Методическая статья

Минимально инвазивный метод создания сингенной ортотопической мышиной модели рака легкого

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной проблемой разработки новых методов лечения рака легких является моделирование микроокружения опухоли по мере того, как регионарное заболевание прогрессирует до метастатического заболевания. В этой статье мы опишем простой метод создания ортотопической сингенной модели рака легких, которая позволяет in vivo отслеживать заболевание с течением времени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) продолжает оставаться причиной номер один смертности от рака как среди женщин, так и среди мужчин во всем мире. Необходимо собрать больше информации, чтобы понять взаимодействие между раковыми клетками, иммунной системой, микроокружением внутри каждой опухоли и тканью хозяина для разработки более эффективных методов лечения. Здесь представлен простой, воспроизводимый метод индуцирования рака в легких мыши, позволяющий отслеживать рост опухоли от ранней до поздней стадии заболевания. Хирургическая процедура включает в себя небольшой поверхностный разрез на коже и инъекцию раковых клеток через межреберные мышцы в легкое. Системы визуализации in vivo (IVIS) в сочетании с клетками, спроектированными для экспрессии люциферазы, обеспечивают удобный способ оценки роста опухоли и прогрессирования заболевания в ходе исследования. Этот метод легко переносится на различные модели рака легких и может быть использован для проверки осуществимости и эффективности новых методов лечения в доклинической модели рака легких, которая имитирует естественное микроокружение опухоли. Это расширяет актуальность исследований как эффективности, так и безопасности/токсичности с использованием стандартных методов лечения, включая хирургическую резекцию, лучевую и иммунотерапию в сочетании с экспериментальной терапией.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак легких продолжает оставаться одним из наиболее часто диагностируемых видов рака и причиной номер один смертности от рака среди мужчин и женщин во всем мире 1,2,3. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет почти 90% всех случаев рака легких в Соединенных Штатах, и хотя ландшафт лечения значительно улучшился за последние несколько лет, по-прежнему существует большой интерес к разработке новых методов лечения, которые улучшают исходы. Несмотря на то, что было достигнуто много успехов в разработке таргетной терапии для специфических драйверных мутаций и иммунотерапии для чувствительных подтипов НМРЛ, общая пятилетняя выживаемость продолжает оставаться низкой, составляя около 20% для всех стадий рака легких 2,5,6,7. Кроме того, несмотря на то, что иммунотерапия добилась огромных успехов в улучшении выживаемости на поздних стадиях заболевания, эти улучшения только сместили иглу с пятилетней общей выживаемости с 6,8% до 10,7% и увеличили время выживаемости с 7 месяцев до 8месяцев8. По-прежнему существует большая потребность в понимании механизмов действия болезни и в разработке новых методов лечения, которые синергизируют с существующими стандартными методами лечения. Понимание механизмов естественного прогрессирования НМРЛ и ответа на новые методы лечения требуют доклинических моделей, которые надежно воспроизводимы, легко индуцируются и инкапсулируют микроокружение опухоли, в котором развивается рак.

За последние несколько десятилетий было разработано множество различных процедур для оценки ортотопических моделей рака легких у грызунов. Процедуры варьируются от очень инвазивных, требующих высокого уровня квалификации, таких как внутрилегочная имплантация или процедуры трансплантации, которые открывают грудную полость 9,10,11,12,13; умеренно инвазивные, такие как внутритрахеальные и оротрахеальные процедуры 14,15,16,17; до минимально инвазивных процедур, таких как чрескожные инъекции, вправление хвостовой вены или интраназальная индукция 18,19,20,21. Все процедуры имеют различные риски и преимущества - с более инвазивными методами, обеспечивающими большую точность, но потенциально более высокую скорость истощения, и менее инвазивными методами, обеспечивающими лучшую выживаемость, но большую вариабельность мест имплантации опухоли. Из этих различных протоколов некоторые предпочитают не отслеживать рост опухоли in vivo и проводят только полную оценку опухолей ex vivo 9,11,12,16. Из протоколов, которые отслеживают рост опухоли с течением времени, более ранние протоколы больше полагаются на такие системы, как компьютерная томография (КТ)14,19, позиционная эмиссионная томография (ПЭТ)18 и магнитно-резонансная томография (МРТ)17, в то время как более поздние протоколы, после того как системы биолюминесцентной визуализации (BLI) и генетически модифицированные клетки стали более доступными, выбирают отслеживание роста опухоли с течением времени с помощью BLI20. 21.

