающий реагент FFPE (400 мкл на чип) в лунку кассеты, содержащей чип. Приложите к кассете уплотнительную ленту и убедитесь, что она плотно закрыта.
  5. Начните 30-минутную инкубацию при температуре 95 °C с шага 7.2. По прошествии 10 минут поместите 10 мл метанола в контейнер объемом 15 мл (потребуется около 1 мл на предметное стекло) в морозильную камеру при температуре -20 °C.
  6. Аккуратно снимите чип с термоамплификатора, перенесите кассету на стол и снимите уплотнительную ленту.
  7. Извлеките и выбросьте реагент для расщепления FFPE с помощью пипетки. После того, как все реагенты для сшивания будут удалены, отсоедините и выбросьте кассету и прокладку.
  8. Уравновесьте предметное стекло Stereo-seq до комнатной температуры ~23 °C. Под стерильным вытяжным шкафом высушите край предметного стекла и нанесите новую силиконовую камеру (если применимо). Добавьте 500 μL охлажденного метанола из морозильной камеры при температуре -20 °C, убедившись, что вся секция полностью погружена в воду на 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, все предметное стекло Stereo-seq может быть погружено в коническую трубку объемом 50 мл, заполненную 30 мл охлажденного метанола.
  9. Разогрейте раствор 1x PR на сухом блоке при температуре 37 °C в течение 10 минут перед использованием примерно за 5 минут до окончания фиксации метанола (шаг 7.8).
  10. После того, как фиксация будет завершена, переместите предметное стекло в стерильный вытяжной шкаф. Сотрите излишки метанола на предметном стекле и подождите, пока остатки метанола испарятся на стружке (~5 минут). Соберите новую кассету и прокладку. Когда метанол полностью испарится, поместите предметное стекло Stereo-seq в кассету.

8. Пермеабилизация и обратная транскрипция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 8.1-8.11 делайте пипетку медленно и не прикасайтесь к чипу. Избыточное давление приведет к диффузии или появлению следов на DNB.

  1. Добавьте в чип 200 мкл реагента для проникновения. Наклейте уплотнительную ленту на кассету Stereo-seq и убедитесь, что она плотно закрыта.
  2. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут.
  3. Приготовьте буфер для промывки, добавив 380 мкл 0,1x SSC и 20 мкл RI (ингибитора РНК) для каждого предметного стекла. Внесите 400 μл на горку и держите на льду до использования.
  4. Извлеките реагенты для обратной транскрипции FFPE (FFPE RT), ЗАТЕМ уменьшите все нижеперечисленное и держите смесь ферментов, олигону и димеры на льду. Нагрейте буфер FFPE RT до комнатной температуры (~23 °C).
  5. За 5 мин до окончания пермеабилизации приготовьте 200 мкл на чип смеси FFPE RT. Добавьте буфер FFPE RT (158 мкл), смесь ферментов FFPE RT (30 мкл), олиго FFPE RT (10 мкл) и димер FFPE (2 мкл). Аккуратно перемешайте и держите на льду.
  6. Держа чип на термоамплификаторе, измените температуру инкубации на комнатную (~23 °C). Снимите пломбу и аккуратно выбросьте раствор 1x PR.
  7. Очень аккуратно промойте чип 200 μл 0,1x SSC (с 5% RI) на 1 см2 чипа.
  8. Удалите 0,1x SSC (с 5% RI) смывку с угла скола.
  9. Добавьте 200 μL раствора FFPE RT в угол чипа.
  10. Наклейте уплотнительную ленту на кассету Stereo-seq и убедитесь, что она плотно закрыта; В противном случае испарение снизит выход продукции.
  11. Запустите протокол инкубации FFPE RT изотермической реакции при 42 °C при 45 °C нагреваемой крышке в течение (от 5 до 24 часов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить инкубацию в течение 12-16 часов и быть последовательным в разных экспериментах.

9. Высвобождение и очистка кДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения шагов 9.6-9.7 делайте пипетку медленно и не прикасайтесь к чипу. Избыточное давление приведет к диффузии или появлению следов на DNB.

