Создание быстрых колебаний кислорода при анализе роста микробных одиночных клеток с помощью микрофлюидного двухслойного устройства

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод изготовления двухслойного микрофлюидного чипа и анализа роста микробов при быстрых колебаниях кислорода. Производительность устройства была проверена с помощью измерения кислорода в жидкостных каналах и культивирования микроорганизмов.

Аннотация

Микробный анализ одиночных клеток с использованием микрофлюидики в сочетании с покадровой микроскопией обещает исследовать поведение роста микробов в ограниченных средах с пространственно-временным разрешением, предлагая понимание, которое невозможно получить с помощью традиционных культивирования и аналитических платформ. Кислород играет решающую роль в определении роста микроорганизмов. Тем не менее, временной контроль в диапазоне секунд не был реализован в микробиологическом анализе с использованием микрофлюидики. Недавно мы разработали двухслойный микрофлюидный чип PDMS, обеспечивающий временный контроль кислорода в диапазоне десятков секунд. Чип состоит из верхнего слоя для газовыделения и нижнего слоя для культивирования и перфузии жидкости. Два слоя разделены тонкой промежуточной мембраной PDMS, обеспечивающей быстрый газообмен между двумя слоями. В этой методологической статье мы объясняем процедуру изготовления чипа, определения характеристик и культивирования микроорганизмов с использованием чипа. В качестве репрезентативных результатов мы демонстрируем способность к быстрому переключению кислорода за десятки секунд, культивирование микроорганизмов и анализ роста с временным разрешением в условиях постоянного и колеблющегося кислорода. Этот протокол призван помочь исследователям, заинтересованным во внедрении временного контроля кислорода в свою микрофлюидную установку.

Введение

Кислород тесно связан с ростом и физиологией микроорганизмов среди различных факторов окружающей среды, особенно влияя на клеточные процессы, такие как реакция на окислительный стресс, гомеостаз железа и патогенные инфекции ^1,2,3. Традиционно микробное культивирование проводилось в условиях окружающей среды или с минимальным контролем при определенных уровнях кислорода. С другой стороны, в реалистичных сценариях кислородная среда часто не является постоянной во многих случаях, а скорее колеблется с течением времени. Например, микробы могут подвергаться изменению уровня кислорода в водных системах в течение нескольких секунд или минут, поскольку они перемещаются по окружающей среде из-за движения жидкости и подвижности микробов ^4,5,6. Аналогичным образом, промышленные биореакторы также создают неоднородную кислородную среду из-за недостаточного смешивания, что влияет на рост микроорганизмов и конечный выход ^7,8. Изучение реакции микроорганизмов на такие динамические условия имеет жизненно важное значение для понимания экологических процессов и совершенствования биотехнологических приложений.

Факультативные анаэробы, такие как Escherichia coli (E. coli), могут переключаться между аэробными и анаэробными путями в зависимости от наличия кислорода ^9,10. Несмотря на то, что предыдущие исследования изучали эту метаболическую приспособляемость, большинство исследований сосредоточены на одиночных сдвигах кислорода с использованием обычных систем культивирования, которые не могут воспроизвести быстрые изменения, с которыми часто сталкиваются микробы 9,11,12,13,14. В результате существует ограниченное понимание того, как микробы физиологически реагируют на часто меняющиеся уровни кислорода.

Как уже упоминалось, традиционным лабораторным установкам не хватает точности и скорости, необходимых для имитации быстрых колебаний кислорода, и они не поддерживают непрерывный мониторинг с высоким разрешением. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали специализированную микрофлюидную платформу с двухслойным чипом из полидиметилсилоксана (PDMS), позволяющую быстро контролировать кислород^{и визуализировать} отдельные клетки. В этой статье мы предоставляем протоколы для изготовления двухслойного микрофлюидного чипа, который создает быстрые колебания кислорода и позволяет анализировать рост микробных одиночных клеток в контролируемых кислородных условиях. Чип состоит из двух слоев – верхнего слоя для газовой перфузии и нижнего слоя для перфузии жидкости и микробного культивирования. Промежуточная тонкая мембрана между двумя слоями обеспечивает быстрый газообмен. В качестве демонстрации в разработанном чипе была выращена E. coli MG1655. Проанализирован рост в условиях постоянного и осциллирующего кислорода.

