Интеллектуальный структурный цветной гидрогелевый пластырь, объединяющий диагностику и лечение хронического остеомиелита

Краткое содержание

В этом исследовании представлен умный структурный цветной гидрогелевый пластырь (ЦПГ) для диагностики и лечения хронического остеомиелита (ХОМ). Пластырь включает в себя термочувствительный гидрогель GelMA, чувствительный к pH каркас CSMA-PBA и салициловую кислоту для контролируемого высвобождения лекарств, мониторинга инфекций и стимулирования регенерации тканей.

Аннотация

Хронический остеомиелит (КОМ) — это персистирующая инфекция костей, которую трудно лечить обычными антибиотиками из-за таких проблем, как устойчивость к лекарствам и неблагоприятные побочные эффекты. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новый умный структурный цветной гидрогелевый пластырь (CPG) как для диагностики, так и для лечения COM. Пластырь сочетает в себе метилакрилированный хитозан, модифицированный фенилбороновой кислотой (CSMA-PBA) в качестве каркаса, термочувствительный гидрогель GelMA в качестве наполнителя и салициловую кислоту (SA) для доставки лекарств. Характеристика показала отличные механические свойства и адгезионную прочность. Эксперименты по высвобождению лекарств подтвердили, что CPG эффективно реагирует на изменения pH, обеспечивая контролируемое высвобождение лекарств. CPG также служит диагностическим инструментом, обнаруживая изменения pH и температуры в месте инфекции, способствуя послеоперационному восстановлению. Антимикробные тесты показали значительное ингибирование роста бактерий, а эксперименты in vitro продемонстрировали способность CPG стимулировать экспрессию фактора роста эндотелия сосудов при одновременном снижении маркеров воспаления. В исследовании подчеркивается многофункциональность гидрогелевого пластыря, включая противомикробное, противовоспалительное и проваскулярное действие, что делает его перспективным терапевтическим вариантом при хроническом остеомиелите.

Введение

Хронический остеомиелит стал серьезной проблемой для пациентов из-за сложного и длительного процесса лечения, высокого риска неудачи лечения и рецидива¹. Современные стратегии лечения остеомиелита включают хирургическую обработку некротической ткани и парентеральные антибиотики. Тем не менее, потребность в высоких дозах антибиотиков для обеспечения терапевтических уровней в месте действия остается неэффективной в лечении заболевания. Кроме того, использование высоких доз антибиотиков связано с неблагоприятными осложнениями, такими как нефротоксичность, ототоксичность, устойчивость к антибиотикам и побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта. Местная доставка антибиотиков может быть более подходящей стратегией для преодоления этих недостатков. В то время как местная доставка антибиотиков может лечить инфекции костей с минимальными побочными эффектами, стимуляция регенерации костей имеет решающее значение для успешного лечения². Таким образом, одновременный прием антибиотиков и факторов роста костей представляется перспективной стратегией лечения. В течение последних нескольких десятилетий небиоразлагаемый полиметилметакрилат (ПММА) был основой местной антибиотикотерапии при остеомиелите. Тем не менее, использование ПММА в качестве местной системы доставки антибиотиков сталкивается с ограничениями, такими как необходимость повторной операции по удалению гранул, образование бактериальной биопленки, способствующей поверхностной колонизации, долгосрочное высвобождение антибиотиков на субтерапевтических уровнях, приводящее к устойчивости к антибиотикам, системная токсичность остаточных мономеров и отсутствие индуктивных свойств кости³. Таким образом, разработка биоразлагаемых систем локальной доставки с использованием биосовместимых полимеров может преодолеть эти недостатки. В литературе высказывается предположение, что наночастицы фиброина шелка (SFNP), включенные в шелковый каркас для местной доставки ванкомицина, могут быть использованы для лечения тяжелого остеомиелита. Однако отсутствие в нанокомпозитном материале каких-либо индуктивных молекул кости привело к тому, что приготовленные конструкции существенно не индуцировали регенерацию кости. Таким образом, разработка нанокомпозитных каркасных материалов, пригодных для лечения хронического остеомиелита, является сложной проблемой. Гидрогели на основе натуральных полимеров привлекли широкое внимание благодаря их структурному сходству с внеклеточным матриксом (ВКМ) и их способности контролировать высвобождение лекарств⁴.

Одной из отличительных особенностей гидрогелей является их чувствительность к различным факторам, таким как температура и pH. Хронические инфекции могут повышать pH из-за микробной нагрузки, нарушения баланса регенерации-деградации и усиленных метаболических реакций распада. Кроме того, хирургическое иссечение обработанного материала, такого как некротизированная ткань и гной, может ускорить переход pH к более высоким значениям⁵. Таким образом, использование pH-чувствительных гидрогелей, способных распознавать pH хронической инфекции, имеет решающее значение для прогноза хронического остеомиелита.

В этом исследовании мы предлагаем комплексный подход к диагностике и лечению с использованием интеллектуального структурного цветного гидрогелевого пластыря, обладающего необходимыми свойствами для лечения хронического остеомиелита, как показано на рисунке 1. Супрамолекулярные гидрогели, полученные в результате сборки супрамолекулярных полимерных сетей, представляют собой привлекательные материалы, аналогичные естественному внеклеточному матриксу (ВКМ). Благодаря своим превосходным свойствам, включая соответствующую механическую прочность, самовосстанавливающиеся, антибактериальные и противовоспалительные свойства, супрамолекулярные гидрогели нашли множество применений в биомедицинской области⁶. В отличие от этого, структурный цвет, как тип цвета, получаемый в результате уникального взаимодействия света с внутренними периодическими наноструктурами, привлек большое внимание в таких областях, как оптические дисплеи, этикетки для защиты от подделок и носимые электронные устройства. В частности, когда конструкционные цветные материалы конструируются из чувствительных полимеров, их цвет может регулироваться различными стимулами путем расширения или сжатия этих полимеров, что предполагает потенциал этих материалов в качестве сенсоров. Таким образом, можно предположить, что сочетание супрамолекулярных гидрогелей со структурными цветами обеспечит уникальную стратегию для создания новых гидрогелевых патчей для лечения хронического остеомиелита ^7,8,9.

В данной работе мы разработали комплексный подход к диагностике и лечению с использованием интеллектуального структурного цветного гидрогелевого пластыря (CPG), состоящего из смешанного модифицированного метилакрилированного хитозана с фенилбороновой кислотой (CSMA-PBA) в качестве антибелкового каменного каркаса, реагирующего на температуру гидрогеля GelMA в качестве наполнителя и обогащенного салициловой кислотой (SA)¹⁰. Благодаря обратимости водородных связей и нековалентным взаимодействиям внутри сети, полученный гидрогелевый участок не только продемонстрировал отличные механические свойства, но и обладал способностью к самовосстановлению. Кроме того, благодаря присутствию CSMA, этот гидрогелевый пластырь также проявлял мощную антибактериальную биологическую активность. Кроме того, используя термическую реакцию полимера GelMA, гидрогелевый пластырь может высвобождать активные вещества при размещении в месте воспаления с относительно высокой температурой. В то же время, благодаря наличию связей боратного эфира в CSMA-PBA, гидрогель реагировал на изменения pH¹¹ окружающей среды. Основываясь на этих преимуществах, мы продемонстрировали, что предложенный супрамолекулярный гидрогелевый пластырь структурного цвета может лечить хронический остеомиелит за счет подавления экспрессии воспалительных факторов, антибактериальной активности и содействия ангиогенезу. Примечательно, что, извлекая выгоду из уникальных оптических свойств антибелкового каменного каркаса, гидрогелевый пластырь может даже проявлять способность изменять цвет в ответ на температурные стимулы, демонстрируя значительный потенциал в мониторинге и лечении хронического остеомиелита и руководстве клиническим лечением.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по медицинской этике и выполнялись в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH No 80-23, пересмотренная в 1978 году). В экспериментах использовались самцы крыс Sprague-Dawley (в возрасте 8 недель).

Получение коллоидных кристаллических матриц диоксида кремния (ПКК)
SCC были подготовлены так, как описано ранее 12,13,14. Очищенные и обработанные плазмой стекла погружали в 5% раствор монодисперсных наночастиц диоксида кремния (диаметром 12 нм), диспергированных в деионизированной воде. Раствор непрерывно перемешивали при комнатной температуре (25 °С) в течение 1 ч для обеспечения равномерного диспергирования наночастиц диоксида кремния. Предметные стекла извлекали из раствора и сушили на воздухе в течение 1 ч при комнатной температуре. Процесс сушки имел решающее значение для обеспечения надлежащего прилегания наночастиц к поверхности стеклянных стекол. После сушки на воздухе предметные стекла помещали в вентилируемую печь при температуре 60 °C на 2 дня, чтобы испарить остатки растворителя и способствовать образованию коллоидных кристаллов. Во время этого испарения предметные стекла располагались под углом 45°, чтобы способствовать образованию упорядоченных коллоидных кристаллических массивов. Упорядоченные коллоидные кристаллические массивы характеризовались самосборкой и имели различную структурную окраску в зависимости от расстояния между частицами. Эти массивы затем использовались в качестве шаблонов для последующего изготовления гидрогелевых пластырей.

Подготовка к комплексной диагностике и лечению интеллектуальных структурных цветных гидрогелевых патчей (CPG)
Противобелковые каменные каркасы были реплицированы из пустот коллоидных кристаллических матриц кремнезема (SCC). Очищенные стеклянные стекла сначала погружали в 5% раствор монодисперсных наночастиц диоксида кремния (диаметром 12 нм) в деионизированной воде, а раствор перемешивали при комнатной температуре (25 °С) в течение 1 ч для обеспечения равномерного диспергирования наночастиц по поверхности. Процесс перемешивания имел решающее значение для предотвращения образования агрегатов и обеспечения однородного распределения наночастиц. После погружения предметные стекла сушили на воздухе в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), а затем сушили в печи при 60 °C в течение 2 дней, чтобы облегчить испарение растворителя и способствовать самосборке наночастиц кремнезема в хорошо упорядоченные коллоидные кристаллические массивы. Во время испарения предметные стекла располагались под углом 45°, чтобы облегчить выравнивание наночастиц, способствуя образованию периодической матрицы с контролируемыми расстояниями между частицами. Этот упорядоченный массив имел структурный цвет, характерный для коллоидных кристаллов, и служил шаблоном для последующей гидрогелевой структуры.

Затем приготовленные ПКК замачивали в предварительно гелеобразном растворе CPG, который состоял из GelMA в концентрации 10% w/v, растворенного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Образцы оставляли на 5 минут при комнатной температуре (RT), чтобы обеспечить тщательную инфильтрацию GelMA в пустоты между наночастицами кремнезема, обеспечивая равномерное распределение внутри структуры матрицы. Этот шаг имел решающее значение для обеспечения того, чтобы гидрогелевая матрица была равномерно включена в матрицу и что конечная структура гидрогеля воспроизводила упорядоченное расположение наночастиц СКК. После замачивания предварительно гель-раствор полимеризовали под воздействием ультрафиолетового излучения (365 нм) с интенсивностью 3 мВт/^см2 в течение 5 мин. Это воздействие ультрафиолета инициировало сшивание GelMA, затвердевая гидрогелевая матрица. Время и интенсивность экспозиции были тщательно оптимизированы для достижения достаточного сшивания без чрезмерного воздействия гидрогеля, что может привести к чрезмерному гелеобразованию или потере структуры шаблона.

Характеристика товаров широкого потребления
Морфологию поперечного сечения гидрогеля наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с разгонным напряжением 5 кВ после покрытия образцов (1 мм х 1 мм) золотом¹⁵. Это позволило визуализировать нанопористую структуру и подтвердить однородность гидрогелевой сетки. Набухание оценивали путем погружения образцов гидрогеля 10 мг в 10 мл PBS через разные промежутки времени (0, 30, 60, 120 и 180 мин). Процент набухания был рассчитан путем измерения увеличения объема гидрогеля с течением времени, что дало представление о способности гидрогеля поглощать воду в различных условиях. Реологический анализ проводили с помощью реометра с деформацией 1%, применяя угловые частоты в диапазоне от 1 рад/с до 100 рад/с для измерения модуля накопления (G') и модуля потерь (G''). Этот шаг был необходим для понимания механических свойств гидрогеля, в том числе его вязкоупругих свойств под напряжением. Адгезионные свойства при сдвиге оценивали с помощью универсальной машины для испытаний на растяжение (Instron) в соответствии со стандартом ASTM F2255-05 (2015) со скоростью 10 мм/мин и предварительным натягом 0,01 Н для оценки способности гидрогеля адгезировать к биологическим тканям. Высвобождение препарата оценивали с помощью УФ-спектрофотометра путем мониторинга поглощения при λ = 280 нм после погружения гидрогеля в 5 мл PBS (pH 7,4). Высвобождение количественно определяли с помощью стандартной кривой концентраций салициловой кислоты для подтверждения способности гидрогеля CPG к контролируемому высвобождению. Наконец, гидрогели погружали в буферные растворы с pH 4,5 и 7,2 на 30 мин для оценки чувствительности pH, наблюдая за изменениями объема и внешнего вида при^{различных условиях} pH.

Реакция пластырей CPG на температуру и pH
Пластыри CPG (диаметром около 2 мм) помещали в буферный раствор объемом 5 мл с pH 7,2 и поддерживали при температуре 37 °C с помощью водяной бани с регулируемой температурой в течение 30 минут для имитации физиологических условий. Спектры отражения измеряли с помощью УФ-ВИД спектрофотометра в диапазоне длин волн от 400 нм до 800 нм. После первоначальных измерений участки переносили в буферные растворы с различными значениями pH (например, pH 4,5, 7,2 и 9,0) и поддерживали при температуре 37 °C в течение 30 минут. Реакция на микроокружение, включая любое изменение цвета, наблюдалась визуально, и спектры отражения регистрировались повторно для анализа цветового сдвига. Эта реакция на температуру и pH дает ценную информацию о том, как гидрогель реагирует на изменения в раневой среде.

Антибактериальное тестирование in vitro
Антибактериальные тесты проводились по стандартным методикам. Для оценки антибактериальной активности пластырей CPG использовали штаммы Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) и Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868). Эти стандартные референтные штаммы были приобретены в Американской коллекции типовых культур (ATCC) и использовались в качестве штаммов контроля качества (QC) для валидации процедур тестирования на противомикробные препараты. Определение чувствительности к антимикробным препаратам проводили методом микроразведения бульона в соответствии с рекомендациями CLSI M100. Бактериальные суспензии готовили в бульоне Мюллера-Хинтона, стандартной среде для антимикробных испытаний. Мутность была скорректирована до стандарта 0,5 по Макфарланду, что эквивалентно примерно 1,5 × 10⁸ КОЕ/мл. Затем суспензии инокулировали пластырями CPG (диаметром 2 мм), приготовленными либо с деионизированной водой, либо с pH 6,0 буфером 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (10 мМ). Пластыри добавляли к бактериальным суспензиям в соотношении один пластырь на 1 мл культуры. Суспензии инкубировали при 37 °C в течение 24 ч. После инкубации рост бактерий оценивали путем нанесения серийных разведений культур на питательный агар, а колониеобразующие единицы (КОЕ) подсчитывали после 24-часовой инкубации при 37 °C. Эта процедура обеспечила количественную меру антибактериальной эффективности.

Оценка биосовместимости
Эксперименты проводились так, как описано ранее. Пластыри CPG обрабатывались диализом в PBS (pH 7,4) в течение 4 ч, затем стерилизацией этанолом (70%) в течение 10 мин и ультрафиолетовой дезинфекцией (365 нм) в течение 30 мин, чтобы убедиться, что все биологические загрязнения были удалены. Клетки L929 (ATCC CCL-1) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C с 5%^CO2 для поддержания жизнеспособности клеток. Клетки засеивали в 24-луночные планшеты со скоростью от 2 × 10^{до 5} клеток/мл, с пластырями CPG (диаметром 2 мм) или без них, в трех экземплярах. Клетки были разделены на три экспериментальные группы: контрольная группа, группа CPG и группа CPG (MES). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа МТТ, широко распространенного метода оценки метаболической активности клеток. Для анализа МТТ в каждую лунку добавляли 20 мкл МТТ (5 мг/мл) с последующей инкубацией при 37 °C в течение 4 ч. После инкубации среду удаляли и добавляли 150 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана, образованных живыми клетками. Поглощение измеряли на длине волны 570 нм с помощью считывателя микропланшетов для количественной оценки количества жизнеспособных клеток. Такой подход обеспечил надежную оценку цитотоксичности и биосовместимости гидрогелевых пластырей.

Противовоспалительная активность
Антиоксидантную активность CPG оценивали с помощью набора для анализа АФК. Клетки L929 (ATCC CCL-1) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубировали при 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 ч для обеспечения прикрепления клеток и начальной пролиферации. Чтобы вызвать окислительный стресс, клетки обрабатывали перекисью водорода (H2O2) в концентрации 3 мкг/мл в течение 12 ч. После индукции окислительного стресса в клетки добавляли гидрогелевый экстракт (полученный путем растворения 1 мг гидрогеля CPG в 1 мл среды DMEM). Клетки инкубировали в течение еще 12 часов, чтобы обеспечить потенциальное антиоксидантное действие гидрогеля CPG. Затем клетки окрашивали 10 мкМ раствором DCFH-DA (разведенным в среде DMEM) и инкубировали при 37 °C в течение 20 мин. DCFH-DA представляет собой флуоресцентный зонд, используемый для обнаружения активных форм кислорода (АФК) в клетках. После окрашивания клетки промывали PBS, а флуоресцентные изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 530 нм. Интенсивность зеленой флуоресценции была обратно пропорциональна антиоксидантной активности гидрогеля, что обеспечивало визуальную оценку способности гидрогеля смягчать окислительный стресс в клетках.

Животная модель остеомиелита крысы
Была создана модель хронического остеомиелита: самцы крыс Спрэг-Доули (в возрасте 8 недель) были обезболены изофлураном (2-3% кислорода), чтобы они оставались неподвижными и безболезненными во время операции. Был сделан разрез длиной 2 см на латеральной поверхности левой бедренной кости, а стерильная игла 27-G была использована для введения 1 10⁷ КОЕ S. aureus непосредственно в трабекулярную область бедренной кости. Инъекция была выполнена в полость костного мозга бедренной кости, чтобы вызвать инфекцию в костном мозге, первичном месте остеомиелита. Бактерии доставлялись медленно, чтобы обеспечить надлежащее отложение в костном мозге. Через 10 дней крыс усыпляли с помощью ингаляции CO₂ , а инфицированные бедренные кости тщательно препарировали. Грануляционную ткань вырезали из места инфекции и немедленно погружали в 4% параформальдегид на 24 ч для сохранения целостности тканей. После фиксации костную ткань декальцифицировали с помощью декальцифицирующего агента (например, ЭДТА) в течение 48-72 ч, в зависимости от размера кости, чтобы обеспечить надлежащий срез для гистологического и иммуногистохимического анализа. Затем декальцинированные образцы костей обрабатывали для гистологического исследования, иммуногистохимии (ИГХ) и иммунофлуоресцентного окрашивания. Для количественного анализа методом ПЦР в реальном времени (кПЦР) грануляционную ткань хранили при температуре -80 °C для последующей экстракции РНК, что позволило проанализировать профили экспрессии генов, связанные с воспалением, регенерацией костей и иммунными реакциями

Оценка лечения остеомиелита in vivo
Грануляционную ткань погружали в парафин и разрезали с температурой 5 мкм с помощью микротома. Срезы окрашивали трихромным окрашиванием Массона (15 мин гематоксилином, 1 ч анилиновым синим) для оценки отложения коллагена и ремоделирования тканей. Для наблюдения за общей морфологией тканей и воспалением применяли окрашивание гематоксилином и эозином (ПЭ) (5 мин гематоксилином, 2 мин эозином). Иммуногистохимический анализ (ИГХ) с анти-CD31 (1:100) и анти-EGF (1:200) проводили в течение 1 ч при 37 °С, а затем инкубировали вторичные антитела при комнатной температуре (ОТ) в течение 30 мин с использованием антимышиного IgG или антикроличьего IgG (разбавленного 1:200), в зависимости от используемого первичного антитела, для оценки ангиогенеза и экспрессии фактора роста. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с использованием анти-VEGF (1:100) и анти-bFGF (1:200) в течение 1 ч при 37 °C с последующей инкубацией вторичных антител в течение 30 мин при ЛТ. С помощью флуоресцентного микроскопа наблюдали срезы экспрессии CD31, EGF, VEGF и bFGF. Для количественного анализа методом ПЦР в реальном времени (кПЦР) анализировали экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β и IL-6) после экстракции РНК с помощью RNAiso Plus и синтеза кДНК с помощью набора реагентов PrimeScript RT. ПЦР проводили с использованием SYBR Green PCR Master Mix для количественной оценки воспалительной реакции на молекулярном уровне.

Меры контроля качества
Для обеспечения достоверности и воспроизводимости результатов эксперимента все процедуры проводились по стандартизированным протоколам. Каждый эксперимент включал соответствующие контрольные группы, такие как контрольные группы (крысы, инфицированные S. aureus , но не получавшие лечения), контрольные группы (крысы, перенесшие хирургические процедуры без бактериальной инфекции и без лечения) и сравнительные группы лечения (крысы, получавшие различные методы лечения остеомиелита, такие как антибиотики или экспериментальные препараты), чтобы свести к минимуму вариабельность. Все анализы были выполнены в трех экземплярах для обеспечения согласованности и снижения экспериментальной систематической ошибки. Каждая группа содержала по 6 крыс для обеспечения статистической значимости. Приборы, в том числе УФ-ВИД спектрофотометр, реометр и тестер на растяжение, регулярно калибруются перед использованием в соответствии со спецификациями производителя. Бактериальные и клеточные культуры готовили в контролируемых условиях окружающей среды в шкафу биобезопасности, а процедуры окрашивания следовали с использованием согласованных протоколов для обеспечения воспроизводимости. Сбор данных проводился с унифицированными настройками микроскопа, чтобы свести к минимуму вариабельность между образцами и обеспечить точность измерений.

Статистический анализ
Статистический анализ проводился с помощью GraphPad Prism (версия 8.0). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Для сравнения между несколькими группами использовался односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки для оценки различий в механических свойствах, термочувствительном поведении, антибактериальной активности и жизнеспособности клеток. t-критерий Стьюдента использовался для парных сравнений, когда сравнивались только две группы, например, в случае сравнения пиков отражения участков CPG при разных значениях pH или изменении температуры. p < 0,05 считался статистически значимым для всех анализов. Все эксперименты проводились в трех экземплярах для обеспечения согласованности и воспроизводимости результатов.

Результаты

Изготовление и определение характеристик пластырей CPG (Рисунок 1)
В типичном эксперименте монодисперсные наночастицы диоксида кремния были самособраны путем испарения растворителя с образованием плотно упакованных массивов, в результате чего были получены структурные цветные покрытия (SCCs)^17,18,19, которые впоследствии были использованы для создания многофункциональных структурных цветных гидрогелевых патчей, как показано на рисунке 1. Процесс включал в себя инфильтрацию предварительного гелевого раствора в наноразмерные щели ПКК посредством капиллярного действия. Затем использовалась УФ-полимеризация для формирования гибридной пленки ПКК и гидрогеля. После того, как SCC были вытравлены, был получен обратный антибелковый каменный каркас с периодической пористой структурой. Наконец, термочувствительный гидрогель GelMA был заполнен в наноразмерных зазорах антибелкового каменного каркаса с последующим отверждением для создания независимых пластырей CPG.

Прочная сшивающая сеть гидрогеля придала патчам CPG отличные механические свойства. Было замечено, что патчи были достаточно прочными, чтобы выдерживать растяжение без причинения каких-либо повреждений, и могли растягиваться до 2,5 раз дольше своей первоначальной длины. Важно отметить, что патчи CPG демонстрировали яркие структурные цвета и претерпевали динамические изменения цвета во время растяжения, что является уникальной особенностью, возникающей в результате периодического расположения наноструктур высокого порядка внутри патчей. Эти наноструктуры создают фотонные запрещенные зоны (ПБГ), где свет на определенных длинах волн внутри ПБГ избирательно отражается, а не пропускается, наделяя участки ЦПГ характерными структурными цветами и пиками отражения.

Положение пика отражения пятна CPG можно оценить с помощью уравнения²⁰:

λ = 1,633dn_{среднее}

где d — расстояние между дифракционными плоскостями, а_{n —} средний показатель преломления материала, который рассчитывается как среднее значение показателей преломления компонентов, в том числе гидрогеля GelMA и других материалов, использованных в патче. Это уравнение предполагает, что по мере растяжения пятна и уменьшения d длина волны отражения уменьшается, что приводит к синему смещению структурного цвета пятна. Также была проверена прочность пластырей на разрыв, и было обнаружено, что деформационная способность пластырей снизилась из-за заполнения гидрогелем GelMA наноразмерных зазоров антибелкового каменного каркаса. Деформация пластырей CPG при растяжении обеспечивает высокочувствительные средства для обнаружения деформации, что делает их пригодными для применений, требующих механического контроля.

Термочувствительное и pH-чувствительное поведение пластырей CPG (Рисунок 2)
Пластыри CPG продемонстрировали замечательные термочувствительные свойства благодаря гидрогелю GelMA. При повышении температуры окружающей среды до 37 °C гидрогель подвергался усадке, высвобождая молекулы воды и загруженный груз. Эта усадка привела к уменьшению размера нанопор в пластырях CPG, изменению их PBG и, следовательно, смещению спектра отражения. Рисунок 2 иллюстрирует это поведение, показывая, как структурный цвет пятен изменяется в ответ на колебания температуры и pH.

Чтобы подтвердить эти наблюдения, пластыри CPG были помещены в среду раны, имитируемой хронической инфекцией, при температуре 37 °C и pH 7,2. По мере увеличения pH раствора наблюдалось синее смещение пика отражения участков CPG, что указывает на уменьшение размера нанопор. И наоборот, когда pH снижался, участки демонстрировали красное смещение, соответствующее расширению нанопор. Это pH-чувствительное поведение было связано с гидролизом связей эфира борона в CSMA-PBA в кислых условиях, что привело к разрыву связей и к красному смещению структурного цвета. Однако, когда pH был щелочным, не наблюдалось существенного изменения цвета, что указывает на стабильность пятен в основных условиях. Эти результаты свидетельствуют о том, что пластыри CPG можно использовать для мониторинга изменений температуры и pH в раневой среде, что имеет решающее значение для эффективного лечения раны.

Антибактериальная активность пластырей CPG (Рисунок 3)
Антибактериальные свойства пластырей CPG оценивали путем их совместного культивирования с S. aureus и E. coli. На рисунках 3A,B показано, что пластыри CPG значительно снижают рост бактерий, демонстрируя их эффективные антибактериальные свойства. Эта антибактериальная эффективность объясняется электростатическим взаимодействием между положительно заряженной CMCSMA поверхностью пятен и отрицательно заряженными клеточными стенками бактерий²¹. Это взаимодействие нарушало структуру бактериальной мембраны, что приводило к гибели бактерий. Катионные группы CMCSMA могут связываться с анионными компонентами в бактериальной мембране, что приводит к деполяризации мембраны и повышению проницаемости²². Более того, благодаря относительно небольшому размеру молекул и гибким полимерным цепям, CMCSMA может более эффективно проникать через липидный бислой, вызывая утечку внутриклеточных веществ и препятствуя метаболической активности. Малый размер молекул CMCSMA еще больше облегчил их проникновение в клеточную мембрану бактерии, где они взаимодействовали с незаменимыми биомолекулами, нарушая бактериальный метаболизм и ферментные системы²³. Кроме того, учитывая высокую биопленкообразующую способность S. aureus, стоит отметить, что материалы на основе хитозана, такие как CMCSMA, как сообщается, разрушают бактериальные биопленки, проникая в матрицу внеклеточного полимерного вещества (EPS) и нарушая его целостность. Это позволяет антибактериальным агентам получать доступ к бактериям, встроенным в биопленки, и убивать их, которые обычно устойчивы к обычным антибиотикам^24,25. Как показано на рисунке 3A, визуальное сравнение бактериальных колоний ясно демонстрирует существенное снижение после обработки пластырями CPG, подчеркивая их эффективную бактерицидную активность и многообещающий потенциал для использования в раневой среде, подверженной инфекциям.

Биологическая функциональность пластырей CPG (Рисунок 4)
Пластыри CPG продемонстрировали значительную биологическую функциональность в дополнение к своим антибактериальным свойствам. Рисунки 4C,D показывают, что патчи эффективно поглощают активные формы кислорода (АФК) в клетках, о чем свидетельствует снижение зеленого флуоресцентного сигнала в группе CPG. Удаление АФК имеет важное значение для заживления ран, так как чрезмерная выработка АФК может нарушить регенерацию тканей. Жизнеспособность эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs), культивируемых совместно с пластырями CPG, оценивали с помощью окрашивания на жизнеспособность, как показано на рисунке 4A. Результаты показали, что большинство клеток были живыми, с небольшой долей мертвых клеток, что позволяет предположить, что пластыри CPG способствуют жизнеспособности клеток и поддерживают их пролиферацию.

На рисунке 4B представлены результаты анализа МТТ, которые показали, что пластыри CPG значительно способствуют пролиферации клеток. Кроме того, на рисунках 4F, G показано, что пластыри CPG усиливают ангиогенез, способствуя экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF), которые имеют решающее значение для пролиферации эндотелиальных клеток и образования новых кровеносных сосудов. Эти результаты подчеркивают потенциал пластырей CPG не только для предотвращения инфекции, но и для улучшения регенерации тканей и ускорения заживления ран.

Оценка пластырей CPG in vivo (Рисунок 5)
Эксперименты in vivo , проведенные с использованием модели хронического остеомиелита, показали, что пластыри CPG значительно уменьшают инфекцию и воспаление. На рисунке 5А показан гистологический анализ (H&E окрашивание), где в контрольной группе наблюдалось характерное воспаление, разрушение кости, некротическая ткань и высокая инфильтрация защитных клеток, в то время как в группе лечения наблюдалось значительное снижение инфекции, воспаления и инфильтрации защитных клеток. В группе CPG наблюдалась повышенная миграция остеобластов, трансформация остеобластов в костные клетки, сосудообразование, образование новой кости и снижение инфекции, что еще раз подтверждает эффективность пластырей CPG в содействии регенерации тканей.

Кроме того, на рисунке 5B показано окрашивание по методу ангиогенеза, подтверждающее, что пластыри CPG способствовали образованию новых кровеносных сосудов, что имеет решающее значение для восстановления тканей. Эти результаты свидетельствуют о том, что пластыри CPG играют двойную роль как в борьбе с инфекцией, так и в стимулировании регенерации тканей, что делает их очень подходящими для заживления хронических ран и регенерации костей.

Рисунок 1: Приготовление и характеристика структурного цветного гидрогелевого пятна (CPG). (A): Реакция между CSMA и PBA; (B): Фотография CPG, демонстрирующая изменение цвета при растяжении; (C): Определение СЭМ-характеристик ХТП; (D): Набухание CPG; (E): Профиль деградации потребительских товаров; (F): Кинетика высвобождения лекарственного препарата из CPG. Масштабная линейка: 100 нм. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD). В опытной группе было использовано шесть крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Интеллектуальное обнаружение пластыря CPG. (A): Изменение структурного цвета пятна CPG с изменениями температуры окружающей среды и pH; (B): Спектральный анализ пластыря CPG при различных температурах; (C): Спектральный анализ участка CPG при различных уровнях pH. Масштабная линейка: 1 мм. Данные представляют собой среднее значение ± SD, проанализированное с помощью одностороннего ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Антибактериальная активность пластыря CPG. (A): Репрезентативные изображения совместной культуры S. aureus и E. coli с пластырем CPG; (B): Анализ значений оптической плотности (OD). Масштабная линейка: 5 мм. Погрешности представляют SD. Статистическая значимость была определена с помощью одностороннего ANOVA с помощью апостериорного теста Тьюки. В каждой группе было использовано шесть повторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Биологическая функциональная оценка пластыря CPG. (A): Окрашивание на жизнеспособность клеток HUVEC совместно с пластырем CPG в течение 48 ч, показывая живые клетки (зеленый) и мертвые клетки (красный); (B): Пролиферация клеток, измеренная с помощью анализа МТТ; (C): окрашивание пластыря CPG методом АФК; (D): Скорость очистки DPPH в группе VEGF; (Е): q-ПЦР-анализ на воспалительные факторы; (F): Стимулирование ангиогенеза с помощью пластыря CPG; (G): Вестерн-блоттинг результатов экспрессии VEGF и bFGF; (H): Статистический анализ значений оттенков серого VEGF и bFGF. Масштабная линейка: 100 μм. Погрешности представляют собой SD. Данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. В каждой группе использовалось по шесть крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Эксперименты in vivo с пластырем CPG. (А): окрашивание HE; (Б): Окрашивание по методу ангиогенеза. Масштабная линейка: 100 μм. Данные представляют собой среднее значение ± SD, проанализированное с помощью одностороннего ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. В каждой группе было по 6 животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Результаты этого исследования демонстрируют многофункциональность гидрогелевых патчей CPG, особенно с точки зрения изменения их структурного цвета, температурной чувствительности, чувствительности к pH и антимикробных свойств. Эти гидрогелевые патчи могут претерпевать видимые структурные изменения цвета при механической деформации, предлагая высокочувствительный механизм для мониторинга деформации. Эта особенность согласуется с предыдущими исследованиями, в которых изучался структурный цвет в материалах для сенсорных приложений, где такие цветовые сдвиги используются в качестве индикаторов деформации или давления^26,27. Наше исследование расширяет эти результаты, используя эти изменения цвета в качестве неинвазивного средства мониторинга напряжения в ране, что важно для оценки заживления ран в режиме реального времени. Возможность мониторинга таких механических деформаций предоставляет клиницистам критически важную информацию, потенциально помогая выявлять ранние признаки осложнений, таких как расхождение швов, тем самым способствуя более целенаправленному и своевременному вмешательству. Важно отметить, что оптическое считывание обеспечивает прямой и интуитивно понятный механизм считывания без необходимости в дополнительном питании или устройствах визуализации, предлагая децентрализованное решение для мониторинга, идеально подходящее для оказания медицинской помощи или послеоперационного ухода на дому.

Термочувствительные и чувствительные к pH свойства гидрогелевых пластырей CPG повышают их потенциал для клинического использования. По мере заживления ран колебания температуры и рН являются обычным явлением, особенно при наличии инфекции или воспаления²⁸. Известно, что повышенные температуры и измененные значения pH в области раны связаны с этими состояниями. В этом исследовании пластыри CPG продемонстрировали чувствительность к таким изменениям, что позволило в режиме реального времени отслеживать местные условия раны. Эта особенность особенно ценна в клинических условиях, где раннее выявление инфекции или воспаления имеет важное значение для оптимизации терапевтических стратегий. Мониторинг изменений температуры и pH особенно важен при лечении раны, поскольку они служат ранними неинвазивными биомаркерами состояния раны²⁹. Повышенная температура может сигнализировать о начале инфекции до того, как проявятся клинические симптомы, в то время как сдвиг в сторону щелочного pH часто указывает на хронизацию, микробную колонизацию и нарушение заживления. Напротив, кислая среда связана с острыми ранами и лучшим заживлением²⁴. Таким образом, интеграция в раневые повязки элементов, реагирующих на температуру и pH, позволяет проводить своевременные вмешательства и непрерывно оценивать прогресс заживления, что может предотвратить ухудшение состояния раны или прогрессирование до системной инфекции. Способность гидрогеля динамически адаптироваться к этим изменениям также предоставляет клиницистам новый инструмент для непрерывного мониторинга состояния раны, обеспечивая большую точность в отслеживании процесса заживления. Более того, такая динамическая реакция позволяет осуществлять пространственно-временной контроль над терапевтическим высвобождением, гарантируя, что доставка лекарств синхронизирована с патологическими сигналами, что является основной задачей современных интеллектуальных биоматериалов.

Кроме того, антимикробные свойства гидрогелевых пластырей CPG имеют решающее значение для снижения бактериальной нагрузки в области раны. Хитозан, который был включен в структуру гидрогеля, уже давно признан обладающим антимикробными свойствами благодаря своей катионной природе, которая способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными клеточными стенками бактерий^. Однако антибактериальный механизм материалов на основе хитозана не ограничивается простым привлечением заряда. При контакте с бактериальными мембранами хитозан может увеличивать проницаемость мембран, что приводит к утечке внутриклеточного содержимого, такого как ионы калия, белки и нуклеиновые кислоты. Кроме того, хитозан может хелатировать ионы двухвалентных металлов (например, Ca²⁺ и Mg²⁺), нарушая активность ферментов и метаболические функции. Низкомолекулярный хитозан также может проникать через клеточную стенку бактерий и связываться с ДНК, ингибируя транскрипцию мРНК и синтез белка. Эти многогранные механизмы были широко задокументированы. Пористая структура гидрогелевого каркаса еще больше усиливает эти эффекты, увеличивая площадь поверхности и контакт с бактериями, что приводит к синергетической антибактериальной эффективности. Это свойство особенно актуально при лечении хронических инфекций, таких как остеомиелит, где образование биопленки осложняет процесс заживления^25,30. Результаты этого исследования демонстрируют, что гидрогелевые пластыри CPG были эффективны в подавлении роста бактерий, снижении бактериальной нагрузки в области раны и потенциальном создании более благоприятной среды для регенерации тканей. Эта антимикробная активность в сочетании с другими свойствами гидрогеля делает пластыри многообещающим кандидатом для лечения хронических ран, которые часто страдают от бактериального загрязнения и замедленного заживления. Кроме того, ингибируя местную колонизацию бактерий, гидрогель косвенно предотвращает повышение регуляции провоспалительных цитокинов, которые часто сохраняются в инфицированных хронических ранах, тем самым способствуя прорегенеративному микроокружению.

В то время как АФК обычно связаны с окислительным стрессом и повреждением тканей, широко признано, что контролируемая генерация АФК играет решающую роль в эрадикации бактерий. АФК, такие как гидроксильные радикалы и супероксидные анионы, могут окислять бактериальные белки, липиды и ДНК, что в конечном итоге приводит к разрыву мембраны и гибели клеток. Таким образом, присутствие АФК в умеренных количествах служит важнейшим компонентом механизмов врожденной антимикробной защиты. В контексте хронического остеомиелита, когда колонизация бактерий и образование биопленки продолжаются, элиминация патогенов является предпосылкой для значимой регенерации тканей. Гидрогель CPG, подавляя чрезмерное количество АФК и сохраняя при этом эффективную антибактериальную активность за счет CMCSMA-опосредованного разрушения мембраны и проникновения биопленки, предлагает сбалансированный подход. Эта двойная функция гарантирует, что воспаление не продлевается из-за постоянного присутствия бактерий, что позволяет перейти от иммунной активации к регенеративному микроокружению. Таким образом, вместо того, чтобы без разбора поглощать АФК, эта система модулирует окислительное микроокружение, поддерживая как выведение бактерий, так и заживление тканей.

В дополнение к антимикробной активности, гидрогелевые пластыри CPG продемонстрировали биологическую функциональность, которая имеет решающее значение для восстановления и регенерации тканей³¹. Анализы in vitro показали, что гидрогель поддерживает жизнеспособность и пролиферацию клеток, а также ангиогенез. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, которые подчеркивали важность ангиогенеза в заживлении ран³². Ангиогенез имеет решающее значение для обеспечения достаточного снабжения поврежденной ткани кислородом и питательными веществами, способствуя регенерации тканей. Кроме того, проангиогенные эффекты гидрогеля особенно важны для лечения хронических ран, так как эти раны часто страдают от плохой васкуляризации, что препятствует процессу заживления ^33,34. Способствуя образованию кровеносных сосудов, гидрогель CPG не только способствует регенерации тканей, но и создает более благоприятную среду для долгосрочного выживания вновь образованных тканей. Кроме того, способность гидрогеля способствовать миграции и дифференцировке остеобластов имеет большое значение в контексте заживления костей, особенно для пациентов с хроническими костными инфекциями или костными^{дефектами.} Усиление остеогенеза является многообещающим направлением для улучшения результатов лечения остеомиелита и связанных с ним заболеваний костей, при которых заживление часто нарушается. Такая остеоиндуктивная функциональность, интегрированная с локализованным инфекционным контролем, решает центральную проблему в инженерии тканей опорно-двигательного аппарата: потребность в конвергентных решениях, которые способствуют как антимикробной защите, так и регенерации тканей на единой платформе.

Результаты in vivo еще раз подтверждают терапевтический потенциал гидрогелевых пластырей CPG, демонстрируя их способность поддерживать восстановление тканей, уменьшать инфекцию и способствовать остеогенезу. В моделях хронических ран эти гидрогели эффективно способствовали закрытию раны и регенерации тканей. В моделях регенерации кости гидрогель CPG способствовал миграции и дифференцировке остеобластов, способствуя заживлению костей. Эти результаты согласуются с результатами других исследований, в которых изучались стратегии заживления ран и регенерации костей на основе гидрогеля³⁶. Способность гидрогелевых пластырей CPG одновременно бороться с инфекцией, способствовать ангиогенезу и поддерживать остеогенез обеспечивает мощную платформу для комплексного ухода за ранами, что делает их многообещающим кандидатом для клинического использования.

Несмотря на эти многообещающие результаты, у текущего исследования есть несколько ограничений. Во-первых, в то время как модели in vitro и in vivo продемонстрировали положительные результаты, доклинические исследования проводились в основном на мышиных моделях. Несмотря на то, что мыши широко используются для исследований заживления ран, они не могут полностью воспроизводить сложность заживления ран у человека. Таким образом, необходима дальнейшая валидация на более крупных животных моделях, а также клинические испытания на людях, чтобы подтвердить безопасность и эффективность этих гидрогелевых пластырей в реальных клинических условиях. Во-вторых, хотя гидрогели CPG продемонстрировали хорошие механические свойства и биологическую функциональность в краткосрочной перспективе, их долгосрочная стабильность и деградационные свойства in vivo остаются неясными. Гидрогели со временем могут разлагаться, а продукты их распада могут повлиять на процесс заживления или даже вызвать побочные реакции. Будущие исследования должны быть сосредоточены на оптимизации скорости деградации этих гидрогелей, чтобы гарантировать, что они разлагаются контролируемым образом, не выделяя вредных побочных продуктов. Кроме того, контролируемое высвобождение биологически активных веществ, включенных в гидрогель, должно быть дополнительно усовершенствовано для обеспечения устойчивого терапевтического эффекта в течение долгого времени, особенно при лечении хронических ран.

В то время как это исследование сосредоточено на супрамолекулярном каркасе на основе гидрогеля, альтернативные подходы к рассмотрению той же терапевтической гипотезы включают электрохимические биосенсоры, микрофлюидные системы намотки на чип и умные бинты, включающие электронные компоненты для восприятия окружающей среды. Однако, в отличие от тех технологий, которые часто требуют источников питания и сложных интерфейсов, разработанный здесь гидрогелевый пластырь обеспечивает автономную, визуально интерпретируемую платформу без внешних инструментов, что делает его особенно привлекательным для условий с ограниченными ресурсами.

Важность данной работы заключается в ее трансляционном потенциале. Помимо остеомиелита, платформа CPG может быть настроена для других состояний, связанных с воспалением, таких как диабетические язвы стопы, инфекции в области хирургического вмешательства и мониторинг постопухолевой резекции. Интеграция диагностических и терапевтических функций в единую гидрогелевую матрицу открывает уникальную возможность для разработки «умных» повязок для ран нового поколения. Кроме того, структурная цветовая система на основе фотонных кристаллов предоставляет возможности колориметрического биозондирования в режиме реального времени, применимого в персонализированной медицине. Кроме того, модульность конструкции CPG позволяет адаптировать его для будущей интеграции со стволовыми клетками, экзосомами или векторами доставки генов для дальнейшего расширения его регенеративных возможностей, согласуясь с текущими траекториями в прецизионной регенеративной медицине.

Заглядывая в будущее, будущие исследования должны быть сосредоточены на нескольких ключевых областях. Во-первых, оптимизация состава и структуры гидрогелевых патчей CPG будет иметь решающее значение для повышения их долгосрочной стабильности и эффективности. Изменение плотности сшивки и включение других биологически активных агентов, таких как факторы роста или цитокины, может улучшить терапевтический потенциал гидрогеля для конкретных клинических применений. Во-вторых, расширение спектра применения этих гидрогелей за пределы хронических ран до других типов регенерации тканей, таких как восстановление нервов или хрящей, может еще больше продемонстрировать их универсальность. Для расширения их клинической применимости необходимы исследования того, как гидрогели CPG могут быть адаптированы к конкретным типам ран, таким как диабетические язвы или пролежни. В-третьих, интеграция передовых методов лечения, таких как терапия стволовыми клетками или генная терапия, с гидрогелевыми пластырями может усилить их регенеративные свойства, что позволит проводить более комплексные и эффективные методы лечения. Наконец, потребуются крупномасштабные многоцентровые клинические испытания и исследования реального применения для оценки безопасности, технологичности, соответствия пользователей и нормативной готовности платформы CPG, тем самым способствуя ее возможному клиническому применению.

В заключение следует отметить, что гидрогелевые пластыри CPG представляют собой многообещающую платформу для передового ухода за ранами и регенерации тканей. Их способность контролировать напряжение раны, реагировать на изменения температуры и pH, проявлять антимикробные свойства и способствовать регенерации тканей обеспечивает многогранный подход к лечению хронических ран. Несмотря на то, что результаты доклинических исследований обнадеживают, для полной реализации потенциала этих гидрогелевых пластырей в клинических условиях необходима дальнейшая оптимизация и клиническая валидация. Будущие направления исследований должны включать улучшение состава материалов, более широкое применение, интеграцию с передовыми терапевтическими стратегиями и клинические испытания для установления их эффективности и безопасности для человека.

В этом эксперименте мы использовали комбинацию метила CSMA-PBA в качестве обратного опалового каркаса, термочувствительный гидрогель GelMA в качестве наполнителя и загрузили его SA для создания интегрированного диагностического и терапевтического интеллектуального структурного цветного гидрогелевого пластыря CPG. Результаты экспериментов показывают, что этот гидрогелевый пластырь обладает отличными механическими свойствами и адгезионной прочностью. Он может подавлять рост бактерий, значительно повышать экспрессию фактора роста эндотелия сосудов и снижать уровни воспалительных факторов, тем самым обеспечивая значительные клинические перспективы для лечения КОМ. Более того, что важно, основываясь на способности CPG обнаруживать изменения температуры и pH в месте инфекции, он выполняет роль мониторинга в послеоперационном восстановлении хронического остеомиелита.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Акриламид (АМ, 99%)	Сигма-Олдрич	А8887	Мономер для полимеризации гидрогелем
Акрилоилхлорид (AC, 99%)	Химикаты TCI	А0376	Используется в реакциях химической модификации
Щелочной глинозем (200-300 меш)	Аладдин	A112336	Используется для очистки метилметакрилата
Антитела против bFGF	Санта-Крус	СК-9084	Иммунофлуоресцентное окрашивание для определения фактора роста
Антитела к CD31	Абкам	АБ28364	Иммуногистохимия для выявления сосудистых маркеров
Антитела против EGF	Сигма-Олдрич	Е9644	Иммуногистохимическое окрашивание
Антитела против VEGF	Санта-Крус	СК-7269	Иммунофлуоресцентное окрашивание для ангиогенеза
Бис-акриламид (BIS, 97%)	Сигма-Олдрич	М7279	Сшивающий агент в гидрогелевой сети
Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8)	Додзиндо	СК04	Оценка жизнеспособности клеток
Хитозан, метилакрилированный (CSMA-PBA)	Сигма-Олдрич	С3641	Формирование скаффолда в гидрогелевых пластырях
Зонд DCFH-DA	Бейотим	С0033	Обнаружение активных форм кислорода (АФК)
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Китайская национальная фармацевтическая группа	ДМСО-АР	Растворитель для гидрогелевой рецептуры
Кишечная палочка (E. coli)	АТКС	-	Используется в антибактериальных испытаниях
Флуоресцентный микроскоп	Олимп	БХ53	Иммунофлюоресценция и визуализация клеток
Метакрилат желатина (GelMA)	Сигма-Олдрич	Г1894	Термочувствительный гидрогелевый компонент
Соляная кислота (HCl)	Чунцин Тяньюнь	HCl-AR	Корректировка pH в синтезе
Перекись водорода (H2O2)	Сигма-Олдрич	Н1009	Вызывает окислительный стресс в клетках
Фтористоводородная кислота (HF, 4%)	Синофарм	H814912	Травление коллоидных кристаллов диоксида кремния
Универсальная машина для испытаний на растяжение Instron	Инстрон	3345	Испытания на механическую и адгезионную прочность
Элементы L929	АТКС	ВКЛ-1	Используется для анализа цитотоксичности и биосовместимости
Микротом Leica	Лейка	РИНГ2235	Используется для парафинового срезания тканей
Самцы крыс Спрэг-Доули (8 недель)	Рейгановская биотехнология	-	Модель хронического остеомиелита in vivo
Массон s Набор для морилки Trichrome	Соларбио	Г1340	Гистологическое окрашивание при фиброзе
Метилметакрилат (ММА, 99%)	Сигма-Олдрич	М27805	Мономер для формирования скаффолда
Набор для анализа МТТ	Бейотим	М5655	Оценка пролиферации клеток и цитотоксичности
Параформальдегид (4%)	Сервисбио	Г1101	Фиксация тканей
Парафин	Сигма-Олдрич	П1003	Закладная среда для гистологии
Буфер PBS	Gibco	10010023	Используется в обработке клеток и гидрогеля
Фенилаланин (99%)	Сигма-Олдрич	П5482	Используется в химической модификации
Фенилбороновая кислота (ПБА)	Химикаты TCI	П0157	pH-чувствительный компонент в гидрогеле
Персульфат калия (КПС)	Пекин Баолинвэй	КПС-АР	Радикальный инициатор в полимеризации
Набор реагентов PrimeScript RT	Такара	РР047А	Используется для синтеза кДНК
Набор для анализа активных форм кислорода (АФК)	КейГен Биотех	KGAF019	Оценка антиоксидантной активности
Система ПЦР в реальном времени	Прикладные биосистемы	StepOnePlus	Количественная оценка экспрессии генов
РНКисо Плюс	Такара	9108	Реагент для экстракции РНК
Реометр (HR-1)	Инструменты TA	ХР-1	Реологическая характеристика гидрогеля
Салициловая кислота (СК)	Сигма-Олдрич	С3254	Молекула лекарственного средства в гидрогеле
Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)	ДЖЕОЛ	JSM-7500F	Морфологический анализ структуры гидрогеля
Наночастицы диоксида кремния (12 нм)	Сигма-Олдрич	637246	Формирование коллоидных кристаллических матриц диоксида кремния
Гидроксид натрия (NaOH)	Китайская национальная фармацевтическая группа	НаОХ-АР	Регулировка pH
Золотистый стафилококк (S. aureus)	АТКС	-	Используется в антибактериальных испытаниях
SYBR Green PCR Master Mix	Прикладные биосистемы	4367659	реагент для обнаружения количественной ПЦР
Источник ультрафиолетового излучения (365 нм, 3 мВт/см²)	Херолаб	УВТ-28	Используется для УФ-полимеризации
УФ-спектрофотометр	Симадзу	УФ-2600	Измерение высвобождения лекарственного препарата