  1. Приготовьте 400 мкл буфера для высвобождения кДНК, нагревая буфер для высвобождения кДНК до 55 °C, чтобы растворить любой осадок, который мог образоваться.
  2. Уравновесьте буфер для высвобождения кДНК до теплой комнатной температуры (25 °C). Не кладите на лед.
  3. Перед использованием уменьшите буфер для высвобождения кДНК и фермент высвобождения кДНК при 100 x g в настольной центрифуге.
  4. Приготовьте буфер кДНК, добавив 20 мкл высвобождающего фермента к 380 мкл высвобождающего буфера кДНК.
  5. Держа чип на термоамплификаторе, измените температуру инкубации на комнатную (~23 °C). Снимите защитную пленку, аккуратно снимите и выбросьте раствор FFPE RT.
  6. Промойте чип один раз, невероятно аккуратно, с 0,1x SSC на чип (200 μл).
  7. Удалите 0,1x SSC из угла чипа, очень осторожно пипетируя.
  8. Добавьте 400 мкл приготовленного раствора для высвобождения кДНК в каждый чип.
  9. Запечатайте слайд-кассету Stereo-seqs, приложив к кассете уплотнительную ленту (или крышку PCR). Убедитесь, что кассета плотно закрыта, чтобы предотвратить испарение, утечку или загрязнение.
  10. Инкубировать при температуре 55 °C в течение ≥ 5 часов (минимум от 5 часов до 24 часов) с крышкой, нагретой до 60 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить инкубацию в течение 5-7 часов или в течение 2 часов в экспериментах.

10. Соберите смесь для высвобождения кДНК

  1. Разогрейте NFW до 37 °C (не менее 500 μл на чип 1 см2 ).
  2. Энергично снимите пломбу и пипетку в каждом углу и центре чипа над тканью, но не соскабливайте и не прикасайтесь к ткани. Соберите всю смесь для высвобождения кДНК из чипа и переложите в центрифужную пробирку объемом 1,5 или 2,0 мл. Запишите идентификационные номера чипа (идентификатор чипа) на каждой трубке.
  3. Добавьте 350 мкл предварительно нагретого NFW непосредственно на поверхность чипа. И еще раз энергично пипетируйте пипеткой меньшего размера (P100 или P200), наклоняя наконечник, чтобы приложить большее усилие сдвига, но не касайтесь ткани и не царапайте чип.
  4. Смешайте промывку из шага 10.3 (350 μл) со смесью для выведения кДНК из шага 10.2 (400 μл). Убедитесь, что вы объединили только образцы из одного чипа.
  5. Поместите 100 μL NFW на чип, запечатайте слайд чипа Stereo-seq в кассете и храните его в холодильнике до окончания протокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях низкого выхода рассмотрите возможность повторного высвобождения кДНК. Наличие ДНК на чипе можно оценить с помощью красителя ssDNA и повторной визуализации с покровным стеклом или без него.