Протокол

1. Подготовка формы

1. Подготовьте форму для верхнего слоя с помощью 3D-печати. Изготовьте форму верхнего слоя с гладкой поверхностью, чтобы обеспечить гладкую поверхность полученного верхнего слоя PDMS. Мы рекомендуем использовать стереолитографию (SLA) для 3D-печати.
   1. Спроектируйте пресс-форму с помощью программного обеспечения 3D CAD (Рисунок 1A). Убедитесь, что в конструкцию включены газовые каналы, которые перекрываются с донными жидкостными каналами. Выполняйте этот процесс проектирования параллельно с проектированием нижнего слоя (шаг 1.2.1).
   2. Напечатайте форму с помощью 3D-печати SLA. Удалите остатки смолы из напечатанной формы и промойте ее в ванне с изопропиловым спиртом (IPA) в течение 30 минут (рисунок 1B).
   3. Выполняйте последующее отверждение, подвергая форму воздействию света 405 нм с соответствующей продолжительностью и температурой в зависимости от типа и геометрии смолы.
   4. Дайте форме замочиться в IPA в ультразвуковой ванне в течение 15 минут, чтобы удалить неотвержденную смолу, оставшуюся в форме, которая в противном случае могла бы препятствовать отверждению PDMS.
2. Подготовьте силиконовую вафельную форму для нижнего слоя.
   1. Спроектируйте микрофлюидный чип с помощью редактора топологий САПР (Рисунок 1C). Убедитесь, что конструкция включает в себя входные отверстия, каналы для жидкости и выпускные отверстия.
   2. Создание формы для кремниевых пластин с помощью двухслойной фотолитографии, как описано в предыдущей статье (рис. 1D)¹⁶.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каналы на нижнем слое имеют размер μм и требуют точного изготовления, в то время как каналы на верхнем слое имеют размер мм. Поскольку 3D-печать SLA обеспечивает более короткое время изготовления и, следовательно, более быстрое прототипирование, SLA-печать использовалась для изготовления довольно больших конструкций для пресс-формы верхнего слоя. Нижний слой был изготовлен с помощью фотолитографии для обеспечения точного изготовления. Если каналы в верхнем слое также находятся в диапазоне μм и требуют точности, рассмотрите возможность изготовления пресс-формы с использованием фотолитографии.

2. Изготовление двухслойных микрофлюидных чипов PDMS

1. Приготовьте раствор предварительного отверждения PDMS, тщательно перемешав основу и отвердитель в соотношении 10:1. Дегазируйте смесь в эксикаторе в течение 1 ч.
2. Очистите верхний слой формы с помощью IPA и высушите с помощью сжатого воздуха.
3. Залить PDMS в форму верхнего слоя, после чего провести термическое отверждение при 80 °C в течение 20 мин (^1-я стадия отверждения, рис. 1E). ^1-я стадия отверждения позволяет отслаивать, резать и пробивать PDMS, пока она не полностью отверждается.
4. Проверьте липкость PDMS вручную или пинцетом после 20 минут нагрева. Если PDMS все еще липкий, отрегулируйте время нагрева.
5. Извлеките PDMS из верхнего слоя формы и разрежьте его на отдельные части (в данном случае 20 мм х 18 мм). Отверстия для пробивки (диаметр = 0,75 мм) для впуска газа (рис. 1F). Очистите нижнюю поверхность верхнего слоя путем промывки изопропиловым спиртом, просушки сжатым воздухом и прикрепления клейкой ленты.
6. Очистите нижний слой формы с помощью IPA и просушите ее с помощью сжатого воздуха. Закрепите нижний слой формы на отверстивателе для нанесения покрытий и залейте PDMS в центр формы. Налейте PDMS близко к пластине, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха. Если после заливки PDMS были обнаружены пузырьки воздуха, переместите их на внешнюю сторону с помощью чистого пинцета или игл.
7. Нанесите слой PDMS на нижний слой формы при 1000 об/мин в течение 60 с, а затем термическое отверждение при 80 °C в течение 10 мин (^1-й этап отверждения, рис. 1G). Проверьте липкость PDMS вручную или пинцетом через 10 минут и при необходимости отрегулируйте время нагрева.
8. Поместите детали верхнего слоя PDMS на нижний слой PDMS на пресс-форме и плотно прижмите сверху, чтобы обеспечить поверхностное крепление верхнего и нижнего слоев (рис. 1H).
9. Полностью термически отверждите PDMS при 80 °C в течение не менее 1 ч (^2-я стадия отверждения). ^2-я стадия отверждения позволяет провести окончательное отверждение PDMS, при котором верхний и нижний слои необратимо связаны друг с другом (Рисунок 1H).
10. Аккуратно разрежьте нижний слой PDMS на кусочки. Осторожно снимите всю микросхему PDMS с формы (рисунок 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если стружку PDMS трудно отклеить от формы, рассмотрите возможность дальнейшей обработки поверхности формы нижнего слоя, такой как силанизация и химическое покрытие поверхности, чтобы облегчить процедуру отслаивания. Если верхний и нижний слои отделяются во время отслаивания, рассмотрите возможность сокращения времени на^1-й этап отверждения.
11. Отверстия (диаметр = 0,5 мм) для входных и выходных отверстий жидкости на обоих концах каналов жидкости (рис. 1H). Тщательно очистите нижнюю поверхность чипа, промыв изопропиловым спиртом, просушив сжатым воздухом и прикрепив скотч.
12. Соедините чип с защитным стеклом толщиной 0,175 мм после активации поверхности плазменным окислением (25 с, рис. 1H).
13. После размещения чипа на стеклянной подложке промойте верхний слой сжатым воздухом, чтобы убедиться, что нижний слой мембраны PDMS правильно прикреплен к стеклу.
14. Нагрейте склеиваемую стружку при 80 °C в течение от 10 с до 1 минуты для повышения стабильности склеивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеупомянутый этап отверждения PDMS и требуемое время отверждения могут зависеть от различных параметров, таких как толщина пресс-формы, оборудование и условия окружающей среды. Поэтому соответствующим образом отрегулируйте время отверждения в случае, если предложенный протокол не подходит для применения.

3. Экспериментальная установка

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве стандартной экспериментальной установки используется инвертированный микроскоп, оснащенный камерой на основе комплементарного металлоксидного полупроводника (CMOS), камерой флуоресцентной микроскопии в течение жизни (FLIM) (в частотной области) и температурным инкубатором. К камере FLIM подключен модулированный лазерный источник возбуждения (445 нм, 100 мВт). Для контроля газов используются три регулятора массового расхода (азота, кислорода и углекислого газа). Шприцевые насосы используются для средней перфузии.

1. Подготовьте трубки для перфузии газа (на входе) и жидкости (на входе и выходе). Включите инкубатор, чтобы достичь нужной температуры перед экспериментом (здесь 37 °C).
2. Выберите нужный объектив (в данном случае 20x для измерения кислорода и 100x для наблюдения за микроорганизмами) и при необходимости добавьте в него иммерсионное масло. Закрепите двухслойную стружку на чипхолдере с помощью клея.

4. Интегрированный контроль и измерение кислорода

1. Приготовьте чувствительный к кислороду раствор красителя с соответствующей концентрацией (здесь 3 мМ трис(2,2'-бипиридил)дихлорутения(II)гексагидрат, RTDP).
2. Откалибруйте камеру FLIM с помощью опорного предметного стекла с известным временем службы (в данном случае 3,75 нс). Измерьте интенсивность сигнала с помощью камеры FLIM и отрегулируйте время экспозиции или диафрагму микроскопа, чтобы достичь интенсивности сигнала 0,68–0,72 для лучшей калибровки.
3. Закрепите чипхолдер на предметном столике микроскопа. Подсоедините соответствующие трубки к входу и выпуску жидкости. Начните перфузию кислородочувствительного раствора красителя с постоянной скоростью потока с помощью шприцевого насоса (здесь 100 нл/мин).
4. Подсоедините регуляторы впуска газа и массового расхода с помощью соответствующих трубок. Начните промывку газа с контролируемой концентрацией кислорода (здесь 0% или 21% кислорода, общий массовый расход 600 мл/мин).
5. Измерьте время жизни фазы в отсутствие кислорода (τ₀) и при другой известной концентрации кислорода (здесь 21%). Рассчитайте константу гашения (K_q) с помощью уравнения Штерна-Фольмера следующим образом, которое описывает гашение флуоресценции в присутствии кислорода. В качестве альтернативы можно использовать интенсивность флуоресценции (I); Однако на измерение интенсивности могут влиять изменения интенсивности источника света, фотообесцвечивание и т. д.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подождать несколько минут после начала продувки газом, чтобы обеспечить точную калибровку, особенно при достижении уровня истощения кислорода до 0%. Для повышения точности рассмотрите возможность дополнения процесса дополнительными методами истощения кислорода, такими как использование поглотителей кислорода или дополнительной герметичной камеры.
6. Измерьте время жизни фазы и рассчитайте соответствующую концентрацию кислорода с помощью уравнения Штерна-Фольмера. Для создания условий колебательного кислорода используйте любую систему управления прибором для автоматической регулировки объемного расхода азота и кислорода.

5. Подготовка бактериальной культуры

1. . Начните прекультуру с инокуляции нужного микроорганизма (в данном случае, E. coli MG1655, одна готовая к использованию бусина из криофлакона в колбе) в желаемую среду (здесь среда LB, содержащая 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl) и инкубируйте в течение ночи (здесь 37 °C при 150 об/мин).
2. Измерьте полученную оптическую плотность с помощью фотометра на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀).
3. Инициируйте следующую культуру в среде LB путем инокуляции предкультуры (здесь начальный OD₆₀₀ = 0,3 или 0,0001). Инкубируйте культуру до тех пор, пока она не достигнет фазы экспоненциального роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда для выращивания на чипе отличается от первой среды для выращивания на чипе, желательно провести вторую предварительную среду с использованием среды для выращивания на чипе, чтобы организмы могли ознакомиться с новой средой¹⁶.
4. Приготовьте раствор для посева, разбавив культуру до соответствующей оптической плотности. Перелейте посевной раствор в шприц объемом 1 мл для следующего шага. Для E. coli оптическая плотность (OD₆₀₀) затравочного раствора составляла около 0,5.

6. Культивирование микроорганизмов на кристалле и покадровая визуализация в условиях контролируемого содержания кислорода

1. Закрепите чипхолдер на предметном столике микроскопа. Дайте чипхолдеру и чипу PDMS прогреться в инкубаторе (здесь 37 °C) в течение нескольких часов, так как это снизит риск расфокусировки во время цейтраферной визуализации из-за смещения, связанного с температурой.
2. Перед началом культивирования начните газообразование с желаемой начальной концентрацией кислорода, регулируя объемный процент массового расхода кислорода и азота, сохраняя при этом общую скорость потока и скорость потока углекислого газа постоянными.
3. Подключите вход газа чипа и регуляторы массового расхода.
4. Засейте организм в чип, подсоединив шприц с раствором для посева к выходному отверстию жидкости и вручную протолкнув шприц. Проверьте через микроскоп, удалось ли клеткам попасть в камеры для культивирования.
5. После инокуляции клеток извлеките шприц и подсоедините другой шприц со свежей средой к входу жидкости. Вручную нажмите на шприц, чтобы промыть оставшиеся клетки в канале подачи среды.
6. Начните перфузию среды с постоянным расходом (в данном случае 100 нл/мин) с помощью шприцевого насоса. Обеспечьте достаточную скорость потока, так как недостаточная скорость может привести к высыханию камеры. Достаточный расход может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, в том числе от геометрии канала жидкости и расхода газа в канале верхнего слоя.
7. Запустите цейтраферную съемку изображений. При выращивании в условиях колебательного кислорода запускайте автоматическое управление регуляторами массового расхода одновременно с началом получения изображения. В случае задержки в начале контроля подачи газа и получения изображения, учитывайте эту задержку для последующего анализа данных изображения.

7. Анализ данных изображения

1. Сохраняйте цейтраферное изображение в виде одной стопки изображений для каждой позиции.
2. Выполните предварительную обработку изображения, чтобы повернуть, выровнять и обрезать культивируемую колонию с помощью программ анализа изображений. Примеры предварительно обработанных доменов . Изображения TIF доступны здесь:^{https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747 15}
3. Сегментируйте ячейки и извлекайте соответствующие значения, такие как номер ячейки, длина, площадь, интенсивность флуоресценции и так далее. Проанализируйте поведение роста дальше. Примеры скриптов Python доступны здесь: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Результаты

Изготовление двухслойных чипов PDMS
Изготовленный двухслойный чип изображен на рисунке 2A, с цветными газовыми каналами (красным) и жидкостными каналами (синие) для визуализации. Чип имеет три идентичных жидкостных канала и перекрывающиеся газовые каналы, что позволяет проводить параллельные эксперименты. Жидкостный канал имеет зону культивации с рядом камер для культивации (Рисунок 2A(i)). Клетки попадают в ловушку внутри камер культивирования и позволяют им расти в монослоевом формате, что позволяет получать покадровую съемку с высоким разрешением и высокой скоростью получения изображений. Поперечное сечение чипа иллюстрирует верхний слой толщиной 3 мм и нижний слой толщиной 65 мкм, что обеспечивает быструю диффузию газа из газового канала в канал жидкости через промежуточную мембрану PDMS (рис. 2A (ii-ii')).

Интегрированный контроль кислорода
Газообменная способность разработанного чипа была проверена с использованием FLIM и кислородочувствительного красителя¹⁵. Как показано на рисунке 2В, концентрация кислорода в канале жидкости демонстрировала либо соответствующее снижение, либо увеличение в течение десятков секунд при изменении концентрации кислорода в диапазоне от 21% до 0%. Эти результаты измерения кислорода демонстрируют, что быстрые колебания кислорода за десятки секунд могут быть воспроизведены в разработанном двухслойном микрофлюидном чипе.

Микробное культивирование в условиях постоянного содержания кислорода
Чип впервые был использован для определения характеристик роста факультативного анаэроба E. coli в постоянных газовых условиях с различными концентрациями кислорода. Углекислый газ всегда добавляли в поступающий газ, так как в предварительных экспериментах мы наблюдали ограниченный рост E. coli при истощении углекислого газа (данные не показаны). На рисунках 3A и 3B представлены репрезентативные фазово-контрастные изображения E. coli в аэробных (21% поступление кислорода) и анаэробных (0% кислорода) условиях, соответственно. Через 3 ч культивирования E. coli, выращенная в аэробных условиях, привела к увеличению колоний по сравнению с анаэробными условиями. Количественный анализ также показывает различные темпы увеличения размера колонии (колонии) в зависимости от доступности кислорода, как показано на кривых роста на рисунке 3C. Обратите внимание, что _{колония} нормализуется по начальной площади, чтобы можно было сравнивать различные колонии и условия. Экспоненциальный темп роста μ можно определить по кривой роста следующим образом и обобщить на рисунке 3D.

Полученные результаты подтверждают способность устройства контролировать содержание кислорода в заданных концентрациях и эффективно анализировать соответствующий рост микроорганизмов по полученным покадровым изображениям.

Микробное культивирование в условиях осциллирующего кислорода
Наконец, E. coli культивировали в условиях осциллирующего кислорода, переключаясь между аэробной и анаэробной фазами газообразования с интервалом переключения T'. Были исследованы различные T' в диапазоне от 60 минут до 1 минуты для проверки возможности анализа роста с временным разрешением в корреляции с условиями колебаний кислорода. На рисунке 4 показан количественно выраженный рост E. coli в условиях колебаний кислорода с T' = 60, 30, 10, 5, 2 и 1 мин. В дополнение к кривой роста, основанной на _{колонии} A, мгновенный темп роста μ_Δt также определяется для получения информации с временным разрешением следующим образом.

Темпы роста при постоянных аэробных и анаэробных условиях также показаны пунктирными линиями (μ_21%, μ_0%) на рисунке 4 в качестве ориентиров для роста. Рост E. coli демонстрировал отчетливую динамику в ответ на колебания газообразных условий. Например, после того, как фаза газообразования была изменена с аэробных на анаэробные условия (T' = 60 мин), рост показал (i) фазу реагирования: внезапное снижение скорости роста, за которой последовало (ii) фазу восстановления: постепенное увеличение скорости роста, и (iii) фазу стабилизации: стабилизацию роста около μ_0%. Динамика роста E. coli была успешно разрешена во времени при различных T' всего за 1 мин, где E. coli демонстрировала монотонную скорость роста вверх и вниз из-за ограниченного времени адаптации роста к изменяющимся газовым условиям. Кроме того, поведение роста может быть проанализировано не только на уровне колонии, но и на уровне отдельных клеток. На рисунке 5 показано развитие области одиночной ячейки при колебаниях кислорода при различных интервалах переключения T'. О росте одиночных клеток можно судить, следуя по соседним графикам, без анализа отслеживания. Поведение роста на уровне отдельных клеток напоминает то, что наблюдалось на уровне колонии на рисунке 4; более быстрое увеличение площади во время фазы аэробного газообразования и явное изменение скорости роста при переключении газа. Полученные результаты демонстрируют возможность культивирования микробов в условиях колебаний газа и анализа роста микроорганизмов в корреляции с доступностью кислорода с временным разрешением.

Иллюстрация 1: Процедура изготовления двухслойных чипов. Процедура начинается с (A, C) проектирования пресс-формы, (B, D) изготовления пресс-формы, (E-G) формования PDMS и (H) сборки микросхемы. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Изготовленный двухслойный чип и его способность контролировать кислород. (A) Представлено репрезентативное изображение изготовленного чипа с цветными газовыми каналами (красным) и жидкостными каналами (синим) для визуализации. Изображение СЭМ показано на рисунке (i), на котором изображен ряд камер выращивания, соединенных с жидкостными каналами с обеих сторон (масштабная линейка 100 мкм). Поперечное сечение чипа показано на рисунках (ii-ii'), на котором изображены верхний слой толщиной 3 мм и нижний слой толщиной 65 мкм. (B) Измеренная концентрация кислорода в канале жидкости после переключения между аэробными (21% кислорода) и анаэробными (0% кислорода) условиями. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Выращивание кишечной палочки в условиях постоянного кислорода. (A) Клетки культивируют аэробным способом (21% поступления кислорода) в течение 3 ч, а с помощью фазово-контрастной микроскопии получают покадровые изображения. (B) Клетки культивируются анаэробно (0% поступления кислорода) и покадровые изображения получаются в течение 3 ч. (C) Рост клеток при различных условиях постоянного кислорода строится на основе _{колонии} А. (D) Экспоненциальный темп роста рассчитывается и суммируется. Все масштабные линейки = 5 мкм. Данные выражены в виде среднего значения ± S.D. n = 35 колоний (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Культивирование кишечной палочки в условиях колебательного кислорода. Исследуется рост клеток в различных условиях колебательного кислорода (T', интервал переключения между аэробными и анаэробными условиями). Рост клеток на основе _{колонии} A построен на графике во времени (вверху), а μ_Δt — во времени, чтобы обеспечить интерпретацию данных с временным разрешением (внизу). Данные выражаются в виде среднего значения ± S.D. n = 5 колоний (60 мин), 3 (30 мин), 4 (10 мин), 4 (5 мин), 4 (2 мин), 5 (1 мин). Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Площадь одной клетки (A _{single cell} ) кишечной палочки , культивируемой в условиях колебательного кислорода. Данные получены из репрезентативной колонии с каждого интервала переключения T'. Эта цифра была изменена с¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Был разработан протокол изготовления и эксплуатации двухслойной микрофлюидной системы для наблюдения за ростом микроорганизмов в условиях быстро колеблющегося кислорода с высоким пространственно-временным разрешением. В сочетании с покадровой визуализацией эта платформа позволяет выращивать микроорганизмы на чипе и отслеживать их в режиме реального времени в условиях контролируемого содержания кислорода, что позволяет анализировать рост микроорганизмов в зависимости от доступности кислорода.

В этом протоколе верхний и нижний слои подготавливаются отдельно, а затем собираются в одну микросхему. Эта модульная концепция позволяет создавать различные конструкции чипов, просто заменяя двухслойные конфигурации. Для пресс-форм верхнего и нижнего слоев использовались различные методы изготовления - 3D-печать SLA для верхней части и фотолитография для нижней части - в зависимости от их соответствующих требований к размеру и точности. Такой подход повышает общую эффективность производственного процесса. Сборка двух слоев осуществляется с помощью двухэтапного процесса отверждения PDMS. Важно оптимизировать время нагрева для первого этапа отверждения в соответствии с проектом, так как толщина формы и местные условия нагрева могут повлиять на результаты отверждения PDMS.

Мы используем природу PDMS с высокой воздухопроницаемостью для достижения быстрого переключения кислорода. С другой стороны, на точность контроля кислорода также может влиять пассивная диффузия кислорода через PDMS, особенно при более низких уровнях кислорода. Чтобы компенсировать это ограничение, в протокол могут быть добавлены дальнейшие улучшения. Например, метод калибровки датчика кислорода имеет возможности для улучшения. В продемонстрированном протоколе датчик калибруется по двум опорным точкам, 0% и 21% кислорода, с помощью двухслойного чипа PDMS. Следовательно, точность измерения кислорода зависит от способности создавать точные условия для калибровки с обедненным кислородом. Как указано в протоколе, рекомендуется подождать несколько минут после начала продувки газом, чтобы обеспечить точную калибровку, особенно при достижении уровня истощения кислорода до 0%. Тем не менее, эта задача является сложной из-за потенциальных утечек или задержки воздуха в воздухопроницаемом чипе PDMS. Точность калибровки может быть дополнительно повышена за счет использования химических веществ, поглощающих кислород, или помещения чипа в плотно закрытую, обедненную газами камеру^17,18. Эти добавки могут позволить проводить более надежный и точный анализ поведения микроорганизмов в строго анаэробных условиях и условиях с низким содержанием кислорода.

Демонстрируемое устройство будет представлять интерес для различных областей исследований. Например, это было бы полезно для воспроизведения кислородных условий в промышленных биореакторах, где доступность кислорода предполагается пространственно-временной неоднородностью 7,8,19,20. Использование двухслойного чипа позволяет исследователям характеризовать и понимать поведение микроорганизмов в быстро колеблющихся кислородных средах, что было невозможно в обычных условиях выращивания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клевин 5	Программное обеспечение WieWeb, Нидерланды	Н/Д	Верстка
КМОП-камера	Nikon, Япония	ДС-Ки2
покровное стекло	Schott AG, Германия	D263 Биография	39,5 мм x 34,5 мм x 0,175 мм
Фемтоплазменный очиститель	Diener Electronics, Германия	-	Плазменное склеивание чипа
Форма 3B	Formlabs, США	-	3D-принтер
Пожизненный отзыв	Starna Scientific, Великобритания	UMM-SFG
Регулятор массового расхода	Vö gtlin Instruments GmbH, Швейцария	ГСК-А9СА-ВВ22	азот, кислород
Регулятор массового расхода	Vö gtlin Instruments GmbH, Швейцария	ГСК-А9СА-ВВ21	двуокись углерода
Смола модели v3	Formlabs, США	РС-Ф2-ДМБЭ-03	Смола для 3D-печати
NaCl	Карл Рот, Германия	3957.1	Средний компонент LB
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Япония	-	Инвертированный микроскоп
Камера PCO.flim	PCO AG, Германия	-
Лазер PCO.flim	Omicron-Laserprodukte GmbH, Германия	-
Пептон	Карл Рот, Германия	8986.1	Средний компонент LB
План Апо и лямбда;	Nikon, Япония	-	100x масло, 20x
Полидиметилсилоксан (PDMS)	Dow Chemical Company, США	Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров
Пробивной инструмент, Φ 0,50 мм	World Precision Instruments, США	504528
Пробивной инструмент, Φ 0,75 мм	World Precision Instruments, США	504529
Криофлакон ROTI Store	Карл Рот, Германия	-
Solidworks 2016 x64 Edition	Dassault Systems, Франция	Н/Д	3D САПР
Установка для нанесения покрытий на подложку	APT Automation, Германия	СПИН150i	Прядильное покрытие PDMS
Шприцевой насос	ЦЕТОНИ, Германия	neMESYS
Температурный инкубатор	Околаб, Италия	-	Оборудование для микроскопа
трис(2,2'-бипиридил)дихлорутений(II)гексагидрат, (RTDP)	Acros Organics, Бельгия	208750010
Трубопровод	Сен-Гобен, Франция	Tygon F-4040-A	Трубки на входе газа
Трубопровод	Сен-Гобен, Франция	Тайгон AAD04103	Трубки для жидкости
Дрожжевой экстракт	Карл Рот, Германия	2363.3	Средний компонент LB