Цель разработки этого протокола состояла в том, чтобы учесть уроки, полученные в ходе этих других процедур, и создать простой, но надежный метод индуцирования одиночной опухоли легкого для изучения прогрессирования НМРЛ, начиная с ранней стадии заболевания, когда опухоль ограничена легким. Общая цель данной статьи состоит в том, чтобы описать методы создания надежной и минимально инвазивной сингенной ортотопической мышиной модели рака легких, которую можно контролировать с помощью визуализации in vivo и которая может позволить исследователям изучать рак легких в органе, из которого возникает заболевание. Этот метод эффективен для создания как ортотопических мышиных моделей ксенотрансплантата с использованием клеточных линий рака легкого человека, так и сингенных ортотопических мышиных моделей с использованием клеточных линий рака легкого мыши у мышей с интактной иммунной системой, что придает универсальность методу для изучения как типов рака человека, так и сложного взаимодействия иммунной системы и НМРЛ.

Мы сосредоточились на оптимизации этого протокола в иммунно-компетентной мышиной модели НМРЛ, Lewis Lung Carcinoma (LLC), поскольку эта модель позволяет исследователям лучше понять реакцию иммунной системы с современными методами лечения, такими как химиотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия и другие таргетные методы лечения, и без них 22,23,24,25. Протокол создает модель, которая является репрезентативной для ранней стадии заболевания при инокуляции (опухоль в паренхиме легкого) и метастазирования к концу исследования, поскольку опухоль часто перерастает паренхиму легких и зарастает другие ткани.

Важным аспектом изучения ортотопических моделей является возможность отслеживать рост опухоли многократно, с минимальным стрессом для животного и быстро, чтобы каждое животное в исследовании можно было оценить в одну временную точку. В то время как методы визуализации, такие как МРТ или КТ, позволяют улучшить разрешение опухоли, эти методы визуализации являются дорогими, трудоемкими и затрудняют отслеживание раннего роста опухоли на моделях мелких животных, таких как мыши 26,27,28,29,30,31. Поэтому мы решили контролировать рост опухоли с помощью биолюминесценции с использованием раковых клеток, модифицированных люциферазой. В рамках этого протокола мы ввели 25 000-50 000 клеток LLC, сконструированных люциферазой светлячков (LLC-luc), и обнаружили опухоли уже на следующий день с помощью BLI. Люциферин-люциферазная реакция является полезным инструментом для отслеживания роста опухоли in vivo с использованием инструментов спектральной визуализации. Благодаря чувствительности этих систем визуализации к отслеживанию фотонов света, раковые клетки, экспрессирующие люциферазу, могут быть отслежены in vivo на ранней стадии, часто до того, как опухоли могут быть обнаружены в мышиной модели с помощью МРТ или КТ, и часто 26,32,33,34.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, рассматриваются и утверждаются Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Айовы. Мышей C57BL6/N (возраст 4-6 недель) покупают и акклиматизируют не менее чем за 1 неделю до операции. Все животные находятся на 12-часовом цикле свет/темнота. Животные содержатся по 4 человека в клетке и имеют полный доступ к пище и воде вплоть до момента проведения анестезии.

