Этот хирургический протокол представляет собой пошаговое руководство по введению интратекального катетера в спинномозговое субдуральное пространство грызуна для проведения целенаправленного лечения.
Методическая статья
Доступ к субдуральному пространству спинного мозга грызуна для проведения лечения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лечение заболеваний или травм спинного мозга является сложной задачей, отчасти из-за трудностей в разработке эффективных методов лечения, которые могут быть непосредственно применены к спинному мозгу. Современные методы лечения травмы спинного мозга (ТСМ), например, в основном являются эпидуральными. Тем не менее, эпидуральная терапия не позволяет напрямую взаимодействовать со спинным мозгом, снижая потенциальный эффект лечения. Здесь предлагается метод доступа к субдуральному пространству в модели грызуна для получения более прямого эффекта данного лечения. С использованием описанного протокола была проведена успешная субдуральная имплантация биоэлектронного устройства для регистрации/стимуляции спинного мозга, а также безопасное введение гидрогеля, загруженного нейротрофином-3. У животных, подвергшихся воздействию этого протокола в обоих случаях, не наблюдалось никаких изменений в функции задних или передних конечностей после процедуры, и в течение 12 недель после процедуры не развивалась дисфункция. Несмотря на то, что представленные здесь примеры очень специфичны, предложенный протокол может быть использован в различных приложениях для более эффективного локализованного лечения неврологических расстройств спинного мозга.
Введение
Заболевания и травмы спинного мозга могут иметь разрушительные последствия для миллионов людей во всем мире, что приводит к значительному бремени в социальной, экономической и медицинской сферах 1,2. Травмы спинного мозга и нейродегенеративные заболевания могут привести к хроническим двигательным, сенсорным и вегетативным дисфункциям, которые снижают качество жизни и независимость пострадавших людей. Современные методы лечения, такие как хирургическое вмешательство и фармакотерапия, сосредоточены на смягчении первоначальной травмы и лечении вторичных осложнений3. Тем не менее, эти подходы редко приводят к существенной регенерации нейронов или функциональному восстановлению, что оставляет острую необходимость в более эффективных вмешательствах, нацеленных на основные механизмы.
Основной задачей для современных стратегий лечения является выбор и проведение желаемого лечения. Такие методы лечения, как нейромодуляция или фармацевтическое вмешательство, обладают способностью влиять на активность нейронов, способствовать функциональному восстановлению и потенциально восстанавливать связи в поврежденных позвоночных цепях4. Стимуляция спинного мозга может привести к улучшению двигательного контроля и уменьшению боли5. Однако эти стратегии в настоящее время ограничены непрямой доставкой в поврежденную ткань, ориентированной на эпидуральное пространство, не учитывая барьер твердой мозговой оболочки спинного мозга 6,7,8. В то время как эпидуральная анестезия показала клинические преимущества, она ограничена из-за косвенного доступа к целевым популяциям нейронов, что приводит к потенциально снижению эффектов терапевтических агентов.
Наша группа работала над преодолением этих ограничений, связанных со стратегиями, ориентированными на эпидуральную анестезию, и исследовала потенциал прямого субдурального лечения в моделях травмы спинного мозга (ТСМ). Введение катетеров в субдуральное пространство позволяет проводить лечение непосредственно в спинном мозге, обеспечивая усиленное взаимодействие с пораженными нервными тканями 9,10. Субдуральное введение также снижает барьерные эффекты твердой мозговой оболочки, повышая эффективность электростимуляции и систем адресной доставки лекарств11,12. Этот метод может повысить точность и эффективность лечения, потенциально приводя к лучшим результатам функционального восстановления.
В данной статье описан пошаговый протокол безопасного доступа к субдуральному пространству спинного мозга грызуна. Эта процедура ориентирована на грудной отдел позвоночника (Т10-Т12), однако при необходимости она может быть реализована в разных местах спинного мозга. Указаны анатомические ориентиры, позволяющие идентифицировать регион, и представлены подробные инструкции по ламинэктомии, дуротомии и проникновению твердой мозговой оболочки. Также представлены два применения этого протокола, включая имплантацию устройства для электростимуляции, а также доставку гидрогелевой системы доставки лекарств (рис. 1). Изложенные шаги легко воспроизводятся исследователями с опытом работы в хирургии грызунов. Этот протокол написан в контексте модели контузии ТСМ; Тем не менее, конкретная модель травмы может быть модифицирована в зависимости от желаемых экспериментальных результатов. Описанная здесь методика не только обещает продвинуть лечение ТСМ, но и может стать платформой для будущих исследований по восстановлению и регенерации спинного мозга с помощью точных, локализованных вмешательств.
Протокол
Все процедуры проводились в соответствии с этическими принципами Оклендского университета и были одобрены Комитетом по этике животных (AEC) учреждения и университетскими сотрудниками по защите животных (AWO). Самок крыс породы Спрэг-Доули массой тела 240-260 г содержали в группах (21 °C; 12 ч:12 ч, светлый: темный цикл) и предоставляли им свободный доступ к стандартной диете грызунов до и после операции. Рекомендуется в первую очередь опробовать этот протокол при отсутствии модели травмы, так как цель состоит в том, чтобы обеспечить безопасный доступ к субдуральному пространству спинного мозга грызуна. Это важный первый шаг для демонстрации того, что протокол может быть применен без причинения травмы, что позволяет более точно изучить желаемую модель травмы. Протокол подходит для комбинирования со многими различными моделями травм, используемыми исследовательскими группами. Таким образом, в протоколе не описываются конкретные этапы доставки травмы, поскольку они будут варьироваться в зависимости от применения. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.
1. Предоперационная подготовка
- Простерилизуйте все инструменты (дополнительный рисунок 1) и соответствующие расходные материалы.
- Взвесьте крыс (крыс), которые будут проходить операцию на следующий день.
- Рассчитать соответствующие дозы лекарственных препаратов, которые должны быть введены; бупивакаин (анальгетик) @ 2 мг/кг, доза - 0,08 мл/100 г; мелоксикам (анальгетик) @ 2 мг/кг, доза - 0,04 мл/100 г; бупренорфин (анальгетик) @ 0,03 мг/кг, доза - 0,1 мл/100 г; энрофлоксацин (антибиотик) @ 10 мг/кг, доза - 0,08 мл/100 г12,13.
Примечание: Бупивакаин вводили подкожно в 3-4 местах вдоль операционного поля до первоначального разреза.
2. Хирургическая подготовка
- Убедитесь, что анестезиологическая система настроена правильно (проверьте, правильно ли настроены все трубки, связанные с кислородно-анестезиологической системой).
- Подготовьте необходимые инъекции в зависимости от веса крыс, а также инъекцию физиологического раствора объемом 3 мл для введения до начала.
- Убедитесь, что грелка (рабочая температура 37 °C), лампа, микроскоп и бритва настроены и функционируют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специальное увеличение для препарирующего микроскопа не требуется, так как увеличение будет варьироваться в зависимости от предпочтений пользователя и видимости во время процедуры.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что температура животного не опускается ниже 35°C или не превышает 40°C во время процедуры
3. Подготовка животных
- Убедитесь, что все трубки, связанные с анестезиологической системой и кислородным баллоном, подключены. При использовании анестезиологической системы, используемой в этом исследовании (см. Таблицу материалов), установите индукцию изофлурана на 3% и введите вес животного в анестезиологическую систему, чтобы установить скорость потока кислорода для поддерживающей анестезии (дополнительный рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте уровень анестезии на уровне, подходящем для каждого отдельного животного. Этот показатель может варьироваться от 1,3% до 2% в зависимости от животного. - Поместите крысу в индукционную камеру до тех пор, пока она не сможет встать на ноги, переключитесь на желаемый уровень поддержания изофлурана и переместите крысу к носовому конусу.
- Введите 3 мл физиологического раствора и необходимые инъекции препарата подкожно перед бритьем.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инъекций физиологического раствора и бритья введите бупивакаин в несколько мест вдоль предполагаемого места разреза - Контролируя уровень анестезии животного, подготовьте все инструменты (микроскоп, инструменты, стерильные простыни) в операционной зоне. Поместите стерильную простыню для инструментов в нужную зону, а инструменты разложите по простыне, поддерживая стерильность поля.
- Сбрейте шерсть вдоль спины животного, от основания шеи до верхней части бедер.
- Продезинфицируйте область скрабом с хлоргексом, а затем настойкой хлоргекса, круговыми движениями, двигаясь от центра выбритого участка (3х), и нанесите лубрикант на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
- Перенесите крысу на грелку под микроскопом, наложите пресс и герметизирующую простыню на выбритый участок и вырежьте отверстие, достаточно большое, чтобы обнажить операционное поле, но не настолько большое, чтобы обнажить небритую шерсть.
- Поместите ректальный датчик температуры, чтобы контролировать температуру животного и поддерживать ~37 °C с помощью грелки. Проводите проверки благополучия животных каждые 5-10 минут.
- Введите педальный рефлекс, чтобы подтвердить операционную плоскость анестезии и начать процедуру.
4. Рассечение тканей позвоночника
- С помощью лезвия скальпеля сделайте линейный разрез (~6-8 см) в ростральном и каудальном направлении (рис. 2А), начиная ниже основания шеи и проходя над грудным горбом, обнажая позвонки Т9-Т13.
- Аккуратно соедините заднюю соединительную ткань под местом разреза щипцами Graefe или ножницами с микропружинами, чтобы непосредственно обнажить мышечную ткань на позвоночнике.
- Определите отросток Т13, обнаружив два белых V-образных сухожилия рядом с каудальной половиной разреза. Остистый отросток прямо рострально к V на хвостовой стороне животного имеет вид Т13 (рис. 2В).
- Начиная с Т13 и двигаясь вверх к Т9, делайте небольшие разрезы в соединительных тканях между каждым отростком, чтобы разделить их, прежде чем очищать мышцу, чтобы сохранить местоположение по мере продвижения процедуры (Рисунок 2C). Затем разрежьте каналы в мышце, которые идут параллельно обеим сторонам остистых отростков, с помощью микроскриптеров. Проделайте это с обеих сторон позвоночника, чтобы обнажить пластинку каждого сегмента позвоночника (Рисунок 2D).
- Прикрепите зубчатые зажимы с обеих сторон мышечных стенок, чтобы сохранить открытое поле зрения к позвоночнику. Прикрепите одну пару по бокам от Т13, другую на границе Т11/Т12 и еще одну на Т11/Т10 (Рисунок 2E).
- Как только сформируются прозрачные каналы, отрежьте соединительную ткань между каждым процессом с помощью микроножниц или ронжеров (Рисунок 2F).
- Очищайте каналы до тех пор, пока соединительная ткань и мышца не будут аккуратно рассечены от каждой пластинки, от ростральной части Т13 до каудальной части Т9, обнажая сегменты Т10-12 для процедуры ламинэктомии. Об успешном завершении свидетельствует хорошо заметная пластинка по обе стороны от отростков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шага 4 микроскоп не требуется, но настоятельно рекомендуется.
5. Ламинэктомия
- Найдите каудальную часть пластинки Т12, которая перекрывает ростральную часть пластинки Т13, расположите кончик пластинки под ней и осторожно начните удалять кусочки пластинки, как рекомендовано в стандартных протоколах JoVE14,15 (Рисунок 2G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте щипцы, чтобы захватить остистый отросток каждой пластинки, чтобы сохранить стабильность и аккуратно «приподнять» пластины во время каждого разреза с помощью ронжеров (Рисунок 2G). При скольжении кончика ронжера под пластинкой поддерживайте внешнее давление в сторону от спинного мозга, чтобы свести к минимуму потенциальное повреждение.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть ронжер слишком глубоко под него при выполнении надрезов, так как это может повредить твердую мозговую оболочку и/или сам спинной мозг. - Двигаясь с одной стороны на другую, продолжайте отрезать куски кости от пластинки Т12 до тех пор, пока не останется достаточно места для расширения разреза до средней линии отростка, обнажая спинной мозг с отверстием примерно 5 мм в поперечнике (Рисунок 2H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление кости из позвоночного столба может привести к кровотечению, которое может снизить видимость во время процедуры. Используйте ватные палочки или свернутые безворсовые салфетки (дополнительный рисунок 1B), чтобы справиться с этим во время выполнения ламинэктомии. - Проработайте ронжеры под пластинкой с обеих сторон, а затем очистите ровный канал до краниальной части T12 (Рисунок 2I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг станет видимым по мере удаления кусочков пластины для каждого сегмента позвоночника. - Повторите шаги с 5.1 по 5.3, чтобы удалить T11 и T10.
- Продолжайте ламинэктомию, сохраняя ровные разрезы с обеих сторон, двигаясь рострально вверх до Т9 (рисунок 2J).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедур контузионной ТСМ (см. раздел «Репрезентативные результаты») пластинка над желаемым сегментом/сегментами спинного мозга должна быть очищена достаточно широко, чтобы можно было использовать устройство для лечения контузионной травмы (см. расширенную область в середине рисунка 2K). Для доставки лекарств ламинэктомия может быть достаточно широкой, чтобы визуализировать нанесение желаемого соединения. - Аккуратно промойте текальный мешок физиологическим раствором и подготовьте желаемую область для дуротомии после завершения ламинэктомии и удаления достаточного участка T10-T12 (Рисунок 2K).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура специфична для доступа к позвоночным сегментам (T10-T12), однако эти методы могут быть использованы для выполнения ламинэктомии на различных сегментах позвоночника.
6. Дуротомия для лечебного применения
- Выполните дуротомию (разрез твердой мозговой оболочки) с помощью зонда для рассечения для доступа к субдуральному пространству спинного мозга (рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте увеличение эндоскопа в зависимости от предпочтений хирурга в отношении видимости твердой мозговой оболочки. - Согните иглу 27-G под углом 90 градусов скосом вверх (Рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пару игольчатых приводов или гемостатиков, чтобы захватить иглу при сгибании. - Аккуратно проткните твердую мозговую оболочку кончиком иглы в нужной точке входа в спинной мозг (рисунок 3В).
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить подлежащий спинной мозг или его срединный кровеносный сосуд. - После того, как твердая мозговая оболочка будет проколота, осторожно поднимите иглу дорсально, чтобы разорвать круглое отверстие в твердой мозговой оболочке, не более 2 мм, по обе стороны от среднего кровеносного сосуда. Об успешной дуротомии свидетельствует небольшое количество утечки спинномозговой жидкости (СМЖ) из любого отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте дистанцию не менее нескольких мм от конца ламинэктомии, чтобы обеспечить более легкий доступ к субдуральному пространству. При необходимости осторожно повторно вставьте кончик иглы в исходное отверстие, чтобы увеличить его размер. - Убедитесь, что позиция, выбранная для разреза при дуротомии, и позиция непосредственно перед ней свободны от разветвленных кровеносных сосудов от средней линии кровеносного сосуда.
ВНИМАНИЕ: Не повреждайте кровеносный сосуд по средней линии, так как это вызовет чрезмерное кровотечение, препятствующее завершению процедуры. - Используя отверстия, сделанные в твердой мозговой оболочке, провести желаемое лечение или имплантировать устройство в субдуральное пространство. В рамках этого протокола для проведения лечения используются интратекальные катетеры, которые либо направляют устройство стимуляции в нужное положение, либо вводят гидрогель (рис. 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте чистое поле зрения, постоянно очищая кровь и/или спинномозговую жидкость после дуротомии. - Убедитесь, что кончики катетеров видны под твердой мозговой оболочкой, прежде чем переходить в спинной мозг. Об успешном применении свидетельствуют катетеры, плавно перемещающиеся по мелким спинномозговым кровеносным сосудам, находясь под твердой мозговой оболочкой.
- После проведения желаемого лечения (рис. 3D, E) поместите кусочек стерильной хирургической пены в пространство, созданное ламинэктомией, чтобы помочь гемостазу, заживлению ран и поддержанию структуры позвоночника.
- После установки гелевой пены используйте рассасывающийся шов из полидиоксанона 4-0, чтобы закрыть мышечный и кожный слой над позвоночником.
7. Послеоперационный уход
- Ежедневно проверяйте животных и давайте необходимые послеоперационные препараты (бупренорфин в течение 2 дней; энрофлоксацин и мелоксикам в течение 5 дней). Введите 1-3 мл физиологического раствора подкожно по мере необходимости (если в течение 24 часов в послеоперационном периоде потребляется <10% массы тела).
- В зависимости от процедуры контролируют функцию мочевого пузыря, моторику, шкалу гримас и любые другие признаки благополучия животного.
- Снимите кожные швы примерно через 10-14 дней после операции.
Результаты
Предложенный протокол был применен в двух различных экспериментальных условиях. Приведенные данные являются репрезентативными для групп без травм, поскольку цель состояла в том, чтобы продемонстрировать, что субдуральные манипуляции, описанные в процедуре (при отсутствии модели травмы), не ухудшают функцию. Было имплантировано биоэлектронное устройство (рисунок 1A) или введен гидрогель (рисунок 1B) у 6-8-недельных крыс Sprague-Dawley. Моторную функцию этих животных сравнивали с контрольной группой, перенесшим фиктивную операцию без субдуральной процедуры с использованием шкалы моторной функции ГЭБ. Здесь представлено несколько групп животных, показывающих жизнеспособность каждой процедуры и ее безопасность. После каждой процедуры все животные сохраняли нормальную двигательную функцию без разницы в баллах ГЭБ между группами через 7 дней после процедуры, что указывает на безопасное выполнение описанного протокола. Кроме того, для сравнения с группами, получавшими субдуральную процедуру, представлена группа животных (рис. 4C), демонстрирующих нарушение моторной функции задних конечностей, чтобы еще раз продемонстрировать, что в экспериментальных группах не было отмечено никаких побочных эффектов. Эта группа получила процедуру контузии ТСМ с усилием ударного устройства 175 кдын, как описано в предыдущей литературе12,13.
Биоэлектронный имплантат
Для имплантации устройства протокол включает в себя создание двух участков дуротомии - одного для входа в катетер, а другого для выхода, чтобы облегчить перемещение направляющих катетеров под твердой мозговой оболочкой и контролируемое размещение устройства. Биоэлектронное устройство состояло из двух раздвоенных плеч, прикрепленных к интерфейсу печатной платы, который инкапсулирован биосовместимым корпусом. Руки временно подключены к небольшим интратекальным катетерам с помощью шелкового шва 7-0 для облегчения позиционирования имплантата. Катетеры медленно протягиваются через ростральные дуротомические отверстия, проскальзывают под твердую мозговую оболочку и через выходные дуротомические отверстия каудально к месту лечения. Затем прикрепленные имплантаты были протянуты и размещены на каждом полусекции спинного мозга. Хвостовой конец имплантата пришивается к мышце, прикрепленной к отростку Т13. Корпус пришивается к трапециевидной/широчайшей мышце рострально к ламинэктомии. Затем обшивка закрывается вокруг основания жилого блока для обеспечения внешнего доступа.
Лечение гидрогелем
Для доставки гидрогеля требуется только точка входа. Гидрогель доставлялся через аналогичные интратекальные катетеры, расположенные в том же месте, что и устройство для стимуляции. Катетеры нагружали 10 мкл гидрогеля полоксамера12 и вводили в субдуральное пространство так же, как и этапы имплантации устройства. После установки катетеры медленно втягивались, в то время как гидрогель непрерывно высвобождался под твердой мозговой оболочкой (рис.1B) на каждом полукорде. После каждой процедуры за животными наблюдали в течение 7 дней, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
Для оценки двигательной функции использовалась 21-балльная шкала Бассо-Битти-Бреснахана (BBB)16. Животные в обеих группах оценивались до процедуры (исходный уровень) и через 1, 3 и 7 дней после операции. Поведение в открытом поле оценивалось непосредственно и с помощью слепых видеозаписей. Показатели двигательной функции как левых, так и правых задних конечностей в каждой группе сравнивались с неоперированными контрольными животными и отдельной группой ТСМ для определения степени любых побочных эффектов операции. Животные в группе имплантатов или гидрогеля не показали дефицита двигательной функции после любой из процедур, по сравнению с неоперированными контрольными группами или травмированными животными с ТСМ. Отметим, что гистологический анализ, подтверждающий отсутствие повреждения спинного мозга, уже был опубликован в нашей предыдущей работе. Это исследование показало, что использование этого метода для имплантации устройства не приводит к дополнительной травме спинного мозга в течение 7 днейпосле процедуры. Минимальные изменения как в активности астроцитов (GFAP), так и в микроглии/макрофагах (Iba1) наблюдались после имплантации устройства по сравнению с контрольными животными. Также были исследованы площадь поверхности и округлость участков коронального спинного мозга непосредственно под имплантатом, не показав никаких изменений в морфологии.
Рисунок 1: Стратегии субдурального лечения. (А) Пример имплантата и (Б) катетера/шприца, используемого для введения гидрогеля. (C) Репрезентативные модели имплантата и введения гидрогеля в спинной мозг крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Изображения ламинэктомии, представляющие операционное поле. (А) Ориентация животного для хирургических изображений на рисунках 2 и 3. (B) Ориентиры мышечных сухожилий для расположения отростка T13, чтобы направить начало рассечения мышцы. (C) Перпендикулярные надрезы для идентификации каждого процесса, подлежащего удалению с помощью ламинэктомии. (D) Мышечные каналы разрезаются параллельно спинномозговым отросткам, чтобы обеспечить доступ к костным пластинам для удаления. (E) Зубчатые зажимы Bulldog, используемые для удержания мышц/кожи по обе стороны позвоночника для обеспечения достаточного пространства для хирургического вмешательства. (F) Удаление белых сухожилий, соединяющих каждый отросток, перед началом ламинэктомии. (G) Хирургическое поле в начале ламинэктомии, когда ронжеры просовываются под пластину Т12, чтобы начать вырезание кости. (H) Первая половина отростка T12 удаляется, чтобы обнажить спинной мозг и предоставить хирургу достаточное пространство для рострального движения и начала удаления оставшихся отростков (T11/T10). (I) Удаление черепной части Т12 с полным удалением сегмента. (J) Ламинэктомия наполовину завершена в T11 с использованием более широких разрезов для наложения примера ушиба SCI. (K) Полная ламинэктомия после удаления сегментов T10-T12, полностью обнажая дорсальную поверхность спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Этапы выполнения дуротомии и применения целенаправленного лечения. (А) Схема расположения отверстий в твердой мозговой оболочке спинного мозга. (B) Операционное поле, показывающее иглу 27 G, проникающую в твердую мозговую оболочку для создания дуротомии; это делается с обеих сторон центрального кровеносного сосуда, как показано на рисунке (А). (C) Первоначальное введение катетера, используемого для лечения. (D) Устройство для электростимуляции, установленное на спинном мозге. (E) Катетеры, нагруженные гидрогелем для инъекций на поверхность спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Послеоперационное состояние и двигательная функция. (A) Репрезентативные изображения животных после имплантации устройства и доставки гидрогеля. (B) Репрезентативные оценки BBB животных с контузией позвоночника по сравнению с животными, которые либо перенесли субдуральную процедуру (имплантат или гидрогель), либо контрольными животными, у которых не было манипуляций. Размеры выборки контрольной (неоперированной), ТСМ и группы имплантатов были n = 5, а в группе гидрогеля были n = 3. Полосы ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительный рисунок 1: Хирургические инструменты. Фотография использованных хирургических инструментов. (1) Лезвие скальпеля #10. (2) Микроножницы Vannas. (3) Щипцы Грефе. (4) Зажимы Serrefine для бульдогов. (5) Ронжеры. (6) Игла 27 G для дуротомии. (7) Тонкие щипцы. (8) Шприц объемом 1 мл для применения физиологического раствора по мере необходимости. (9) Ножницы для вскрытия. (10) Гемостатики для наложения швов. (11) Заостренные ватные палочки. (12) Стерилизованные ватные шарики. (13) Скрученные безворсовые салфетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.
Дополнительный рисунок 2: Субдуральное и эпидуральное пространство. Схематическое изображение позвоночника и спинного мозга, демонстрирующее эпидуральную анестезию в сравнении с эпидуральной анестезией. субдуральное пространство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.
Обсуждение
Представленная здесь методика содержит пошаговые инструкции по доступу к спинальному субдуральному пространству и демонстрирует ее безопасность и осуществимость на двух примерах проведения лечения в грудном отделе спинного мозга 11,12. Многочисленные исследовательские группы разработали подходы к лечению травмы спинного мозга (ТСМ) с помощью электрических или химических вмешательств. Современные стратегии, включая имплантируемые устройства для оптогенетики17 или электростимуляции18, а также фармацевтическую терапию с использованием гидрогелей19,20, продемонстрировали различную степень успеха в содействии восстановлению и реабилитации. Тем не менее, точное нацеливание остается критической проблемой, поскольку большинство современных методов лечения проводятся за пределами субдурального пространства. Описанный здесь метод предлагает многообещающий подход к доставке вмешательств непосредственно в спинной мозг, включая средства долгосрочного доступа к субдуральному пространству (дополнительный рисунок 2), поддерживающий устойчивую и целевую доставку терапевтических агентов для лечения ТСМ и нейродегенеративных состояний. Это имеет важные последствия для обхода гемато-спинного барьера, что является основной проблемой в разработке эффективных методов лечения заболеваний спинного мозга.
Ламинэктомия
В то время как процедуры ламинэктомии у грызунов широко используются 17,21,22, необходимо отметить несколько критических аспектов протокола. Анатомические ориентиры, используемые в вышеуказанном протоколе (шаг 4.3; Рисунок 2А) обеспечивают доступ к нижнему отделу грудного отдела спинного мозга и специфичны для работы нашей группы. Если процедура должна быть применена к другому отделу позвоночника, можно посчитать сегменты либо ростральные, либо каудальные от начальных позвонков, чтобы определить местоположение. Еще одним важным фактором является степень удаления пластинки. Чтобы свести к минимуму риск нежелательной травмы спинного мозга во время процедуры, следует удалить как минимум два смежных уровня. Это обеспечивает достаточное пространство для дуротомии и правильную визуализацию. Такая мера предосторожности снижает риск травмирования мелких кровеносных сосудов во время введения катетера. Также следует избегать чрезмерного удаления кости из боковой стенки позвоночника, чтобы предотвратить ненужное кровотечение или нестабильность позвоночного столба после операции. Поддерживая баланс между адекватным доступом и минимальными нарушениями, процедура обеспечивает более безопасное и точное проведение лечения.
Дуротомия и введение катетера
Выполнение дуротомии требует точности, чтобы избежать проникновения в спинной мозг. Неправильное введение может привести к синякам или рваным ранам спинного мозга или субдуральных кровеносных сосудов. Отверстия, созданные в твердой мозговой оболочке, должны быть достаточно большими, чтобы вместить желаемую стратегию лечения, в данном случае диаметр интратекальных катетеров, без нарушения целостности мембраны. При выполнении дуротомии спинномозговая жидкость может вытекать при проколе твердой мозговой оболочки; Однако количество минимально. В то время как большие разрывы твердой мозговой оболочки могут привести к осложнениям, предыдущая литература предполагает, что небольшие проколы, такие как те, которые используются в описанном протоколе (шаг 6.4), способны к самовосстановлению за счет отложения коллагена/васкуляризации23, что приводит к отсутствию измеримых побочных эффектов после процедуры. При установке катетеров они должны быть введены как можно ближе к спинному мозгу, чтобы свести к минимуму риск травмирования от прямой силы. Осторожное обращение необходимо для предотвращения изгиба или обжима, обеспечения плавной установки и правильного позиционирования.
Послеоперационный уход
Послеоперационный уход после процедуры является важным фактором, учитывая, что грызуны, как правило, содержатся в групповом жилье в стандартных условиях. Агрессивное поведение или социальные взаимодействия после этой процедуры могут повлиять на результаты эксперимента, в зависимости от типа применяемого лечения. Результатом этого протокола является линия кожных швов длиной 6-8 см вдоль спины животного. Рекомендуется содержать животных в одном доме в течение 7-10 дней после операции, чтобы обеспечить заживление ран и предотвратить потенциальное снятие швов соседом по клетке. В случае применения для доставки лекарств, как только разрез заживет, они могут быть перемещены в предыдущие группы без явно агрессивного поведения или осложнений, связанных с процедурой. В случае имплантируемых устройств животные должны содержаться только группами по 2 человека. Мы обнаружили, что размещение животных в группах по 3 и более животных может привести к осложнениям, связанным с агрессией, и исходам лечения.
Применение лечения
Несмотря на то, что описанная здесь процедура ориентирована на грудной отдел спинного мозга и две конкретные стратегии лечения, она может быть адаптирована для других областей позвоночника и дополнительных терапевтических применений. Подобные процедуры ламинэктомии были успешно выполнены на различных уровнях позвоночника у моделей грызунов. Тем не менее, небольшое субдуральное пространство у грызунов представляет собой проблему, оставляя минимальное пространство для ошибок во время лечения. В то время как этапы ламинэктомии и дуротомии могут быть легко выполнены теми, кто имеет опыт операций на грызунах, точное размещение устройства или лекарства под твердой мозговой оболочкой без причинения травмы может потребовать дополнительного времени на обучение. В дополнение к хирургической подготовке, есть несколько факторов, которые могут помочь в применении лечения. Поддержание четкого поля зрения во время лечения имеет решающее значение. Убедитесь, что при использовании интратекальных катетеров, как описано в этом исследовании, на катетерах нет зазубренных или шероховатых пятен, прежде чем вставлять их под твердую мозговую оболочку. Как уже упоминалось выше, место проведения дуротомии крайне важно. Чем дальше точка входа катетера находится от оставшейся ростральной пластинки, тем легче выровнять катетеры и оставаться параллельными спинному мозгу во время введения. Также следует учитывать сроки разработки стратегии лечения в связи с травмой. Будущая работа будет включать в себя внедрение этих процедур у животных в различные моменты времени после травмы, чтобы впоследствии можно было оценить методы лечения, направленные на лечение хронических травм. Этот протокол представляет собой значительный шаг вперед в применении лечения неврологических заболеваний спинного мозга и обеспечивает универсальный и точный подход к доставке терапии непосредственно в ткани спинного мозга.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансируется CatWalk Spinal Cord Injury Trust и исследовательской стипендией HRC сэра Чарльза Херкуса (BH). Эта работа также была поддержана помощником министра обороны по вопросам здравоохранения, одобренной Министерством обороны, в размере 534 258 долларов США в рамках Программы исследований травм спинного мозга в рамках Гранта No. ХТ9425-23-1-0492. Схемы на рисунках 2A и 3A были сгенерированы с использованием Biorender.com.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шприцы по 1 мл и 3 мл | Amtech | ||
| 1 мл шприцев для туберкулина | BD | 302100 | |
| 2 x щипцы Graefe | FST | 11051-10 | |
| Иглы по 25 г для введения лекарств | Nipro | SH811 | |
| Иглы 27G для дюрального разреза | Nipro | SH816 | |
| 6 x зажимов Tissue Bulldog | FST | 18051-28 | |
| 70 % этанола | |||
| Байтрил 5 мг/кг | Эланко | KV04UHU | |
| Латексные перчатки Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Бупивикаин 2 мг/кг | Аспен, Новая Зеландия | 2023-02 | |
| Бупренорфин 0,05 мг/кг | Чева (Ветергесик) | 9000320 | |
| Настойка хлоргекса и эхтанола | Перриго | K076A | |
| Хлорхексовый скраб | Шульке | LBL11258 | |
| Изогнутые ронжёры | FST | 16021-14 | |
| Щипцы Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Гель-пена — стерильная впитывающаяся желатиновая губка | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Шприц Гамильтона | Гамильтон | 80314 | |
| Грелка (37 oC) | Кентский научный институт | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Импактор и программное обеспечение Infinite Horizon | Прецизионные системы и приборы (PSI) | IH-0400 | |
| Изофлуран | Medsource | неизвестно | |
| Metacam 2 мг/кг | Бёрингер Ингельхайм | D02818 | |
| Неусашиваемые швы (Этилон 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2 tank | |||
| Хирургический микроскоп Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Прессуйте и запечатайте пластиковую пленку для драпировки | Рад | Н/Д | |
| Рукоятка скальпеля | Тонкие научные инструменты (FST) | 10004-13 | |
| Скальпелевые лезвия размера 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Индукционный комплекс Somnoflow | Кент Сайентифик | SF-01 | Система низкотечной анестезии |
| Стерильные впитывающие подушечки и вата | Швейцарцы | Н/Д | |
| Стерильные ватные палочки (стандартные + заострённые) | help@hand | Н/Д | |
| Стерильный физиологический раствор 0,9% | Сделано и автоклавировано в лаборатории | Н/Д | |
| Стерильные участки свернутого Ким Вайпа | Кимтех Сайънс | 34155 | |
| Температурный зонд | Кентский научный институт | SF-01 | |
| Весенние ножницы Ваннас | FST | 15903-08 | |
| Смазка на водной основе | |||
| Весы | Любой | Н/Д |
Ссылки
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 3, 17018(2017).
- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
- Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 282(2019).
- Chari, A., Hentall, I. D., Papadopoulos, M. C., Pereira, E. A. Surgical neurostimulation for spinal cord injury. Brain Sci. 7 (2), 18(2017).
- Krucoff, M. O., et al. Spinal cord stimulation and rehabilitation in an individual with chronic complete L1 paraplegia due to a conus medullaris injury: Motor and functional outcomes at 18 months. Spinal Cord Ser Cases. 6 (1), 96(2020).
- Chalif, J. I., et al. Epidural spinal cord stimulation for spinal cord injury in humans: A systematic review. J Clin Med. 13 (4), 1090(2024).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nat Med. 29 (3), 689-699 (2023).
- Calvert, J. S., Grahn, P. J., Zhao, K. D., Lee, K. H. Emergence of epidural electrical stimulation to facilitate sensorimotor network functionality after spinal cord injury. Neuromodulation. 22 (3), 244-252 (2019).
- Capogrosso, M., et al. Advantages of soft subdural implants for the delivery of electrochemical neuromodulation therapies to the spinal cord. J Neural Eng. 15 (2), 026024(2018).
- Kwiecien, J. M., et al. Neuroprotective effect of subdural infusion of serp-1 in spinal cord trauma. Biomedicines. 8 (10), 372(2020).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), e2105913(2022).
- Meissner, S., et al. Safe subdural administration and retention of a neurotrophin-3-delivering hydrogel in a rat model of spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), 25424(2024).
- Harland, B., et al. Daily electric field treatment improves functional outcomes after thoracic contusion spinal cord injury in rats. bioRxiv. , (2024).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. 78, e50111(2013).
- Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. (205), e66463(2024).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Shalileh, S., Moallemi, A., Tsuyuki, B., Simard, A. A. P., Shahriari, D. Implantation of optoelectronic devices in the rodent spinal cord. J Vis Exp. (209), e66992(2024).
- Hachmann, J. T., et al. Epidural spinal cord stimulation as an intervention for motor recovery after motor complete spinal cord injury. J Neurophysiol. 126 (6), 1843-1859 (2021).
- Ye, J., et al. Rationally designed, self-assembling, multifunctional hydrogel depot repairs severe spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100242(2021).
- Wu, W., et al. Supramolecular hydrogel microspheres of platelet-derived growth factor mimetic peptide promote recovery from spinal cord injury. ACS Nano. 17 (4), 3818-3837 (2023).
- Pietruczyk, E. A., Stephen, T. K. L., Alford, S., Lutz, S. E. Laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse. J Vis Exp. (152), e58330(2019).
- Zhou, X. H., et al. Design and evaluation of a novel laminectomy auxiliary device based on rats. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 28 (3), 621-628 (2020).
- Ahmadi, S. A., et al. The effect of L-arginine on dural healing after experimentally induced dural defect in a rat model. World Neurosurg. 97, 98-103 (2017).
Перепечатки и разрешения
Теги