11. Соберите бусину кДНК и очистите

  1. Ресуспендируйте кДНК с шага 10.4 равным объемом гранул твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI). Перемешивайте до тех пор, пока шарики не будут равномерно распределены по всему раствору, чтобы отобрать фрагменты ДНК более ~100.о.
  2. Выдерживать в течение 10 мин при температуре от 27 °C до 37 °C (рекомендуется 30 °C).
    1. Во время инкубации. Приготовьте 5 мл 80% свежего этанола в NFW на каждые 2 обработанные чипсы.
  3. Возьмите пробирки с инкубированной смесью шариков и кратковременно уменьшите при 100 x g на настольной центрифуге.
  4. Поместите пробирки на магнитный сепарационный решетку и инкубируйте не менее 5 минут (пока жидкость не станет прозрачной).
  5. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив шарики, и сохраните ее в чистой пробирке с этикеткой. Маркировка выпуска кДНК с указанием идентификатора чипа и даты.
  6. Добавьте в пробирки 1,5 мл 80% этанола, не повреждая шарики, и инкубируйте в течение 30 с, прежде чем удалить этанол.
  7. Повторите шаг 11.6 еще один раз, на этот раз удалив как можно больше этанола с помощью маленького наконечника для пипетки, не повреждая шарики.
  8. Высушите шарики на воздухе в трубках до тех пор, пока они не перестанут отражать. Время будет варьироваться, поэтому регулярно проверяйте, чтобы не допустить пересушивания (трещин), что приведет к низкому выходу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте влажность и температуру в помещении. При высоких температурах (27 °C) и низкой влажности (менее 20%) бусины будут сохнуть очень быстро (от 3 до 5 минут). При низких температурах (23 °C) и высокой влажности (более 40%) бусины будут сохнуть гораздо медленнее (от 7 до 15 минут).
  9. Извлеките трубки с магнитной решеткой, добавьте 22 μл NFW и перемешайте, перемешивая.
  10. Инкубировать в сухой бане или ПЦР-аппарате при температуре 27 °C в течение 5–15 минут.
  11. Кратковременно центрифугируйте и поместите пробирку обратно на магнитную сепарационную решетку, пока жидкость не станет прозрачной (от 2 до 5 минут).
  12. Перенесите 21 мкл надосадочной жидкости, содержащей кДНК, в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл, меченную образцом, не повреждая шарики.
  13. Повторите шаги с 11.9 по 11.12 для каждой пробирки, собрав в общей сложности 42 мкл кДНК. Продолжайте непосредственно амплификацию кДНК (шаги с 12.1 по 12.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка в начале амплификации приведет к снижению выхода, увеличению коротких прочтений и деградации одноцепочечной матрицы ДНК.

12. Амплификация кДНК

  1. Достаньте смесь для амплификации кДНК и праймеры кДНК FFPE из морозильной камеры и положите их на влажный лед для оттаивания.
  2. Раскрутите смесь для амплификации кДНК и праймеры кДНК FFPE на настольной центрифуге при ~100 x g.
  3. Добавьте 50 мкл раствора амплификации кДНК и 8 мкл праймеров кДНК FFPE в каждую пробирку с 42 мкл (шаг 11.13) и поместите в амплификатор с адаптером с плоским колпачком, чтобы предотвратить деформацию пробирки.
  4. Запустите программу термоамплификатора для амплификации кДНК: начальная денатурация: 95 °C в течение 5 мин; цикличность: [98°С в течение 20 с, 58°С в течение 20 с, 72°С в течение 3 мин] × 15 циклов; окончательное расширение: 72 °C в течение 5 мин; Температура выдержки: 12 °C (при немедленной обработке) / 4 °C (при хранении в течение ночи).
  5. Измерьте концентрацию кДНК в 1 мкл кДНК до и после очистки бусинами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество продукта кДНК перед очисткой должно превышать 1 мкг на каждый 1 см² чипа. Концентрация после очистки должна составлять не менее 10 нг/мкл. Более низкий выход обычно связан с уменьшением разнообразия библиотек. Значительная потеря выборки на этом этапе коррелирует с баллами DV200; однако DV200 не является идеальным предсказателем результатов.
  6. Повторите очистку шариков кДНК из шага 11 (очистка шариков) с использованием продукта ПЦР из шага 12.4 с тремя модификациями: используйте магнитный штатив для ПЦР меньшего размера, добавьте только 200 мкл 80% этанола на этапе 11.6 и повторно суспендируйте в 22 мкл буфера Tris-EDTA (TE) (pH 8) на шаге 11.9.
  7. Храните шарики в пробирке с 20 μл NFW, маркированной с названиями образцов, штрих-кодом, датой и идентификатором чипа.
  8. Измерьте распределение фрагментов кДНК с помощью анализатора фрагментов. Диапазон размеров фрагментов должен быть в пределах 250-400.о. Если фрагменты слишком малы, повторите чистку валика, но используйте комнатную температуру (~25 °C) вместо 27 °C.
    ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ТОЧКА ОСТАНОВКИ: После измерения кДНК она может храниться при температуре -20 °C до 1 месяца и при температуре -80 °C до 1 года. Бусины можно хранить в NFW в течение 1 недели при температуре 4 °C. Не замораживайте бусины.

13. Подготовка библиотеки (День 4)

  1. Приготовление реакционной смеси амплификации
    1. Удалите библиотечный раствор для амплификации ПЦР, библиотечные наборы штрихкодов, продукт кДНК и NFW. Разморозьте кДНК и реагенты на льду и воде при комнатной температуре и уменьшите при 100 x g в течение 10 с.
  2. Определите библиотечную стратегию штрих-кодов для каждых 25 μл смеси праймеров для штрих-кодов ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого секвенсора все основания должны быть представлены одинаково в каждой позиции в наборе штрих-кодов. Поэтому большинство коммерческих наборов, совместимых с этим, разработаны с предопределенными тетрадами штрих-кода (наборы из четырех штук). Эти тетрады могут быть применены к отдельным образцам при разделении по полосе секвенирования или они могут быть объединены вместе для одного образца при секвенировании по одному образцу на полосу. Поддержание сбалансированных штрихкодов является обязательным условием, так как несбалансированные штрихкоды уменьшат объем пригодных для использования данных, генерируемых секвенсором.
  3. Определите объем кДНК для 20 нг (например, для 10 нг/мкл потребуется 2 мкл). Используя его, приготовьте NFW (25 μL) раствор разбавленной кДНК (разбавленный до ~1 нг/μл).
  4. Соедините библиотечную амплификационную смесь (50 μл) с разбавленной кДНК в NFW (25 μл) и смесью праймера для штрих-кода ПЦР (25 μл) до 0,2 мл ПЦР-пробирки.
  5. Перемешайте лунку с помощью пипетки и уменьшите при 100 x g в течение 10 с. (Не делайте вихревыми)
  6. Поместите ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл в термоамплификатор и убедитесь, что у вас есть вкладыш для предотвращения раздавливания пробирок.
  7. Запустите программу термоамплификатора для амплификации кДНК: начальная денатурация: 95 °C в течение 5 мин; цикличность: [98°С в течение 20 с, 58°С в течение 20 с, 72°С в течение 3 мин] × 8 циклов; окончательное расширение: 72 °C в течение 5 мин; Температура выдержки: 12 °C (при немедленной обработке) / 4 °C при хранении в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки библиотеки можно использовать различное количество входной кДНК. Однако используемое количество повлияет на количество циклов ПЦР, необходимых для амплификации. Например, производитель рекомендует 20 нг входной ДНК и использование 8 циклов. Также можно использовать 40 нг с 7 циклами или 80 нг с 6 циклами. Использование менее 20 нг или более 80 нг входной кДНК не рекомендуется.

14. Очистка библиотечного усилителя

  1. Количественно оцените продукт необработанной библиотеки, как это сделано в шаге 12.5.
  2. Повторите очистку швов из шага 11 (очистка швов) с использованием сырого библиотечного продукта из шага 13.7 с тремя модификациями: используйте соотношение шариков 0,8:1 к продукту, используйте магнитный штатив меньшего размера для ПЦР, используйте только 200 мкл 80% этанола по сравнению с шагом 11.7 и повторно суспендируйте в 22 мкл буфера TE (pH 8) на шаге 11.9. Приготовьте около 1 мл свежего 80% этанола на две чипсы 1 см2 .
  3. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ТОЧКА ОСТАНОВКИ: После измерения библиотеки ее можно хранить при температуре -20 °C до 1 месяца и при температуре -80 °C до 1 года. Бусины можно хранить на NFW в течение 1 недели при температуре 4 °C. Не замораживайте бусины.