1. Отбор и выращивание клеток для инъекций

  1. Проведите анализ люциферазы для выбора клеточной линии, как описано впункте 35.
    1. Выращивайте клетки LLC-luc в модифицированной среде Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), L-глутамина и пенициллина/стрептомицина в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C и высокой влажности. Проводите анализ, когда клетки сливаются на 50%-100%.
    2. Перед проведением анализа промойте клетки 1x PBS.
    3. Добавьте 200 μL буфера/лунки для лизиса (25 мМ Трис/фосфат, 4 мМ EGTA, 1% Тритон X-100, 10% глицерин) в 6-луночный планшет. Соскребите ячейки из лунки и переложите в микроцентрифужную пробирку. Вращайте ячейки при 16 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что на дне пробирки образуются компактные клеточные гранулы, и соберите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
    4. Переложите половину клеточного экстракта в новую микроцентрифужную пробирку и сохраните для количественного определения белка. Добавьте 2 мМ дитиотреитола к оставшейся половине и хорошо перемешайте.
    5. Смешайте 8 мкл клеточного экстракта, содержащего 2 мМ дитиотреита, с 42 мкЛ буфера для анализа (25 мМ Трис/фосфата, 20 мМ MgSO4, 4 мМ ЭГТА, 2 мМ АТФ, 1 мМ дитиотреитола). Добавьте 50 мкл 0,5-1 мМ люциферина.
    6. Измерьте пиковую люминесценцию, выраженную в относительных световых единицах (RLU), и оцените содержание белка предпочтительным методом количественного определения белка, чтобы сообщить о люминесценции в виде RLU на мг белка (RLU/мг).
  2. Выберите клеточную линию с люминесценцией в диапазоне 8000-15000 RLU/мг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте выбора более высокой экспрессии люциферазы (>15 000 RLU/мг), так как это может привести к насыщению инструмента BLI.

2. Подготовка клеток

  1. Выращивайте клетки LLC-luc в DMEM с добавлением 10% FBS, L-глутамина и пенициллина/стрептомицина в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 °C при высокой влажности воздуха в течение не менее 1 недели перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте рост, чтобы ограничить слияние до 70%-80% и разделяйте с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА по мере необходимости, чтобы достичь желаемого количества для инъекций, как описано ранее36.

3. Предоперационная подготовка

  1. Мышей с шерстью побриться за 1 день до операции.
  2. Поместите мышь в индукционную камеру для обезболивания с помощью изофлурана. Установите скорость потока кислорода на 2,0 л/мин и испаритель на 2% изофлуране; Отрегулируйте это значение в зависимости от размера индуцируемой мыши.
  3. Следите за дыханием мышей и используйте рефлекс отмены педали, чтобы подтвердить соответствующую анестезию.
  4. Поместите мышь в носовой конус в положении лежа на устройстве для подогрева, одобренном IACUC. Прежде чем продолжить, убедитесь, что мышь правильно обезболечена с помощью рефлекса отвода педали.
  5. Нанесите офтальмоглазную мазь на оба глаза.
  6. Когда мышь будет подвергнута надлежащему обезболиванию, используйте электрические машинки для стрижки, чтобы удалить большую прямоугольную область (2 см x 3 см) в левой спинной части мыши. Брейте до позвоночника медиально, стол сбоку до тех пор, пока не останется не видно шерсти, последнее ребро (13-е) снизу, а верхний край лопатки ближе к голове.
  7. Поместите мышь в пустую клетку на согревающее устройство, одобренное IACUC, и наблюдайте за дыханием мыши, пока она не придет в себя и не придет в себя. В это время верните мышь в домашнюю клетку до проведения операции.

4. Приготовление клеточной суспензии для инъекций

  1. В день забора клеток (шаг 2.2) добавьте свежую среду с 50 мг/мл гентамицина за 3-4 ч до сбора для удаления мертвых и отслоившихся клеток.
  2. Аспирируйте среду и промойте клетки 1x PBS. Добавьте трипсин-ЭДТА и инкубируйте 1-2 минуты при 37 °C.
  3. Диспергируйте клетки и добавьте среду для нейтрализации трипсина. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.
  4. Отжим при 1 200 × г в течение 3 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что на дне пробирки образуется компактная клетка, аспирируйте надосадочную жидкость и промойте гранулу 1x PBS. Повторите этот шаг 3 раза.
  5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1x PBS со скоростью примерно 1-2 миллиона клеток/мл для подсчета. Перед подсчетом профильтруйте через сетчатый фильтр 40 мкм.
  6. Смешайте 10 μL клеточной суспензии с 10 μL Trypan Blue и посчитайте с помощью гемоцитометра. Сделайте суспензию клеток 2 раза и подсчитайте оба, чтобы проверить количество клеток. Рассчитайте общее количество клеток и жизнеспособность.
  7. Отжим клетки при 1200 × г в течение 3 мин при комнатной температуре для ресуспендирования в окончательном объеме инъекции. Аспирация PBS.
  8. Ресуспендируйте клетки в 0,5 мг/мл Матригеля в 1x PBS до желаемого количества клеток за одну инъекцию в объеме 50 мкл. Держите конечную клеточную суспензию на льду на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить затвердевание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются ячейки LLC-luc. Вводите в количестве 25 000-50 000 клеток в объеме 50 мкл на одну мышь.

5. Хирургическая подготовка

  1. Выполняйте процедуру в хирургическом кабинете, одобренном IACUC для проведения асептических процедур. Очистите хирургический стол дезинфицирующим средством, одобренным ветеринаром.
  2. Положите продезинфицированную грелку, одобренную IACUC, в операционную зону. Постелите на грелку стерильную хирургическую простыню.

6. Хирургическая анестезия

  1. Поместите мышь в индукционную камеру для обезболивания с помощью изофлурана. Установите скорость потока кислорода на уровне 2,0 л/мин, а испаритель на уровне 2% изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию изофлурана можно регулировать в зависимости от размера мыши.
  2. Следите за дыханием мыши и используйте рефлекс отвода педали, чтобы подтвердить соответствующую анестезию.
  3. Поместите мышь в носовой конус в правом боковом лежачем положении на стерильной хирургической простыне. Прежде чем продолжить, убедитесь, что мышь правильно обезболечена с помощью рефлекса отвода педали.
  4. Дайте предоперационный анальгетик, мелоксикам (2 мг/кг веса) подкожно и офтальмологическую мазь на оба глаза.

7. Ортотопическая инъекция в легкие

  1. Очистите операционное поле 3 раза, чередуя 70% этанол и бетадин с помощью стерильной марли. Наденьте на мышь стерилизованную фенестрированную хирургическую простыню с отверстием 3 см х 4 см. Поместите стерилизованные в автоклаве инструменты на хирургическую простыню.
  2. Определите, где нужно сделать разрез, определив краниальный край лопатки и каудальный край грудной грудной грудной клетки с помощью щипцов. Убедитесь, что кожа натянута, используя большой и указательный пальцы хирурга, и сделайте поверхностный разрез 5 мм только через кожу непосредственно под лопаткой с помощью лезвия размера 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирург должен быть в стерильных перчатках.
  3. Прямыми ножницами диаметром 115 мм рассеките подкожный жир с ребер и межреберных мышц. Не разрезывайте межреберные мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить торакодорсальную артерию и глубокую ветвь поперечной шейной артерии, которые расположены рядом с лопаткой. Легкое кровотечение может возникнуть из-за разрезания капилляров внутри кожи и подкожно-жировой клетчатки. Остановите кровотечение, слегка надавливая стерилизованным аппликатором с ватным наконечником.
  4. Используйте щипцы Micro-Adson, чтобы держать разрез открытым. Начиная с седьмого настоящего ребра, используйте изогнутые щипцы средней точки для подсчета вверх, чтобы определить четвертое и пятое ребра. Обратите внимание на эту область для инъекций.
  5. Перемешайте клеточную суспензию, аккуратно перевернув 3-4 раза. Непосредственно перед инъекцией используйте стерильный инсулиновый шприц 300 мкл 31 г 8 мм, чтобы набрать 50 мкл клеточной суспензии и убедиться в отсутствии пузырьков.
  6. Приложите полоску стерилизованной металлической ленты толщиной 4 мм к игле, смыть до шприца, чтобы она действовала как пробка. Это гарантирует, что игла проникнет в легкое всего на 4 мм вглубь.
  7. Введите клеточную суспензию объемом 50 мкл непосредственно ниже четвертого ребра в межреберье между четвертым и пятым ребрами под углом 90°, перпендикулярным легкому. После введения клеточной суспензии удерживайте иглу на месте в течение 2-3 с, чтобы дать Матригелю затвердеть и предотвратить выход клеток из места инъекции.
  8. Медленно извлеките иглу под тем же углом и утилизируйте в емкости для острых предметов.
  9. Зашить кожу 2-3 швами, закрывая квадратными узлами, и добавить ветеринарный хирургический клей, чтобы убедиться, что рана достаточно закрыта.

8. Послеоперационные процедуры

  1. Поместите мышь в пустую клетку на нагревательное устройство, одобренное IACUC. Следите за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от наркоза, что должно занять 1-2 минуты.
  2. Как только мышь насторожится и начнет двигаться, поместите ее в клетку со свежей подстилкой. Наблюдайте за мышью часто в течение первых 24 часов на предмет любых признаков боли или инфекции.
  3. Дайте НПВП анальгетик мелоксикам (2 мг/кг веса) подкожно в течение 2 дней после операции.

9. Мониторинг роста опухоли с помощью in vivo BLI

  1. Контролируйте рост опухоли в легком с помощью BLI уже на следующий день после операции и не реже одного раза в день.
  2. Выполняйте визуализацию in vivo с помощью системы визуализации in vivo (IVIS).
    1. Восполняйте люциферин в концентрации 15 мг/мл в 1x PBS без магния или кальция. Для мыши массой 20 г это эквивалентно введению 200 мкл раствора люциферина с концентрацией 15 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте приготовленный раствор люциферина от света, накрыв алюминиевой фольгой, когда он не используется, так как он светочувствительный.
    2. Откройте программное обеспечение и задайте параметры для биолюминесцентной визуализации. Установите для параметра Время экспозиции значение Авто. Установите Коэффициент биннинга на 4.
    3. Мышам внутрибрюшинно вводят 150 мг люциферина на кг веса.
    4. При визуализации новой модели раковой клетки в первый раз выполните кинетическую кривую, чтобы определить оптимальное время поглощения люциферина, на которое указывает пик люминесценции до того, как она начнет выходить на плато.
      1. Вводите мышам люциферин. Подождите 3 минуты, чтобы люциферин впитался.
      2. Визуализируйте мышей каждые 5-10 минут в течение 60 минут.
        Примечание: Оптимальное время поглощения для различных клеточных линий обычно колеблется от 5 до 15 минут.
    5. Для всех последующих сеансов визуализации используйте оптимальное время усвоения люциферина. Обезболите мышей в рамках подготовки к визуализации в течение этого времени. Поместите мышей в индукционную камеру при концентрации 2% изофлурана со скоростью потока 2,0 л/мин.
    6. После завершения съемки сделайте два снимка, выбрав «Приобрести».
      1. Сначала представьте мышь, лежащую в правом боковом лежачем положении. Это позволяет камере захватить место инъекции, которое находится в левой боковой части мыши. Используйте этот вид для количественной оценки роста опухоли. Изображения, сделанные в этом положении, будут обозначены здесь как вид слева сбоку.
      2. Сразу после того, как первое изображение будет готово, сделайте второе изображение мыши в положении лежа на спине. Это позволяет камере захватывать фотоны, испускаемые опухолью в грудной полости, с вентрального обзора. Используйте эту проекцию (здесь обозначенную как вентральная проекция) для оценки расположения опухоли в грудной полости.
  3. Чтобы проанализировать изображения, измените единицы измерения с «Количество » на «Сияние».
  4. Откройте нёбо инструмента. Перейдите в раздел «Настройка изображения», выберите «Вручную». Выберите минимальное и максимальное значения цветовой шкалы, которая лучше всего подходит для сделанных изображений.
  5. Откройте инструменты ROI. Выберите раскрывающийся список круга, чтобы добавить круг области интереса (ROI) к изображению. Переместите круг над разрезом для левого бокового вида и над центром грудной клетки для вентрального обзора.
  6. Выберите Измерять рентабельность инвестиций.

10. Оценка критериев включения и исключения

  1. Во-первых, подтвердите наличие люминесценции опухоли в легком, наблюдая за изображением слева сбоку.
  2. Далее подтвердите наличие люминесценции опухоли в левой грудной полости на вентральном изображении. Затем убедитесь, что на вентральном изображении имеется только один участок люминесценции.
  3. Если эти два критерия (шаги 10.1, 10.2) выполнены, то оцените критерии исключения, убедившись, что люминесценция не пересекает среднюю линию в грудной полости на вентральном изображении. Если люминесценция не обнаруживается на левом боковом изображении после двух последовательных изображений IVIS в течение 4 дней после операции, исключите эту мышь из дальнейших исследований, так как раковые клетки, скорее всего, не прижились.

11. Оценка опухолей по окончании исследований

  1. Когда общий поток люминесценции опухоли достигнет 1 ×10 8 фотонов/с (p/s) или выше, соберите мышей для оценки конечной точки.
  2. Соберите опухоль для общего анатомического анализа или гистологии, выполнив следующие шаги для анестезии и перфузии легкого, как описано ранее37.
    1. Поместите мышь в индукционную камеру для обезболивания с помощью изофлурана. Установите скорость потока кислорода на уровне 2,0 л/мин, а испаритель на уровне 2% изофлурана. Следите за дыханием мыши и используйте рефлекс отвода педали, чтобы подтвердить соответствующую анестезию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию изофлурана можно регулировать в зависимости от размера мыши.
    2. Поместите мышь в носовой конус в положении лежа на спине. Прежде чем продолжить, убедитесь, что мышь правильно обезболечена с помощью рефлекса отвода педали.
    3. Откройте грудную полость мыши, чтобы визуализировать легкие и сердце за диафрагмой.
    4. Сделайте длинный вертикальный надрез снизу по средней линии мыши. Двигайте кишечник, чтобы визуализировать левую почечную артерию.
    5. Разрежьте диафрагму, чтобы визуализировать сердце.
    6. Перережьте левую почечную артерию.
    7. Введите примерно 5-10 мл 1x PBS через правый желудочек сердца со скоростью примерно 5 мл/мин.
    8. Сделайте надрез вдоль шеи. Очистите от подкожного жира, расположенного над трахеей. Будьте осторожны, чтобы не разрезать трахею.
    9. Параллельно прокалывайте трахею иглой, чтобы ввести 10% формалина непосредственно в трахею, чтобы раздуть и зафиксировать легкие.
    10. Достаньте легкие из грудной полости, разрезав трахею выше верхушки легкого, и разрежьте плевру и связки, прикрепляющие легкое к грудной полости.
    11. Поместите в 10% формалин для фиксации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мышам вводили C57BL6/N в соответствии с представленным протоколом (рис. 1). Использовались клетки LLC, генетически модифицированные для экспрессии люциферазы (LLC-luc). Кроме того, фиктивной мыши был введен Матригель без раковых клеток. БЛЖ при ВВИС можно начинать уже через 1 день после операции. Это исследование LLC-luc было оптимизировано на основе BLI для оценки рака легких на ранних стадиях. Система BLI, используемая в данной статье, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает оптимизированную, минимально инвазивную процедуру, которая обеспечивает быстрое восстановление и почти немедленный мониторинг опухоли, что отличается от более интенсивных хирургических методов, описанных ранее 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. и C.S.C. являются основателями компании Geminii, Inc. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Отделом по расследованию конфликта интересов в Университете штата Айова. У всех остальных авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Картера и Шеффилда Сьюзан Уолш, Брайана Аллена и Кранти Мапускара за ценные дискуссии. Мы также хотели бы поблагодарить Саманту Экли, старшего клинического ветеринара в Управлении по ресурсам для животных, за ее руководство и советы. Мы хотели бы выразить признательность за использование системы визуализации IVIS Lumina S5 в Центре визуализации мелких животных, который является основным ресурсом, поддерживаемым Департаментом радиологии Университета Айовы. Графические иллюстрации из фигур, сгенерированных с помощью Biorender (https://biorender.com). Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Программой биологии свободнорадикальной лучевой терапии NCI T32CA078586 (S.C.H.), системой визуализации IVIS Lumina S5, приобретенной на 1S10OD026835.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-ЭДТА (1 раз)Gibco25200-056
10% нейтральный буферизованный формалинVWR16004-112
Посуды, обработанные тканевыми культурами, размером 100 мм x 20 ммDot Scientific Inc.667621
Чистый этанол 190 градусовDecon Labs2801
3/10 мл инсулинового шприца с BD Ultra-Fine Needle 31 G x 5/16 дюймов.Бектон Дикинсон328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPСигмаA5394
Раствор бетадина с 10% повидон-йодным антисептикомArvio Health L.P.67618-150-04
Мыши C57BL6/NЛаборатории Чарльз-Ривер
Ячейное ситачко 40 мкм нейлона и nbsp;Сокол352340
Компактный анестетикVetamac Anesthesia 
Подогревающая площадка для дальнего инфракрасного диапазона с контроллеромKent Scientific Corporation  
Обычная ручка хирургического лезвия, размер 3Брэд-Паркер371030
Изогнутые универсальные щипцы среднего наконечникаФишербранд16-100-110
ДитиотрейтолResearch Products InternationalD11000
D-Люциферин (соль натрия)Cayman Chemical14682
Драпир, хирургический 18" x 26" Нефенестрация, стерильнаяDealmed783410
Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium (1x)Gibco11965-092
Дульбекко Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) 1 разGibco14190-144
EGTAСигмаE3389
Сыворотка плода для быкаGibcoA5670402
Источник света для волоконно-оптического микроскопа FL150Мэйдзи 
Раствор гентамицинового сульфатаIBI ScientificIB02030
ГлицеринResearch Products InternationalG22025
ИзофлуранPrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Программное обеспечение для создания живых изображенийPerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Используйте линию раковых клеток, которые лучше всего соответствуют потребностям исследования и nbsp;
Сульфат магнияFisher ScientificM63
Матригель Матригель Базальная МембранаКорнинг354234
Держатель для игл Mayo-Hegar, 6", зубчатые челюстиMiltex8-44TC
Щипцы Micro-AdsonТонкие научные инструменты10018-12
Триммер N5 Dog Paw с двойными лезвиямиOneisall 
Нестерильные, 12-слойные марлевые губкиNDCP157112
Смазка для глаз OptixcareAventix5914304
Пенициллин стрептомицинGibco15140-122
Шов из ручного шёлка 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Фосфорная кислота 85%Fisher ScientificA242
Лезвие скальпеля размера 10, нержавеющая сталь, стерильнаяЦинциннати Хирург110
Коническая трубка с винтовой крышкой 50 млСарштедт62.547.100
Тканевые ножницы 4.5" Staight PremiumОнсунгSCT115
Triton X-100СигмаT6878
База ТризмаСигмаT1503
Пятно Trypan Blue (0,4%)Gibco15250-061
Утилитарная алюминиевая фольга с подкладкойIPGALF150L
Деревянные аппликаторы с хлопковыми наконечникамиNDC76200

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи