Определение структуры гемагглютинина с субнанометровым разрешением по данным криоэлектронной томографии вирусов гриппа

Криоэлектронная томография (криоэлектронная томография) применяется в последние десятилетия для получения снимков белковых комплексов, вирусов, клеток и организмов. Метод криоэлектронной микроскопии (криоЭМ), криоЭТ представляет собой метод структурной биологии, при котором биологический образец замораживается, а затем визуализируется в различных направлениях с помощью наклона ^1,2,3. Изображения, полученные в каждой ориентации, затем с помощью вычислений выравниваются по их общей оси наклона и реконструируются в томограмму для получения трехмерного^{изображения4}.

В то время как рентгеновская кристаллография и криоЭМ с одиночными частицами требуют очищенных, структурно однородных молекул, cryoET может визуализировать молекулу непосредственно в ее нативном контексте^. Таким образом, одним из основных преимуществ cryoET является его способность визуализировать плеоморфные образцы, такие как мембранозные вирусы, включая грипп ^5,6,7. Еще одним преимуществом cryoET является его способность получать изображения в разных масштабах. В то время как томограммы обычно не разрешаются после 5-10 нм⁸, интегрирование усреднения субтомограммы, когда копии одной и той же частицы идентифицируются, выравниваются и усредняются, может привести к близкому к атомному разрешению в некоторых биологических молекулах, таких как рибосомы ^9,10. Однако только ограниченные типы молекул могут достичь этого разрешения; Средние значения субтомограммы обычно не превышают разрешения 10-15 Å. В отличие от этого, криоЭМ с одной частицей обычно достигает разрешения 3-4 Å после обращения с^{разрешением11}. Последние достижения в области более высокой производительности программного обеспечения для сбора и анализа данных cryoET позволили определять структуру дополнительных биологических молекул с субнанометровым разрешением в их естественном контексте 12,13,14,15,16,17,18.

Одним из распространенных применений cryoET является визуализация морфологии, организации и структуры вируса. Несмотря на более низкое разрешение, обеспечиваемое этим методом по сравнению с криоЭМ или рентгеновской кристаллографией с использованием одиночных частиц, криоЭТ в сочетании с усреднением субтомограммы может предоставить информацию о том, как вирусные белки ведут себя в своей родной среде, и предоставить важные детали об их организации в контексте вириона. Общей мишенью для криоЭТ вирусов являются поверхностные гликопротеины, которые обычно используются для прикрепления и слияния клеток хозяина, поскольку они часто являются основными антигенами и мишенями для терапевтических средств или вакцин. С недавними достижениями в области обработки криоЭТ становится все более возможным достижение субнанометрового разрешения этих гликопротеинов 19,20,21,22. Одним из таких примеров является гемагглютинин (ГК), основной белок на поверхности вирионов гриппа. Этот белок не только осуществляет связывание рецепторов и слияние мембран, но и покрывает вирион невероятно плотным образом, с сотнями и тысячами ГК на одном^{вирионе 5}. Представленный здесь протокол (рис. 1) объединяет несколько часто используемых пакетов с внутренними скриптами для разграничения этапов от предварительной обработки до уточнения модели для субтомограммы среднего уровня ГК гриппа.

ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры наборов данных, используемых для этого протокола, можно получить по адресу EMPIAR-12864, который включает в себя два набора наклонных серий, используемых для этого протокола. Серии наклона собраны из вручную погруженных сеток очищенного вируса гриппа А с физическим размером пикселя 2,09 Å/пиксель, чтобы обеспечить достаточно большое поле зрения, чтобы каждая серия наклона содержала несколько вирионов, а также для рендеринга реконструкций с максимально возможным разрешением. Для собственных наборов данных пользователей рекомендуется начинать рабочий процесс с необработанных фильмов с наклоном. Эти наборы данных были обработаны и визуализированы с помощью высокопроизводительных рабочих станций. В Таблице материалов перечислены аппаратные и программные средства, используемые для этого протокола. Все программные пакеты, используемые в этом протоколе, имеют открытый исходный код и доступны для скачивания; Ссылки на установку и инструкции приведены в Таблице материалов. Рекомендуемая рабочая станция для обработки наборов данных cryoET должна быть оснащена как минимум 8-ядерным процессором, выделенной картой GPU с 6 ГБ видеопамяти, 64 ГБ ОЗУ и 2 ТБ локального хранилища.

1. Предварительная обработка данных наклонных фильмов и реконструкция криоэлектронных томограмм в Warp ²³ и IMOD ²⁴

1. В терминале активируйте среду conda, в которой установлен Warp, с помощью следующей команды:
   conda activate warp_environment
2. Создайте файл настроек серии кадров для обработки серий кадров. Это файл конфигурации, который содержит метаданные о микроскопе, местоположении данных для обработки и месте хранения выходных файлов.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти данные были собраны в режиме сверхвысокого разрешения.
3. Проведение оценки контрастной передаточной функции (CTF) и коррекции движения.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   ПРИМЕЧАНИЕ: m_grid параметр должен соответствовать количеству субкадров в tilt movie - наши наборы данных состояли из 5 субкадров на tilt movie.
4. Импортируйте метаданные наклонных серий, чтобы WarpTools мог определить, какие фильмы принадлежат к каким наклонным сериям.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. После заполнения папки tomostar создайте файл настроек серии tilt для обработки серии tilt
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Записывайте стеки наклона и выполняйте автоматическое выравнивание ряда наклонов на основе реперных точек с помощью программы batchruntomo от IMOD с графическим интерфейсом Etomo²⁴.
   1. Выполните в терминале следующую команду:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклонные серии были экспортированы с размером, в 4 раза превышающим физический размер пикселя, чтобы уменьшить время юстировки и вычислительные ресурсы.
   2. Выберите пример набора данных, чтобы сначала задать параметры выравнивания, прежде чем применять их в качестве шаблона для batchruntomo.
   3. Импортируйте параметры выравнивания из IMOD при использовании batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого набора данных использование графического интерфейса Etomo дало лучшие результаты, чем оболочки в WarpTools.
   4. В качестве альтернативы можно провести автоматизированное выравнивание реперных крестных точек с помощью обертки AreTomo²⁵ в WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оболочка AreTomo была протестирована с AreTomo 1.3.4.
7. Выполните следующую команду в терминале для оценки параметров CTF для наклонных серий:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Реконструируйте томограммы с помощью WarpTools.
   1. Устанавливаем переменную окружения:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что томограммы будут совместимы с последующими этапами обработки и визуализации изображений в других программах, используемых в этом протоколе.
   2. Для восстановления томограмм выполните в терминале: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Повторите шаги 1.2 - 1.8.2 для всех наборов данных.

2. Предварительная обработка томограммы и отбор частиц

1. В терминале активируйте среду conda с установленным IsoNet²⁶ .
   conda activate isonet_env
2. Подготовьтесь к обработке томограмм, сначала создав подпапку и переместив все томограммы в эту папку.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Сгенерируйте файл звезды в папке проекта.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. С помощью текстового редактора откройте сгенерированный файл звезды и введите приблизительное значение расфокусировки для изображений с наклоном 0 градусов в четвертом столбце (_rlnDefocus) для каждой томограммы, которое может находиться в файле processed_items.json в папке warp_tiltseries.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значение расфокусировки должно быть выражено в ангстремах для IsoNet. Warp записывает значения расфокусировки в мкм, для чего требуется коэффициент умножения 10 000.
5. Выполните команду деконволюции CTF в терминале.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. После деконволюции запустите EMAN2 GUI²⁷ , чтобы начать предварительную обработку томограмм для отбора частиц.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. В разделе «Томография» щелкните левой кнопкой мыши стрелку рядом с пунктом «Исходные данные » и выберите «Импортировать томограммы » в раскрывающемся меню.
8. Щелкните левой кнопкой мыши по стрелке рядом с пунктом Сегментация и выберите Предварительная обработка томограмм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры по умолчанию, скорее всего, подходят для многих наборов данных. Для этих томограмм был применен фильтр нижних частот при 4 Å и нормализованы изображения наклона. После предварительной обработки EMAN2 автоматически сгенерирует информационный каталог с пустыми файлами .json (с базовыми именами, аналогичными предварительно обработанным файлам). Перед выбором частиц angpix необходимо добавить в файлы json.
9. Обучить сверточную нейронную сеть (СНС) распознаванию гликопротеина HA.
   1. Измените рабочий каталог на расположение томограмм, которые будут использоваться для обучения СНС и выбора частиц:
      cd path/to/tomograms
   2. Используйте терминал для открытия окна обучения CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Убедитесь, что открыты четыре окна: одно содержит информацию о параметрах СНС и томограммах в каталоге, а остальные три окна содержат изображения хороших ссылок (Положительные), плохих ссылок (Отрицательные) и частиц, выбранных СНС (Частицы).
   4. Щелкните левой кнопкой мыши кнопку « Создать » в графическом интерфейсе CNN, чтобы инициализировать новую CNN. Установите коэффициент обучения по умолчанию равным 0,0001 и размер коробки равным 8.
   5. В столбце FileName щелкните левой кнопкой мыши репрезентативную томограмму, чтобы открыть ее в новом окне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременно может быть открыта только одна томограмма.
      1. Чтобы перемещаться по оси Z томограммы, наведите курсор на открытую томограмму и нажмите колесико прокрутки компьютерной мыши, чтобы открыть новое окно. Ползунок с надписью N# изменит ось z.
   6. На открытой томограмме выберите 10-20 признаков, соответствующих ХА, с помощью левой кнопки мыши на панели Позитив.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите вид сверху и сбоку HA, которые отображаются либо в виде цилиндров, либо в виде треугольников над мембраной, в качестве хороших ориентиров для более надежной сети.
      1. Изображения положительных ссылок появятся в окне «Позитив ». Чтобы удалить образец, удерживайте клавишу Shift и щелкните левой кнопкой мыши по образцу.
   7. Переключитесь на негативную панель и выберите 10-20 ссылок, соответствующих таким признакам, как пустые участки мембраны, плотность vRНП, реперные знаки и мусор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ссылки появятся в окне «Негатив».
   8. Запустите обучение CNN, щелкнув левой кнопкой мыши по кнопке «Обучение » в главном окне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество итераций (Niter) в главном окне изменяет количество итераций обучения, которое проходит CNN. Рекомендуем установить значение параметра 50.
   9. После того, как СНС будет обучена на выбранных ссылках, щелкните левой кнопкой мыши « Применить », чтобы использовать СНС для выбора частиц в открытой томограмме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения выбранных частиц можно увидеть в окне Частицы. Выбранные частицы также будут отображаться на томограмме в виде синих кругов.
   10. Продолжайте выбирать положительные и отрицательные референции на основе применяемой сети, периодически сохраняя прогресс через кнопку Сохранить .
   11. После того, как все будет удовлетворено, выберите «Применить все », чтобы СНС выбрала частицы на всех томограммах в каталоге и оценила результаты на нескольких томограммах; При необходимости проводите дополнительное обучение.
10. Сохраните координаты в текстовый файл для каждой томограммы.
    1. Откройте графический интерфейс EMAN2 с помощью e2projectmanager.py команды.
    2. Нажмите на стрелку рядом с пунктом Среднее значение субтомограммы и нажмите Ручная упаковка.
    3. Введите название томограммы и нажмите кнопку Запустить.
    4. Сохраните координаты в текстовом файле, выбрав Файл > Сохранить поле координат > tomogram_ha.txt.
    5. Перейдите в подпапку neuralnets и подпапку info для резервного копирования nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf и boxes3dref.hdf.
11. Чтобы убедиться, что анализ выполняется только на полностью собранных вирионах, где очевидно присутствие слоя белка матрикса (M1) и комплекса вирусного рибонуклеопротеина (vRNP), обучите вторую сверточную нейронную сеть распознавать белок M1.
    1. Следуйте тому же протоколу, что и в шаге 2.9, изменяя размер тренировочного бокса с 8 на 14.

3. Курирование частиц

1. Скачать блокноты из https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Откройте блокнот CNN_Particle_Cleaning.ipynb и загрузите необходимые модули.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт использует Open3D²⁸ в качестве пакета для визуализации координат частиц в виде 3D-облаков точек.
3. Загружайте текстовые файлы, соответствующие координатам HA и M1, и просматривайте их в виде 3D-облаков точек с помощью пакета Open3D.
4. Отфильтруйте выбросы по координатам HA с помощью статистического удаления выбросов, как это реализовано в Open3D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые начальные значения для HA: nb_neighbors = 50 (количество соседних координат вокруг координаты) и std_ratio = 0,5.
5. Вычислите расстояние между облаками точек HA и M1. Все координаты HA на расстоянии более 20 пикселей от облака точек M1 будут идентифицированы как выбросы. Все координаты частиц, не обозначенные как выбросы, будут сохранены в выходном файле .txt.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 20 пикселей соответствуют приблизительному расстоянию 16 нм с размером пикселя 8,35 Å/пиксель. На наших томограммах центр тримера ГК до слоя М1 составляет примерно 15 нм.
6. Объедините все частицы и сохраните их как звездные файлы с помощью pts2starfile.ipynb.

4. Итерационное усреднение и классификация субтомограмм

1. С помощью WarpTools извлеките частицы с коэффициентом биннинга 4 и проведите начальные раунды усреднения субтомограммы в RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый размер блока 48 x 48 x 48 пикселей, что соответствует прямоугольнику ~360 ų, которая будет достаточно большой, чтобы вместить массив размером 7-8 HA.
   1. Конвертация starfile warp в файл, совместимый с RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Создайте исходный эталон с помощью relion_refine_mpi на подмножестве частиц.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Используйте relion_refine_mpi для проведения 3D автоуточнения на субтомограммах.
      1. Пример команды: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная глобальная и локальная выборка была установлена на 7,5 и 1,8 градуса, что соответствует порядку healpix 4 и локальному healpix 2. Первоначальные усовершенствования в основном используют сильную плотность мембраны, белка M1 и матрицы HA. Диапазон смещения трансляции может быть больше, чтобы охватить любые сдвиги, которые могут произойти при выравнивании массива.
   4. Повторите уточнение после того, как первый прогон уточнения сойдется, изменив перевод на 8 и шаг на 2.
2. Используйте 2D-классификацию для отбрасывания ненужных частиц с помощью relion_refine.
   1. Пример команды: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2D классификация была использована вместо 3D классификации, так как она более эффективна с точки зрения вычислений. Субтомограммы могут быть непосредственно использованы в качестве входных данных для задания 2D-классификации без дополнительной обработки изображений.
   2. Объедините классы, содержащие идентифицируемый массив HA, содержащий цилиндрическую HA, мембрану и плотность M1, используя relion_star_handler.
   3. Во-первых, создайте звездные файлы, содержащие хорошие классы.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Затем используйте следующую команду relion_star_handler для объединения отдельных файлов звездочек.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Повторное извлечение в бункере 2 и небинированных частиц для итеративного локального измельчения.
   1. Для уточнения bin2 извлеките частицы, используя коробку меньшего размера 80, и выполните локальный поиск с healpix и локальным healpix, установленными на 4 (локальная угловая выборка 1,8 градуса).
   2. На этом этапе объединим наборы частиц из разных наборов данных с помощью relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. После первого раунда доработки создайте цилиндрическую маску с использованием e2filtertool.py в среде EMAN2, которая охватывает центральную мембрану HA плюс и плотность M1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые для цилиндрической маски: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; Все остальные параметры не отмечены.
   4. Проведите еще один раунд доработки с наложенной маской.
   5. Проведите еще один раунд 2D-классификации, чтобы исключить выбросы, которые не совпадают с центральной HA, и дополнительный мусор.
   6. Повторите процесс с необъединенными частицами с размером коробки 120 и создайте мягкую маску, которая покрывает центральную HA, выровняйте ссылку на симметрию C3 и примените симметрию на этом этапе уточнения.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговое разрешение, достигнутое с помощью RELION, составило 6,1 Å.
4. Финальная доработка в MTools⁹
   1. Создайте популяцию уточнения (после активации среды Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Добавьте источники данных для каждого набора данных.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Повторите предыдущий шаг с дополнительными наборами данных.
   3. Создадим доработанный вид.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Измельчение нескольких частиц.
      1. Сначала уточните позы частиц с помощью команды: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Затем уточните как позы частиц, так и сферическую аберрацию с помощью команды: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         ПРИМЕЧАНИЕ: На этом доработка была остановлена, так как дальнейшие итерации не улучшали разрешение. Однако различные комбинации параметров, которые не были исчерпывающе протестированы, могут продолжать улучшать результаты.

5. Доработка модели

1. Используя ChimeraX³⁰, загрузите итоговую карту и атомную модель HA.
2. Сегментируйте и объедините все сегменты, соответствующие эктодомену HA, и используйте инструмент «По размеру сегментов » для закрепления в модели HA.
   1. Сохранение преобразованных координат модели.
3. Откройте графический интерфейс Phenix³¹ и используйте инструмент Уточнение реального пространства .
   1. При появлении запроса на добавление файлов добавьте преобразованную модель высокой доступности и карту, а затем заполните разрешение окончательной реконструкции.
   2. Проведите пять раундов глобальной минимизации, локальной установки ротамеров, уточнения занятости и групповой оптимизации ADP.
4. Визуализируйте окончательную реконструкцию и моделируйте с помощью ChimeraX.

Чтобы продемонстрировать использование этого протокола обработки (рис. 1), ранее описанный рабочий процесс был применен к двум наборам данных из 25 томограмм, объединенных из штамма вируса гриппа А H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). Параметры сбора данных приведены в таблице 1. На рисунке 2 показана репрезентативная томограмма и увеличенные изображения плеоморфных вирионов гриппа. На этой томограмме отражены различные морфологии, так как вирионы варьируются от сферической до овальной/вытянутой формы. В то время как большинство частиц гриппа содержат хорошо организованные сборки M1 и vRNP, некоторые вирионы, по-видимому, более дезорганизованы и лишены важных структурных компонентов.

Из этого набора данных первоначальный набор из 40 995 субтомограмм был использован для реконструкции bin4 (8,35 Å/пиксель) после отбора и курирования частиц. Два набора данных изначально обрабатывались независимо друг от друга в RELION4 с симметрией C1 и широкой сферической маской, которая охватывала весь массив HA. Для этих субтомограмм было проведено три цикла уточнения с последующей 2D-классификацией. После классификации были отброшены субтомограммы с низким разрешением и мусорные частицы; Оставшиеся субтомограммы были извлечены в BIN2 (4,17 Å/пиксель) и два набора данных были объединены. Субтомограммы BIN2 сначала выравнивали друг с другом в раунде усреднения субтомограмм, затем наносили цилиндрическую маску вокруг центральной ХА для выравнивания фокуса. На этом этапе тримерная симметрия может быть четко визуализирована для реконструкции HA. Дополнительные раунды доработки проводились при bin2 и при 2,8 Е/пиксель. Последний раунд 2D-классификации проводился с небольшой маской, покрывающей только центральный тример ГК с выровненными субтомограммами. Основной класс, состоящий из ~94% оставшихся субтомограмм, был экстрагирован до небингированных частиц и подвергнут 3D-рафинированию с применением С3-симметрии. Наконец, эти субтомограммы были экспортированы в М, где были проведены циклы обработки поз частиц и сферических аберраций (дополнительный рисунок 1).

Итоговое среднее значение субтомограммы (рис. 3A), состоящее из 15 970 частиц HA, достигло глобального разрешения 6,0 Å и локального диапазона разрешения 5-7 Å (рис. 4). Модель PR8 HA была гибко доработана до плотности; при FSC=0,5 и FSC=0,143 разрешение map-to-model составило 8,1 Å и 6,6 Å соответственно. Архитектура реконструкции HA сильно напоминала предыдущие карты cryoEM и cryoET. При таком разрешении можно различить альфа-спирали и бета-листы (рисунок 3B); кроме того, гликаны могут начать идентифицироваться в четырех сайтах гликозилирования на головке и стебле гиалуроновой кислоты (рисунок 3C).

Наши результаты показывают пригодность криоЭТ в реконструкции ГК из нативных вирионов гриппа. С помощью протокола наблюдалась четкая плотность цилиндрического гликопротеина перпендикулярно вирусной мембране, и разрешение улучшалось на каждом этапе. Для собственных данных предлагается, чтобы усреднение субтомограммы начиналось с бинированного стека частиц, а результаты тщательно отслеживались на каждом цикле уточнения. Если плотность гликопротеинов не очевидна с начальных стадий, рекомендуется нанести местоположения субтомограммы обратно на томограмму для проверки точного позиционирования. В противном случае можно настроить параметры выравнивания или внедрить дополнительные этапы классификации для достижения оптимальных результатов.

Рисунок 1: Общий конвейер для усреднения субтомограммы HA из криоET вируса гриппа. На верхней панели представлен сводный рабочий процесс для двух наборов данных, используемых для демонстрации протокола. Вторая панель соответствует разделу 1 протокола, третья панель соответствует разделам 2-3, а четвертая панель соответствует разделам 4-5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативная томограмма вируса гриппа PR8. (A) Срез реконструированной томограммы. Масштабная линейка – 100 нм. (Б-Г) Увеличенный вид (B) сферический, (C) цилиндрический, (D) без M1-вириона PR8. Все масштабные линейки в B-D соответствуют 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Среднее значение субтомограммы PR8 HA. (A) Вид сверху и сбоку реконструкции HA на двух контурных уровнях, гибко подогнанных с одной частицей PR8 HA cryoEM. (B) Обрезанные виды в процессе реконструкции HA. Цветные стрелки соответствуют цветным прямоугольникам. (C) Реконструкция ГК показана в нижнем контуре для выявления плотности гликанов. Также показаны виды гликанов крупным планом в представлении палочек на карте cryoET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Оценка разрешения среднего субтомограммы HA. (A) Оценка локального разрешения среднего субтомограммы HA, отображенного на реконструкции. Цветовая полоса изображает 5-7 Å на сине-бело-красной палитре. (B) Кривые FSC половинных карт и разрешения от карты к модели. Синяя кривая — это реконструкция без маски, а красная — замаскированная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Параметры сбора данных для наборов данных cryoET вируса гриппа PR8.

Дополнительный рисунок 1: Рабочий процесс усреднения субтомограммы для ГК. Итеративное выравнивание, усреднение и классификация проводятся для субтомограмм HA путем постепенного разбивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.