15. Система DNBSEQ-T7RS для секвенирования Stereo-Seq Random Oligonucleotide Primed DNB

  1. Используя комплект PE75 на системе DNBSEQ-T7RS, распределите циклы как 25 для чтения 1 и 62 для чтения 2 (PE25+62), за которыми следует индекс 10.о.:
    1. Первое считывание (чтение 1 из 25 циклов) захватывает пространственный идентификатор чипа (CID) или информацию о местоположении из штрихкодов на основе чипа.
    2. Второе чтение (чтение 2 из 62 циклов) захватывает молекулярный идентификатор (MID), случайную последовательность 6.н., непосредственно прикрепленную к генным вставкам, с 3 дополнительными темновыми циклами, используемыми для коррекции фазировки и калибровки смещения штрих-кода. Затем следует вставка в ген в объеме 30-59.о. из чтения 2, которая идентифицируется путем картирования на известные геномы или транскриптомы.
      Примечание: Более длинные вставки генов возможны, но для этого потребуются другие парные концевые комплекты и модификация рабочего процесса картирования.
    3. Цикл индекса для демультиплексирования охватывает 10 бит/с на основе секвенирования штрихкодов, объединенных на шаге 13.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время секвенирования составляет примерно 10-12 часов для проточной ячейки 75 PE. Секвенирование чаще всего выполняется в керне секвенирования или на коммерческом объекте, а не в большинстве лабораторий, поскольку для этого требуется DNBSEQ-T7RS или аналогичный инструмент для секвенирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приведенные ниже данные демонстрируют возможность выполнения сегментации одиночных клеток с помощью конвейера SAW и картирования на неполиаденилированные РНК, такие как тРНК (TRDMT1), из сечения FFPE. Непредвзятые данные Stereo-seq позволяют изучить важность не только мРНК, но и тРНК, рРНК и РНК, не относящихся к хозяину (если это уместно). Используя прямые выходные данные конвейера SAW16 и стереопию для оценки качества выходных да...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол Stereo-seq очень детализирован и включает в себя несколько критически важных этапов, которые требуют точности, времени и чистой среды для обеспечения успеха, особенно при профилировании микробиома или не хозяина, которое может потребовать особых мер предосторожности.

На всех этапах необходимо использовать воду, не содержащую нуклеаз, а к чипу захвата нельзя прикасаться ничем, кроме образца и реагентов. Соблюдайте крайнюю осторожность при использовании...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что эта работа не финансировалась Complete Genomics. Тем не менее, Complete Genomics покрывает расходы на публикацию этой статьи.  Им не было предоставлено ни предварительного копирования, ни информации о содержании.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично профинансировано Альянсом по исследованию рака яичников (OCRA 811621 и 891490), Фондом Sie и Фондом Стефани К. Стелтер. Это исследование было проведено в сотрудничестве с Центром проточной цитометрии и клеточной визуализации, Департаментом ветеринарной медицины и хирургии и Ядром передовых технологий геномики, которое частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения через грант поддержки Онкологического центра M. D. Anderson's Cancer Center P30 CA016672 и специалистом по исследованиям NCI Джареда Беркса 1 R50 CA243707-01A1.

Мы также хотели бы поблагодарить Compete Genomics, в частности Брэндона Вандербуша и Танзина Юсуффа за техническое обучение и устранение неполадок, а также Цзя «Джеки» Чжао, Юнфу Вонга и Эрин Петрилли. Автор(ы) получил набор реагентов FFPE OMNI и секвенирования, а также доступ к программе раннего доступа T7 от Complete Genomics по сниженной цене. Кроме того, некоторые реагенты были предоставлены бесплатно для использования в данном исследовании.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл центрифугных трубок с обычной ДНК/РНКThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456Для смешивания реагентов (другие диапазоны подходят)  
100% этанолСигма-ОлдричE7023Молекулярная степень
15 мл конических стерильных полипропиленовых центрифугных трубокThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Используется для aliquots 
20x Концентрат  Буфер из солевого цитрата натрия (SSC)Сигма-ОлдричS6639-1LРаньше делал 5X SSC для окрашивания морилок и 1X SSC для этапов стирки и удаления скальзирования покрытия.
Биоанализатор 2100 годаAgilentДисконтинуированоИнститут: Биоанализатор
Камера 3 скважин, съёмнаяИбиди80381Силиконовая камера для уменьшения объёма во время регидратации и фиксации метанола.
Источник ультрафиолетового света 405 нмРазличныеН/ДДля отверждения УФ-смолы
50 мл конических стерильных полипропиленовых центрифугных трубокThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Используется для аликвотов и для депарафинизации 
70% стерильный изопропанол-спиртTexwipe TX3270Для деконтаминации поверхности и bbsp;
Agilent High Sensitive ДНК-наборAgilent5067-4626Для биоанализаторной характеристики cDNA и библиотек
Набор Agilent RNA 6000 PicoAgilent5067-1513Для биоанализаторной характеристики РНК
Алюминиевая фольгаРазличныеН/ДЧтобы покрыть стекло во время окрашивания SS-ДНК.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Life Sciences B23317/B23318/B23319SPRI Beads cDNA и очистка библиотеки
ОтбеливательРазличныеН/ДОчистка рабочей станции, удаление загрязнения микробиома
Герметичные поролоновые тампоны CONSTIXContec19161023Для точной очистки смолы
ПерекрытиеСигма-ОлдричBR470045-2000EA
Осушительные пакетыРазличныеН/ДПакеты с осушителями без РНази, без пыли.
Одноразовая маска для лицаThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Защита, загрязнение РНК и & бесплодие 
Салфетки для стирания ДНКСигма-ОлдричL9060-250EAДезактивация путём протирания поверхностей (влажные салфетки)
ДНК-трубки LoBind 1,5 млEppendorf 22431021Используется для сбора cDNA и библиотечных постамплификаций.
ДНК-трубки LoBind 2 млEppendorf 22431048Используется для сбора кДНК до амплификации.
DNBSEQ OneStep DNB Make Reagent KitПолная геномика940-001891-00Реагенты для подготовки и амплификации ДНК-наношара (DNB)
Набор чистящих реагентов DNBSEQ-T7RSПолная геномика940-001903-00Картридж для стирки после секвенирования завершён
DNBSEQ-T7RS комплект загрузки реагентов DNBПолная геномика940-001894-00Реагенты и пластины для загрузки DNB в потоковую ячейку
Секвенирующая ячейка DNBSEQ-T7RSПолная геномика940-001902-001 полоса/ячейка потока
DNBSEQ-T7RS Stereo-seq Visual Reagent KitПолная геномика940-001893-00Картридж и реагенты для секвенирования.
Система DNBSEQ-T7RSПолная геномикаЭтот набор визуализации стерео-секвенции использует технологию DNBSEQ. Секвенирование начинается с гибридизации якоря ДНК, затем к наношару ДНК (DNB) присоединяется флуоресцентный зонд с помощью химии комбинаторного анкерного секвенирования (cPAS). Наконец, система высокого разрешения фиксирует флуоресцентный сигнал. После цифровой обработки оптического сигнала секвенсор генерирует высококачественную и точную секвенирующую информацию.
Сжатый воздух с очисткой пылиУтреняM-6318Важно использовать этот бренд или тот, что с похожим топливом.
Клинки микротомов Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LГистология — используется при секционировании образцов
Взрывоустойчивый морозильникРазличныеН/ДОхлаждать метанол до и во время этапа фиксации метанола.
Гистологические кистиРазличныеН/ДГистология — используется при секционировании образцов
Соляная кислотаСигма-Олдрич2104-50МЛДля разбавления премуляблизирующего фермента при 0,01 N HCl (pH 2). Стандартная концентрация запасов для раствора HCl составляет 0,1 N.
Система визуализацииРазличныеН/ДGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Раствор для дезактивации RNaseZap Invitrogen RNaseZapThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Очистка рабочей станции удаление загрязнения РНКзой
Kimtech Delicate Task Wipers Kimtech34155Сушить скамейки, оборудование, пипетки и т.д.
Лабораторный халатРазличныеН/ДСредства индивидуальной защиты (СИЗ)
Бумага для объективовThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Различные работы для сушки горок без высыпания
Салфетки для стирания ДНК LookoutСигма-ОлдричL9060Очистка рабочего места с удалением ПЦР-загрязнения
Магентная сепарационная стойка 5uL — 0,2 Permagen LabwareMSRLV08Для отделения шариков в ПЦР-трубках
Magjet Rack 12x1,5 млThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02Для разделения шариков в трубках объёмом 1,5 мл
Ручной вращательный микротомLeicaRM2235Гистология — используется при секционировании образцов
Methonal ≥ 99,9%, подходящий для иммунофлуоресценции, ВЭЖХСигма-Олдрич34860Для фиксации (требуется уровень HPLC)
Микродиссектирующие щипцыСигма-ОлдричF4142-1EAГистология — используется при секционировании образцов
МикропипеткаРазличныеН/Д
Вода без нуклеазы молекулярного класса, не обработанная ДПЭКРазличныеН/ДРазбавления и элюция бусинок
Нитриловые перчаткиРазличныеН/ДСИЗ
ДуховкаРазличныеН/ДЧтобы запечь чипсы
ПЦР-лампы объемом 0,2 мл с прикреплёнными конденсаторамиРазличныеН/ДДля ПЦР-приложений
ПЦР-покрытия РазличныеН/ДЗамена, если клей на предоставленной крышке слабый
PCR Hood & Рабочая станцияМистерMY-PCR24-010Для шагов до ПЦР (РНК в кДНК)
pH-метрРазличныеН/ДpH-метр для подтверждения pH HCl.
Раствор поли-L-лизинаСигма-ОлдричA005-CОпционально для увеличения склеенной ткани к чипу
Флуорометр Кубит-4Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226Инсутермент; Количественное измерение ДНК
Наборы для количественного анализа кубитов dsDNAThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851Для измерения cDNA и количественных оценок библиотек
Кубит SSDNA Assay KitThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ10212Окрашивание по ssDNA (используется только краситель)
Ледяные блоки без РНКРазличныеН/ДГистология — используется при сечении образцов для гидратации блоков перед секционированием
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZapThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782Раствор для дезактивации поверхности, уничтожающий РНК
Комплект RNeasy FFPEЦягэн73504 & 19093Для экстракции и экстракции РНК DV200 измерение 
Sculpt Ultra White ResinСирая ТекН/ДУстойчивая к высоким температурам УФ-смола
Набор для подготовки библиотеки штрихкодов Stereo-seq 16STOmics / Полная геномика111KL160Для создания библиотеки Stereo-seq OMNI FFPE
Набор аксессуаров FFPE Stereo-seqSTOmics / Полная геномика310AK002Пространственные аксессуары OMNI комплекта 211SN114
Стерео-seq N-чиповый слайд (1см x 1см)STOmics / Полная геномика210CN114Пространственный чип OMNI — часть комплекта 211SN114
Стерео-последовательный ПЦР-адаптер  STOmics / Полная геномика301AUX001Для шагов гибридизации ПЦР, модифицированных для трёх, аналогичных адаптеру гибридизации PCRmax Situ
Стерео-секвентивная транскриптомика N комплектSTOmics / Полная геномика211KN114Пространственная OMNI regent часть комплекта 211SN114
Хирургический дизайн универсального промышленного лезвия для бритвыThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Гистология — используется при секционировании образцов
Буферное решение TE pH 8.0Сигма-Олдрич8890Для элюирования кДНК и библиотек
Тепловые циклерыBioRad / различные1861096 /12015392 / разныеПЦР-машина с ручной крышкой или вариантами глубоких скважин (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler и др.)
Буферные комплекты Thermo Scientific Orion All-in-One pHThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
Тканевая флотационная ванна — Digital XH-1003ПремьераNC0779538Гистология — используется при секционировании образцов
УФ-защитные очкиРазличныеН/ДДля безопасности при ультрафиолетовом отверждении
КсиленыСигма-Олдрич247642Для депарафинизации

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles