Method Article

Высокопроизводительная технология сортировки циркулирующих опухолевых клеток и секвенирования одиночных клеток на основе микрофлюидики

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) имеют решающее значение для изучения прогрессирования рака и метастазирования. В этой статье представлен высокопроизводительный интегрированный протокол для обогащения ЦОК и секвенирования одной ЦТК, повышающий эффективность захвата и чистоту ЦОК при одновременном снижении затрат на контаминацию и секвенирование, тем самым продвигая прецизионные онкологические исследования и клиническое применение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) служат многообещающим биомаркером для отслеживания метастазирования, прогрессирования и рецидива рака. Методы жидкостной биопсии, ориентированные на обнаружение ЦОК, продемонстрировали значительный потенциал благодаря своей неинвазивности и способности обеспечивать мониторинг динамики опухоли в режиме реального времени. Тем не менее, обычные объемные анализы КТК не могут уловить внутреннюю гетерогенность среди популяций ЦОК, что скрывает важные сведения о биологии опухолей. Секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) позволяет с высоким разрешением охарактеризовать гетерогенность ЦОК, открывая новые возможности для прецизионной онкологии и механистических исследований прогрессирования опухоли. Несмотря на эти преимущества, существующие методики секвенирования с помощью одного ТПК, как правило, страдают от неэффективности, включая низкую скорость восстановления, трудоемкие рабочие процессы и риски загрязнения, связанные с несколькими этапами ручной обработки. Чтобы устранить эти ограничения, мы представляем интегрированный микрофлюидный протокол, который объединяет обогащение, очистку и секвенирование отдельных клеток CTC в единый рабочий процесс. Метод использует динамически контролируемый магнитный захват внутри чипа, структурированного как «елочка», где вихревое смешивание и кумулятивное связывание иммуномагнитных шариков обеспечивают надежную высокопроизводительную изоляцию CTC с минимальным повреждением клеток. Последующая очистка с использованием микрофлюидного чипа, покрытого лейкоцитарными антителами, эффективно удаляет клетки, не являющиеся мишенями, что еще больше повышает чистоту CTC за счет отрицательного отбора. Наконец, высокоточный чип секвенирования отдельных ячеек, разработанный на основе принципов дифференциального сопротивления потоку, облегчает эффективный захват одиночных клеток и сопряжение с уникальными микрогранулами со штрихкодами. Эта новая платформа преодолевает ограничения методов, основанных на распределении Пуассона, улучшая использование CTC при минимизации потребления микрогранул и затрат на секвенирование. Наш интегрированный протокол значительно повышает эффективность захвата ЦОК, чистоту и пропускную способность секвенирования отдельных клеток, что делает его хорошо подходящим для клинических применений и крупномасштабных исследований рака. Обеспечивая более точный и масштабируемый анализ гетерогенности ЦОК, этот метод имеет потенциал для совершенствования ранней диагностики рака, мониторинга лечения и механистических исследований метастазов, что в конечном итоге продвигает вперед область точной онкологии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метастазирование опухоли является сложным и многофазным процессом, начинающимся с диссеминации, а затем претерпевающим спячку и колонизацию опухолевыми клетками в пределах первичной опухоли. Эти клетки постепенно проникают через базальную мембрану в более глубокие ткани, а затем интравируются в кровеносные сосуды или лимфатические системы. Попадая в кровоток, эти клетки становятся циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), которые могут перемещаться в отдаленные органы1. Появление ЦОК является критическим этапом в метастатическом каскаде, так как они служат семенами для отдаленных метастазов1. В последние годы технология жидкостной биопсии на основе КТК привлекла значительное внимание благодаря своим достоинствам, в том числе неинвазивному и удобному характеру процедуры, а также возможности динамического мониторинга в режиме реального времени. Эта технология способствует точной и всесторонней оценке биологии опухоли в режиме реального времени, предлагая уникальные преимущества в мониторинге эффективности лечения, прогнозировании рецидива и руководстве терапией 2,3,4. Кроме того, исследования показали, что ЦОК присутствуют в периферической крови даже на стадиях с низкой опухолевой нагрузкой, таких как ранний рак, раннее метастазирование или рецидив 5,6. Следовательно, жидкостная биопсия ЦОК преодолевает ограничения традиционной биопсии тканей, которые ограничиваются солидными опухолями, обнаруживаемыми с помощью визуализации7. Он обеспечивает новую перспективу и технологическую поддержку для ранней диагностики рака, мониторинга рецидивов и метастазов, руководства лечением, а также выяснения механизмов инициации, прогрессирования и метастазирования опухоли. Например, было показано, что количество ЦОК в периферической крови служит независимым предиктором как выживаемости без прогрессирования, так и общей выживаемости у онкологических больных, при этом более высокое количество ЦОК указывает на худший прогноз8. Динамические изменения числа ЦОК также тесно связаны с прогрессированием заболевания и опухолевым бременем после лечения 9,10.

Недавние исследования показали, что микрофлюидные технологии являются преобразующими инструментами для выделения ЦОК. Эти технологии можно разделить на физически и биологические, каждая из которых предлагает явные преимущества при решении конкретных проблем. Физические методы основаны на различиях в размерах и деформируемости для разделения ЦОК, что позволяет сортировать без меток с высокой производительностью. Однако эта неспецифическая стратегия разделения может поставить под угрозу как эффективность захвата, так и чистоту из-за присущей ЦОК гетерогенности. Например, Lu et al. сообщили о микрофлюидном чипе, который объединил конструкцию разделения фокуса и снижения скорости с решетками ловушек, который превзошел большинство традиционных физических методов с точки зрения обогащенияи очистки CTC. Тем не менее, чип достиг лишь 3-4 логарифмического истощения лейкоцитов (WBC), что остается недостаточным для клинического применения. С другой стороны, основанные на иммуноаффинности стратегии выделения ЦОК обычно обеспечивают более высокую скорость восстановления и чистоту клеток-мишеней. Однако связывающее взаимодействие между молекулами захвата и ЦОК часто ограничивает пропускную способность таких подходов12,13. Соответственно, метод выделения, который сочетает в себе высокую эффективность обогащения и пропускную способность, имеет важное значение для эффективной обработки клинических образцов с редкими популяциями ЦОК.

Кроме того, существенная гетерогенность среди ЦОК представляет собой значительную проблему для последующих анализов 10,14,15, поскольку обычные объемные анализы ЦОК часто скрывают индивидуальные клеточные различия. Секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) способствует всесторонней характеристике гетерогенности экспрессии генов CTC на молекулярном уровне, позволяя получить представление о классификации, состоянии и функции CTC. Эта технология предлагает новые подходы к прецизионной онкологии и облегчает исследование инициации, прогрессирования и механизмов метастазирования опухоли16. Например, Fan et al. построили транскриптомный атлас с одним ЦТК из различных сосудистых участков у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, выявив пространственную гетерогенность среди ЦОК и определив ключевые медиаторыуклонения от иммунитета. В то же время Миямото и др. идентифицировали мутации гена андрогенных рецепторов и варианты сплайсинга в ЦОК пациентов с раком предстательной железы, тем самым прояснив механизмы, лежащие воснове лекарственной устойчивости.

Тем не менее, развитие транскриптомного секвенирования с одним ЦТК продвигается медленно. Существующие методологии страдают от недостатков в автоматизации и интеграции, что приводит к низкой эффективности восстановления ЦОК, сложным процедурам и низким показателям успешности экспериментов19. Например, современные протоколы требуют последовательного процесса, включающего обогащение ЦОК, очистку, выделение одиночных клеток и амплификацию нуклеиновых кислот. Эти этапы выполняются в отдельных центрифужных пробирках, что требует нескольких этапов пипетирования и переноса. Трудоемкие процедуры не только снижают эффективность, но и увеличивают риск потери и загрязнения ЦОК20. Традиционные подходы, такие как отбор клеток на основе капилляров, еще больше ограничивают пропускную способность и аналитическую эффективность при выделении одиночных клеток21. Более того, традиционные методы также ограничены распределением Пуассона, которое является статистическим явлением, описывающим случайную инкапсуляцию клеток. Это приводит к высокой доле пустых капель или нескольких ячеек на каплю, что снижает эффективность улавливания. Чтобы решить эти проблемы, исследователи разработали интегрированные микрофлюидные чипы для транскриптомного анализа одиночных клеток CTC. Эти платформы объединяют несколько этапов в однокристальный рабочий процесс, снижая риски загрязнения и повышая эффективность анализа. Например, Euisik Yoon et al. разработали метод Hydro-Seq, который использует выбор размеров на основе гидродинамики для выделения ЦОК в микрокамеры и эффективного сопряжения отдельных ЦОК с уникальными микрогранулами со штрих-кодом22. Этот подход позволяет проводить высокопроизводительный параллельный одноклеточный анализ нескольких ЦОК.Однако этот метод основан на разделении ЦОК по размеру, что часто приводит к низкой чистоте ЦОК и ограниченной производительности (10 мкл/мин), что делает его непригодным для обработки больших объемов клинических образцов. В связи с этим существует острая потребность в разработке интегрированной, высокопроизводительной, малообъемной и устойчивой к загрязнению одноклеточной системы анализа ЦОК.

В данной статье мы описываем высокопроизводительный и эффективный протокол для обогащения CTC и секвенирования одиночных клеток, состоящий из трех основных компонентов: сортировки CTC, очистки и чипа для секвенирования одиночных клеток (рис. 1). Микрофлюидный чип для сортировки CTC разработан на основе принципа динамически регулируемых магнитных сил захвата (рис. 2A). Он обеспечивает высокопроизводительное обогащение CTC за счет вихревого перемешивания в структуре «елочки», а также кумулятивный захват иммуномагнитными шариками. Неразрушающее высвобождение ЦОК впоследствии достигается за счет точной модуляции магнитного поля. Затем используют очистительный чип, в котором микроканалы, покрытые лейкоцитарными антителами, используют для отрицательного отбора, получая высокоочищенные ЦОК (рис. 2B). Наконец, была использована высокоэффективная платформа для манипулирования одиночными клетками, основанная на дифференциальном сопротивлении потоку, которая успешно преодолела ограничения распределения Пуассона и обеспечила эффективное спаривание и захват одноклеточной/кодированной микросферы (рис. 3A). Это значительно повышает эффективность использования CTC, снижая при этом расход микрогранул и затраты на секвенирование.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схема технологии сортировки CTC и секвенирования одиночных клеток на основе микрофлюидики. Этот рабочий процесс иллюстрирует процесс, с помощью которого опухолевые клетки отделяются от опухолевых поражений, попадают в кровоток и образуют ЦОК. Образцы периферической крови или лейкопака, содержащие ЦОК, последовательно обрабатываются с помощью чипов захвата, очистки и секвенирования scRNA-seq, что в конечном итоге позволяет проводить транскриптомное секвенирование и биоинформатический анализ ЦОК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Метод 1: Выделение ЦОК на основе микрофлюидики

  1. Изготовление чипа «елочкой» (HB-chip)
    1. Подготовка мастер-формы
      1. Подготовьте чистую силиконовую пластину и выпекайте ее при температуре 135 °C в течение ночи, чтобы удалить влагу. После охлаждения до комнатной температуры обработайте пластину с помощью кислородно-плазменного очистителя мощностью 150 Вт в течение 1 минуты для активации поверхности.
      2. Смоделируйте первый слой микросхемы так, чтобы сформировать массив опорных столбов (28 столбцов × 7 строк, пронумерованных от #1 до #28 по направлению потока) с помощью фоторезиста SU-8. Установите прядильную машину для нанесения покрытий на последовательную работу со скоростью 500 об/мин в течение 10 с, 2350 об/мин в течение 55 с и 500 об/мин в течение 10 с. Убедитесь, что высота этого слоя составляет 50 мкм.
      3. Мягкий выпекайте первый слой при температуре 65 °C в течение 1 минуты, затем при 95 °C в течение 20 минут, чтобы растворитель испарился. Остудить до комнатной температуры.
      4. Экспонируйте первый слой с помощью фотошаблона с соответствующей конструкцией опорного столба. Установите дозу воздействия на 130 мДж/см2.
      5. Выпекайте после выдержки при температуре 65 °C в течение 1 минуты, а затем при 95 °C в течение 6 минут.
      6. После охлаждения нанесите проявитель SU-8 на поверхность пластины, чтобы удалить несшитый фоторезист и получить нижний слой. Дайте ему постоять в течение 30 секунд, затем промойте деионизированной водой.
      7. Нанесите отжимной слой второго слоя SU-8 поверх первого слоя, используя те же параметры отжима, что и в шаге 1.1.1.2. Смоделируйте второй слой так, чтобы сформировать структуры «елочкой» под углом 45° к стенке канала, с шириной канавки 100 мкм, шагом 200 мкм и шестью гребнями за цикл. Убедитесь, что высота этого слоя также составляет 50 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Принципиальная схема, иллюстрирующая все соответствующие размеры элементов микроструктуры (включая массив опорных столбов и канавки «елочкой»), представлена на дополнительном рисунке 1.
      8. Мягкий выпекайте первый слой при температуре 65 °C в течение 1 минуты, затем при 95 °C в течение 20 минут, чтобы растворитель испарился. Остудить до комнатной температуры.
      9. Экспонируйте второй слой с помощью фотошаблона с рисунком «елочкой». Установите дозу воздействия на 130 мДж/см2.
      10. Выпекайте после выдержки при температуре 65 °C в течение 1 минуты, а затем при 95 °C в течение 6 минут.
      11. После охлаждения с помощью проявителя SU-8 удалите несшитые области и обнажите полную двухслойную микроструктуру.
    2. Подготовка реплики PDMS
      1. Составьте смесь PDMS, соединив преполимер и сшивающий агент в массовом соотношении 10:1. Приготовьте 10-15 мл смеси для одного чипса.
      2. Залейте смесь в мастер-форму и удалите захваченный воздух путем дегазации. Отверждите PDMS, поместив форму в духовку при температуре 95 °C на 30 минут.
      3. Извлеките отвержденную реплику PDMS из формы. Создайте одно входное и одно выходное отверстия с помощью перфоратора PDMS диаметром 1 мм.
    3. Сборка HB-чипа
      1. Установите кислородный плазменный очиститель на мощность 150 Вт на 3 минуты. Активируйте поверхности, обработав реплику PDMS и предварительно склеенный слой PDMS на чистом предметном стекле.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за обилия связей Si-O в полимерных цепях PDMS, плазменная активация обеспечивает ковалентную связь между PDMS и такими подложками, как стекло, кремний, тем самым облегчая герметизацию чипов.
      2. Выровняйте обработанные структуры PDMS и прочно склейте их друг с другом. Убедитесь, что массив опорных столбов и элементы «елочкой» полностью интегрированы со стеклянной подложкой, чтобы завершить создание HB-чипа.
  2. Приготовление иммуномагнитных шариков (IMB)
    1. Инкубировать 25 мкл промытых и ресуспендированных стрептавидин-модифицированных магнитных шариков (SA-MBs) (1 мкм) (≈4 × 108 гранул на мл) с 1 мкг биотинилированного антитела EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток) при комнатной температуре с вращением со скоростью 20 об/мин в течение 40 мин для получения IMB.
    2. После магнитной сепарации на магнитном штативе удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 25 мкл изоляционного буфера (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Работа с изолирующим чипом
    1. Нанесите пипетку на 20 μл магнитной суспензии в течение 1-2 с, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха.
    2. Немедленно поместите чип вертикально на магнит и дайте бусинам осесть в течение 5 минут без помех.
    3. Соберите образец крови (периферической крови или экспериментальных образцов лейкопака) и немедленно наберите 4 мл в шприц, убедившись, что пузырьки воздуха удалены. Загерметизируйте входное и выходное отверстие чипа жидкостью, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вставьте входную и выходную трубки для образца в микросхему.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что при работе с биологическими образцами приняты основные меры индивидуальной защиты.
    4. Образец вводят с помощью шприцевого насоса с расходом 1,5 мл/ч.
    5. После загрузки образца введите 60 мкл D-PBS в HB-чип со скоростью потока 0,2 мл/ч, чтобы смыть несвязанные клетки.
    6. Извлеките магнит и вручную введите 1,5 мл BSA (5% w/v в D-PBS), чтобы промыть чип и освободить захваченные опухолевые клетки из HB-чипа.

2. Метод 2: Микрофлюидная очистка ЦОК

  1. Модификация HB-чипа
    1. Приготовьте (3-меркаптопропиловый) раствор триметоксисилана (ФПТС) в этаноле с объемной долей (v/v) 10%. Немедленно введите 20 мкл раствора MPTS в HB-чип и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
    2. Один раз промыть безводным этанолом и высушить при 100 °C в течение 1 часа.
    3. Готовят раствор N-γ-малеимидобутирилоксисукцинимида (ГМБС) в этаноле в концентрации 0,5 мг/мл. Охладите чип до 37 °C, введите раствор GMBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании MPTS и GMBS всегда надевайте перчатки, лабораторный халат и маску. Эти реагенты обладают токсическими и раздражающими слизистые оболочки свойствами и должны обрабатываться с осторожностью в хорошо проветриваемом помещении.
    4. Промойте два раза ddH2O, а затем два раза прополощите D-PBS.
    5. Немедленно добавить 15 мкг/мл стрептавидина (SA), инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч или в течение ночи при 4 °C.
    6. Промойте два раза с помощью D-PBS.
    7. Приготовьте буфер для антител CD45: 0,2% (по мас./об.) BSA и 20 мкг/мл биотинилированного антитела CD45, разбавленных до объема с помощью D-PBS.
    8. Введите 20 мкл буфера антител CD45 в HB-чип для отрицательного отбора лейкоцитов. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч, затем промыть D-PBS.
    9. Добавьте блокирующий раствор, содержащий 3% (мас./об.) BSA и 0,05% (w/v) Tween-20, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Промойте D-PBS перед загрузкой образца.
  2. Загрузка образцов
    1. Отсадите образец с помощью шприца, убедившись, что пузырьки воздуха удалены. Загерметизируйте входное и выходное отверстие чипа жидкостью, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вставьте входную и выходную трубки для образца в микросхему.
    2. Введите образец с помощью шприцевого насоса и установите скорость потока на 0,6 мл/ч.
    3. Соберите очищенные опухолевые клетки из выходного отверстия для подсчета и секвенирования одиночных клеток.

3. Метод 3: Технология штрихкодирования и секвенирования одиночных клеток на основе микролунок

  1. Подготовка реагентов и материалов
    1. Предварительная обработка стружки
      1. Добавьте 200 мкл 1x D-PBS и 0,5% раствора F-68 на вход чипа.
      2. Выполняйте ультразвуковую обработку на водяной бане, держа чип. Когда пузырьки станут заметны по всей микропористой области, продолжайте ультразвуковую обработку в течение 30 с, чтобы удалить пузырьки из двойных лунок.
    2. Приготовление бисера со штрих-кодом
      1. Тщательно перемешайте стоковый раствор магнитных шариков со штрих-кодом и переложите 200 мкл в центрифужную пробирку. Применяйте магнитную сепарацию до тех пор, пока раствор не прояснит, и выбросьте надосадочную жидкость.
      2. Дважды промойте шарики со штрих-кодом 500 μL TE-TW (10 мМ Tris-HCl pH = 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Tween-20).
      3. Промойте и повторно суспендируйте шарики со штрих-кодом в 200 мкл 20x TE (10 мМ Tris-HCl pH = 7,5, 1 мМ ЭДТА) и 50 мМ растворе DTT, затем положите на лед.
    3. Приготовление одноклеточной суспензии
      1. Перенесите очищенные опухолевые клетки в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при давлении 400 × г в течение 3 минут при комнатной температуре. Промойте и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x D-PBS.
      2. Проведите подсчет клеток и приготовьте соответственно одноклеточную суспензию. Объем загрузки образца должен составлять 200 мкл, всего 80 000 ячеек (400 ячеек/мкл).
    4. Приготовьте буфер для лизиса клеток, который включает 1x физиологический цитрат натрия (SSC), 0,5 М LiCl, 0,6% Triton X-100, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT и 1 ингибитор РНКазы Ед/μл.
  2. Работа с микрофлюидным чипом
    1. Захват ячеек
      1. Введите 200 мкл суспензии опухолевых клеток в чип (60000 двойных лунок), затем встряхните со скоростью 10 об/мин на обесцвечивающем шейкере в течение 5 минут, чтобы клетки могли осесть в захватывающих лунках под действием силы тяжести.
      2. Аккуратно дважды пипетируйте клеточную суспензию в чипе вверх и вниз. Затем поместите чип на обесцвечивающий шейкер со скоростью 10 об/мин на 5 минут, чтобы снова суспендировать незахваченные элементы и дать им снова осесть.
      3. Добавьте 200 мкл 1x D-PBS и 0,5% раствора F-68 через входное отверстие и отсасывайте раствор из выходного отверстия. Повторите два раза, чтобы получить в общей сложности три смывки чипа.
    2. Захват шариков со штрих-кодом
      1. Повторно суспензируйте суспензию шариков со штрих-кодом, затем немедленно введите 200 мкл суспензии в чип через входное отверстие. Встряхивайте при 10 об/мин в течение 20 с.
      2. Осторожно дважды пипетируйте суспензию шариков, затем встряхните при 10 об/мин в течение 20 с. Повторите этот шаг один раз.
      3. Извлеките суспензию со штрих-кодом из выходного отверстия, добавьте 200 мкл 20x TE (pH = 7,5) и 50 мМ раствора DTT, затем извлеките жидкость из выпускного отверстия. Повторите этот шаг дважды, всего получится три стирки.
    3. Лизис клеток и захват мРНК
      1. Медленно добавьте 200 мкл буфера для лизиса клеток в чип через входное отверстие. Сразу после этого медленно добавьте 200 μL минерального масла, чтобы загерметизировать двойные лунки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизация должна произойти немедленно, чтобы предотвратить загрязнение.
      2. Удалите раствор, вытекающий из выпускного отверстия для стружки, в резервуар для отходов. Поместите чипс горизонтально и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 5 минут.
    4. Восстановление бисера со штрих-кодом
      1. После лизиса медленно добавьте 200 мкл 6x SSC через входное отверстие, удалите отработанную жидкость и отсасывайте оставшийся раствор из выходного отверстия чипа.
      2. Медленно добавьте 200 мкл 6x SSC, чтобы заполнить чип. Поднесите магнит близко к поверхности чипа и медленно перемещайте его от входного отверстия к выходному, чтобы собрать шарики со штрих-кодом из захватывающих лунок. Затем быстро отсасывайте раствор, а также шарики со штрих-кодом из чипа в центрифужную трубку с предварительно загруженной 6x SSC.
      3. Промойте три раза 200 мкл 6x SSC, а затем один раз 1x RT буфером (см. Таблицу материалов).
  3. Обратная транскрипция (ОТ), лечение экзонуклеазой I и ПЦР
    1. РТ
      1. Ресуспендируйте гранулы со штрих-кодом в 100 мкл реакционной смеси обратной транскрипции, содержащей 1× RT буфера, 1 мМ GTP, 1 мМ dNTP, 5% PEG 8000, 2,5 мкМ Template Switch Oligo (см. Таблицу материалов), 1 Ед/мкл ингибитора РНКазы и 10 Ед/мкл обратной транскриптазы. Инкубировать раствор при температуре 42 °C в течение 120 минут.
    2. Лечение экзонуклеазами
      1. После обратной транскрипции промойте шарики один раз 200 мкл 1x TE-SDS (10 мМ Tris-HCl pH = 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,5% SDS), один раз 200 мкл 1x TE-TW и один раз 200 мкл 10 мМ Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Повторно суспендируйте шарики в 100 мкл экзонуклеазной смеси, содержащей 1x буфер экзонуклеазы I и 1 ед/мкл экзонуклеазы I, и инкубируйте при 37 °C в течение 45 мин.
    3. Синтез второй цепи
      1. Промойте шарики один раз 200 μл 1x TE-SDS. Ресуспендировать шарики в 200 мкл 0,1 М NaOH и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре с вращением со скоростью 30 об/мин для денатурации гибридного продукта мРНК-кДНК. Затем промойте шарики один раз 200 мкл 1x TE-TW и один раз 200 мкл 10 мМ Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ресуспендируйте гранулы в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 1x RT буфер, 1 мМ dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 мкМ праймера для синтеза второй цепи (см. Таблицу материалов) и 0,125 мкЛ фрагмента Кленоу. Инкубировать раствор при температуре 37 °C в течение 60 минут.
    4. амплификация кДНК
      1. Промойте шарики один раз 200 мкл 1x TE-SDS, один раз 200 мкл 1x TE-TW и один раз 200 мкл 10 мл Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ресуспендируйте гранулы в 150 мкл ПЦР-смеси, включая 1x PCR Reaction Mix и 0,8 мкМ олиго ISPCR (см. Таблицу материалов). Установите программу ПЦР следующим образом: 95 °C в течение 3 мин; четыре цикла при температуре 98 °C в течение 20 с, при 65 °C в течение 30 с и при 72 °C в течение 3 мин; восемь циклов при температуре 98 °C в течение 20 с, при 67 °C в течение 20 с и при 72 °C в течение 3 мин; 72 °C в течение 5 мин.
      3. Дважды очистите продукт ПЦР с помощью магнитных шариков 0,6x твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI) для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя и выведите в 20,5 мкл H2O. Измерьте концентрацию очищенного продукта ПЦР с помощью флуоресцентного количественного анализа ДНК.
      4. Проводят вторую амплификацию очищенного продукта ПЦР с использованием ПЦР-смеси, содержащей 1x реакционную смесь ПЦР и 0,8 мкМ олиго ISPCR (см. Таблицу материалов). Установите программу ПЦР следующим образом: 98 °C в течение 3 мин; пять циклов при температуре 98 °C в течение 20 с, 67 °C в течение 20 с и 72 °C в течение 3 мин; 72 °C в течение 5 мин.
      5. Дважды очистите продукт ПЦР 0,6x магнитными шариками SPRI для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя и выведите 20,5 мкл H2O. Измерьте концентрацию очищенного продукта ПЦР с помощью флуоресцентного количественного анализа ДНК23.
    5. Построение библиотеки кДНК
      1. Соберите библиотеку с помощью стандартного набора для подготовки библиотеки ДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Амплифицируйте библиотеку методом ПЦР с помощью праймерной пары N70X/P5 (см. дополнительную таблицу). Установите программу ПЦР следующим образом: 72 °C в течение 3 мин; 98 °C в течение 30 с; двенадцать циклов при 98 °C в течение 15 с, 58 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 3 мин; 72 °C в течение 5 мин.
      3. Очистите библиотеку с помощью 0,6x магнитных шариков SPRI для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя и выведите в 20 мкл H2O. Измерьте концентрацию очищенного продукта ПЦР с помощью флуоресцентного количественного анализа ДНК.
        Примечание: Как правило, конечная концентрация в библиотеке ДНК ≥ 2 нг/л и общее количество ≥ 50 нг считаетсяприемлемой24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сборка и освобождение интерфейса захвата CTC можно оценить с помощью микроскопии. Равномерное распределение магнитных шариков (МБ) в нижней части микросхемы HB под действием магнитного поля указывает на успешную сборку, в то время как минимальное количество остаточных МБ или их отсутствие подтверждают успешное высвобождение (Рисунок 2C). Этот шаг имеет решающее значение для определения выхода и чистоты захваченных ЦОК. Чтобы проверить эффективность захвата изолирующего чипа CTC, мы провели эксперимент по всплеску. Небольшое количество опухолевых клеток с высокой экспрессией EpCAM (PC3 или LNCaP) было введено в PBS, содержащую большую популяцию клеток Jurkat, которые демонстрируют низкую экспрессию EpCAM, имитируя наличие большого количества клеток крови в циркуляции. Изолирующий чип CTC эффективно захватывает опухолевые клетки из образцов объемом 1 мл и 10 мл, демонстрируя свою высокую пропускную способность и эффективную сортировку CTC (рис. 2D). Для оценки специфичности захвата на основе IMB мы использовали контрольный чип, модифицированный SA-MB, у которых отсутствовала конъюгация антител EpCAM. Отсутствие значимого захвата опухолевых клеток подтвердило специфичность IMB-опосредованного выделения ЦОК (рис. 2D).

Помимо эффективности улавливания, еще одним важным параметром для оценки изоляционных платформ CTC является чистота. Мы сравнили чистоту опухолевых клеток, выделенных с помощью либо захватного чипа, либо только очищающего чипа, а также чистоту, достигнутую за счет последовательного положительного и отрицательного отбора (рис. 2E). Оба чипа значительно улучшили чистоту опухолевых клеток по сравнению с контрольной группой, продемонстрировав свою эффективность в выделении ЦОК. Что еще более важно, совместное использование как положительного, так и отрицательного отбора еще больше повысило чистоту и выход опухолевых клеток по сравнению с использованием одного метода.

Для дальнейшей оценки эффективности чипов захвата и сортировки CTC в клинических условиях мы собрали образцы периферической крови (ПБ) у шести здоровых доноров и провели эксперименты по спайкингу. Учитывая чрезвычайно низкую распространенность ЦОК в клинических образцах, примерно 500-1000 клеток LNCaP были спайзированы в каждые 10 мл образца PB. Количество лейкоцитов во всех собранных образцах ПБ было в пределах нормы (4-10 × 106 клеток/мл). Результаты показали, что система сортировки ЦОК поддерживает высокую эффективность захвата и чистоту опухолевых клеток даже при обработке клинических образцов (рис. 2F-G и дополнительный рис. 2).

figure-results-1
Рисунок 2: Платформа для захвата и очистки CTC со структурой «елочка». (A) Рабочий процесс изолирующего чипа CTC. Во-первых, стабильное магнитное поле и конъюгированные антителами EpCAM IMB собирают интерфейс захвата. Кроме того, вихревое перемешивание в HB-чипе повышает эффективность массообмена между CTC и IMB, облегчая накопленный захват. Наконец, мягкое высвобождение ЦОК достигается за счет удаления магнитного поля. (B) Рабочий процесс очистки чипа CTC. HB-чип модифицируется антителами отрицательного отбора, а вихревое смешивание еще больше облегчает взаимодействие лейкоцитов с антителами, в конечном итоге получая высокоочищенные ЦОК. Масштабная линейка, 100 мкм. (C) Микроскопическая визуализация демонстрирует успешную сборку и высвобождение захватного чипа. (D) Гистограммы сравнивают эффективность захвата CTC с помощью изолирующей платформы для различных объемов проб с использованием нефункционализированных SA-MB в качестве контроля. Погрешности, среднее значение ± SD, n = 3. (E) Столбчатые диаграммы сравнивают чистоту ЦОК, полученных с использованием только одного HB-чипа, с теми, которые подвергаются последовательному захвату и очистке. Контрольная группа представляет чистоту необработанного ТХК. Погрешности, среднее значение ± SD, n=3. (F) Идентификация клеток в изолирующем чипе CTC. Клетки LNCaP окрашивали препаратами Hoechst и Calcein AM, в то время как клетки крови окрашивали только препаратами Hoechst. Масштабная линейка, 100 мкм. (G) Чистота опухолевых клеток и эффективность захвата в экспериментах по спайкингу с использованием 1 мл или 10 мл периферической крови. Погрешности, среднее значение ± SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Впоследствии выделенные опухолевые клетки были подвергнуты высокопроизводительному секвенированию одиночных клеток. Наш протокол включает в себя систему штрихкодирования одной ячейки, состоящую из 60 000 вложенных микролунок (Рисунок 3A-B). Нижние микролунки квадратной формы служат для захвата отдельных ячеек, в то время как верхние микролунки предназначены для загрузки шариков. Каждая нижняя микролунка имеет длину, ширину и высоту 25 мкм, что подходит для большинства типов клеток. Верхние шестиугольные лунки имеют диаметр вписанного круга и высоту 50 мкм для размещения бусин, обычно от 30 до 50 мкм. Система повышает эффективность захвата клеток за счет кумулятивного захвата, избегая при этом дублирования клеток через микролунки исключения размера. Чтобы оптимизировать протокол загрузки ячеек, мы исследовали эффективность захвата ячеек и коэффициент заполнения микролунок при различных условиях входа в ячейку (рис. 3C). Результаты показали, что увеличение ввода клеток не снижает эффективность захвата; скорее, это значительно повысило коэффициент заполняемости. Для чипа захвата на 60 000 лунок коэффициент заполнения микролунок стабилизировался, когда вход в ячейку достиг 80 000, и не показал дальнейшего увеличения при дополнительном вводе. Чтобы свести к минимуму возникновение дублетов из-за чрезмерной нагрузки на ячейки, мы выбрали 80 000 ячеек в качестве оптимального ввода. Как показано на рисунке 3D, одноэлементный чип штрих-кодирования достиг 85,6% заполняемости ячейки и 95,7% заполняемости штрих-кодировки, что привело к коэффициенту сопряжения 81,9%. Кроме того, были выполнены множественные оседания в соответствии с протоколом, что значительно улучшило эффективность захвата и скорость спаривания за счет кумулятивного эффекта захвата (рисунок 3D). Примечательно, что наблюдаемая разница в коэффициентах заполнения между ячейками и бусинами объясняется большей плотностью и массой гранул по сравнению с ячейками, что позволяет им более эффективно оседать в микроямах под действием силы тяжести. Таким образом, при оптимизированных условиях загрузки коэффициент заполняемости сопряжения составляет около 80 %, как правило, считается идеальным.

figure-results-2
Рисунок 3: Высокопроизводительная технология штрихкодирования и секвенирования одиночных клеток на основе микролунок. (A) Рабочий процесс протокола секвенирования по одному CTC. (B) Микроскопия демонстрирует микрофлюидные одноклеточные/штрих-кодированные структуры лунок захвата. Процессы захвата клеток, захвата шариков и извлечения шариков показаны слева направо. Линейная линейка 30 мкм. (C) Линейные графики иллюстрируют эффективность захвата ячеек и коэффициент заполнения микролунок одноэлементного чипа штрих-кодирования (60000 двойных лунок) при различных условиях ввода ячеек. (D) Коэффициенты заполняемости ячеек и шариков со штрих-кодом в оптимизированных условиях ввода клеток, а также соответствующее соотношение сопряжения ячеек и шариков. Левая и правая панели показывают подход к захвату с использованием нескольких попыток установления и только одного установления соответственно. Погрешности, среднее значение ± SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наконец, чтобы проверить интегрированный протокол сортировки CTC и scRNA-seq, мы смешали клетки PC3, LNCaP и Jurkat в предполагаемом соотношении 1:3:4000 и загрузили их в микрофлюидные чипы для захвата опухолевых клеток, очистки и секвенирования одиночных клеток. С помощью эффективной платформы для выделения опухолевых клеток мы получили высокочистые EpCAM-положительные опухолевые клетки (рис. 4B). В то же время, чип scRNA-seq на основе микрофлюидики продемонстрировал возможность точного профилирования клеточного типа, а результаты визуализировались с помощью анализа t-распределенного стохастического встраивания соседей (t-SNE) (рис. 4A). Мы успешно идентифицировали три различные клеточные популяции, каждая из которых может быть различима по уникальным маркерам (рис. 4C). Кроме того, пропорции ячеек на конечном выходе близко совпадали с пропорциями очищенного входа, что подтверждает, что процесс штрихкодирования отдельных клеток был непредвзятым и не содержал загрязнений (рис. 4B). Один кластер был идентифицирован как клетки Jurkat на основе специфической экспрессии TRBC1, IGLL1, CD1E и CD3D (рисунок 4D). Анализ путей обогащения еще раз подтвердил надежность этой классификации (рисунок 4E). Кроме того, две клеточные линии рака предстательной железы были четко разделены на отдельные кластеры в соответствии с дифференциально экспрессируемыми генами (DEG) (рис. 4F-G). Кластер PC3 характеризовался высокой экспрессией микросеминопротеина (MSMP), также известного как PC3-секретируемый микробелок. С другой стороны, кластер LNCaP однозначно экспрессировал маркеры, связанные с клеточной адгезией, пролиферацией и плюрипотентностью, такие как NEDD4, CTNNA1 (α-катенин 1) и RBBP7.

figure-results-3
Рисунок 4: Валидация сортировки CTC и секвенирования одиночных клеток с использованием эксперимента с шипами. (A) График t-SNE, показывающий профилирование типов клеток захваченных и очищенных клеток. (B) Столбчатая диаграмма, отображающая пропорции трех типов клеток на трех стадиях: начальный вход, последующая очистка и окончательный выход секвенирования. (C) Точечная диаграмма, иллюстрирующая экспрессию уникальных маркерных генов в различных клеточных кластерах. (D) Уровни экспрессии TRBC1, IGLL1, CD1E и CD3D во всех клетках. (E) Анализ обогащения путем GO и KEGG дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в кластере Jurkat. (F) Паттерны экспрессии NEDD4 и MSMP во всех клетках. (G) График вулкана, показывающий ДЭГ между кластерами PC3 и LNCaP. Красные точки представляют гены, активированные в PC3; Синие точки обозначают повышенную регуляцию в LNCaP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мастер-миксРеагентОкончательное разбавлениеТип буфера
0,5% Ф-68Ф-680.50%Очищенная вода DEPC
ПБС1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)10 мМОчищенная вода DEPC
ЭДТА1 мМ
Подросток-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)200 мМОчищенная вода DEPC
ЭДТА20 мМ
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)10 мМОчищенная вода DEPC
ЭДТА1 мМ
Паспорт безопасности0.50%

Таблица 1: Состав смеси реагентов для приготовления секвенирования одиночных СТК. На рисунке показаны части реагентов, необходимых для scRNA-seq, которые могут быть приготовлены до начала операции с чипом для обеспечения быстрого и бесперебойного процесса.

Дополнительный рисунок 1: Проектирование для HB-чипа. (А) Принципиальная схема двухслойной микрофлюидной структуры. Верх: Верхний слой со структурой «елочкой». Увеличенная врезка показывает подробную геометрию елочкой, которая ориентирована под углом 45° относительно стенки канала, с шириной канавки 100 мкм и шагом 200 мкм. Дно: Нижний слой, состоящий из массива опорных столбов (28 столбцов × 7 рядов), пронумерованных от #1 до #28 по направлению потока. (Б) Вид сбоку на скол «елочкой». Бороздки «елочкой» имеют ширину 100 мкм. Высота как конструкций «елочкой», так и опорных столбов составляет 50 мкм. (C) Вид сверху на щепку «елочкой». Каждый опорный столб имеет размеры 500 μм в ширину и 1150 μм в длину, с зазором 550 μм между соседними столбами. (D) Фотография изготовленного HB-чипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Репрезентативное изображение, показывающее флуоресцентно окрашенные опухолевые клетки и клетки крови, присутствующие в отработанной жидкости, собранной на выходе изоляционного чипа CTC. Клетки LNCaP окрашивали препаратами Hoechst и Calcein AM, в то время как клетки крови окрашивали только препаратами Hoechst. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица: Олигонуклеотидные последовательности, используемые в обратной транскрипции и подготовке библиотеки Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЦОК служат ценными биомаркерами для диагностики рака, руководства по лечению и исследований инициации, прогрессирования и метастазирования опухоли25. Однако существующие методы выделения ЦОК не позволяют достичь ни высокой эффективности, ни высокой пропускной способности26. Кроме того, низкая эффективность высвобождения ЦОК часто приводит к низкой чистоте и высокому повреждению клеток, что ограничивает их совместимость с последующими анализами27. В данной работе мы предложили интегрированный протокол для высокопроизводительной сортировки CTC и секвенирования по одному CTC, состоящий из трех основных процедур: захват CTC, очистка и scRNA-seq.

Эта платформа на основе микрофлюидики обеспечивает гибкость и масштабируемость. Количество параллельных каналов в HB-чипах, а также захватывающих лунок в чипе штрихкодирования может быть отрегулировано в соответствии с различными требованиями к образцам, что позволяет удовлетворить требования к высокой пропускной способности. В чипе захвата CTC IMB могут быть оптимизированы в соответствии с конкретным типом рака. Например, в образцах от пациентов с раком предстательной железы IMB могут быть функционализированы коктейлем из антител EpCAM и PSMA для повышения эффективности захвата. Кроме того, использование только захвата на основе EpCAM может привести к потере мезенхимальных ЦОК, подвергшихся эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП). Для решения этой проблемы могут быть включены дополнительные антитела против белка теплового шока 70 (HSP-70) или виментина клеточной поверхности (CSV) для захвата ЦОК на различных стадиях EMT.

Поскольку HB-чипы для захвата и очистки CTC основаны на микрофлюидике, во время экспериментов необходимо соблюдать осторожность при обращении. Перед введением реагентов во входное отверстие чипа необходимо удалить все пузырьки воздуха, а как входное, так и выходное отверстия могут быть герметизированы для устранения попадания воздуха. Кроме того, реагенты следует вводить быстро (в течение 1-2 с), так как захваченные пузырьки воздуха могут препятствовать прохождению IMB и ячеек, что значительно снижает эффективность и чистоту улавливания. Кроме того, как упоминалось ранее, равномерное распределение IMB имеет решающее значение для успешного захвата CTC. После загрузки IMB чип должен быть размещен вертикально на магните и зафиксирован на месте не менее чем на пять минут, чтобы изменения магнитного поля не нарушили распределение IMB. При этом скорость потока при загрузке ячеек, указанная в протоколе, должна быть оптимизирована с учетом различных типов образцов. Например, образцы лейкопака демонстрируют повышенный уровень концентрации лейкоцитов и вязкости. Если скорость потока слишком высокая, это может препятствовать эффективному взаимодействию между CTC и IMB, предотвращая накопленный магнитный захват и, таким образом, снижая чистоту CTC. Чтобы оценить эффективность нашей платформы выделения и очистки CTC при обработке клинических образцов крови, мы собрали PB у нескольких здоровых доноров и ввели в образцы небольшое количество клеток LNCaP (примерно 50-100 клеток на мл). Примечательно, что, несмотря на то, что платформа продемонстрировала высокую эффективность захвата и чистоту опухолевых клеток в образцах PB, ее производительность была несколько ниже, чем у образцов клеток на основе PBS (рис. 2D, рис. 2E и рис. 2G). Мы предполагаем, что это расхождение связано с более высокой вязкостью крови и наличием большого количества эритроцитов и тромбоцитов по сравнению с PBS. Таким образом, при работе с клиническими образцами крови для повышения производительности можно рассмотреть такие этапы предварительной обработки, как лизис эритроцитов или экстракция PBMC.

Подобно HB-чипам, одноэлементный чип штрихкодирования на основе микрофлюидики требует осторожного обращения, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Учитывая разнообразие используемых реагентов, некоторые реагенты могут быть предварительно подготовлены перед началом операций с чипом (Таблица 1). При загрузке ячеек и шариков необходим тщательный контроль скорости впрыска для обеспечения равномерного распределения, так как ячейки имеют меньшую плотность, в то время как шарики со штрих-кодом более плотные. Как правило, суспензию ячеек следует добавлять медленно в течение 3 ~ 5 с, после чего следует быстрое добавление суспензии гранул в течение 1 ~ 2 с. После загрузки ячеек и шариков выполните два раунда аспирации и дозирования, затем поместите чип на шейкер, чтобы завершить процесс кумулятивного захвата. Этот шаг имеет решающее значение для улучшения коэффициента заполняемости и коэффициента сопряжения. Во время лизиса клеток используется метод масляной герметизации для изоляции поверхностей микроскважин, предотвращающий перекрестное загрязнение между скважинами. Примечательно, что минеральное масло следует добавлять сразу после лизиса без промедления. После лизиса извлечение шариков со штрих-кодом выполняется путем медленного перемещения магнита от входного отверстия к выходному для обеспечения высокой скорости извлечения шариков. При необходимости этот шаг можно повторить несколько раз. Наконец, восстановленные магнитные шарики в центрифужной пробирке проходят ОТ, синтез второй цепи, амплификацию ПЦР и построение библиотеки, за которыми следует секвенирование нового поколения (NGS).

Эта интегрированная микрофлюидная платформа обладает значительным потенциалом для клинического применения. Повышая эффективность и пропускную способность выделения ЦОК, он увеличивает обнаружение КТК на стадиях с низкой опухолевой нагрузкой, что позволяет создать классификационную модель, связывающую количество ЦОК со стадией опухоли. Это достижение обеспечивает новый подход к диагностике рака, мониторингу лечения, оценке прогноза и прогнозированию рецидивов. Кроме того, транскриптомный анализ ЦОК на отдельных клетках позволяет идентифицировать ключевые молекулярные особенности, включая основные пути генов, сети взаимодействия и гены биомаркеров. Этот анализ дает представление о критических факторах, способствующих раннему метастазированию рака, и раскрывает молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования метастатического поражения, предлагая потенциальные терапевтические мишени для пациентов с рецидивирующим или метастатическим раком. Кроме того, эта платформа обладает широкими возможностями масштабирования. Он может быть адаптирован в соответствии с конкретными аналитическими требованиями и расширен для поддержки мультиомиксного анализа, включая транскриптомику и геномику.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-меркаптопропил) триметоксисилан Сигма Олдрич175617-100GРешение MPTS
20 с лишним раз; SSC BufferSangon BiotechB548109-0200
5 и раз; RT BufferSangon BiotechB610020-0500
Биотинилированное моноклональное антитело CD45eBioscience13-0459-82Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Биотинилированные моноклональные антитела EpCAMeBioscience13-9326-82Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Чип картридж DECODERДинамические биосистемы2203106Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Комплекты реагентов для картриджей DECODERДинамические биосистемы2203206Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Очищенная вода DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Содержит: NaCl 136,89 мм; KCl 2,67 мм; Na2HPO4 8,10 мМ; KH2PO4 1,47 мм. pH=7,2-7,4 
DTTThermo ScientificR0861Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Dynabeads MyOne SA T1Инвитроген65602SA-MB, 1 и MU; m
ЭДТАSangon BiotechB540625-05000,5 М, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixРошKK26012 раза; Смесь реакций ПЦР
Литиево-хлоридный осадочный солн.ИнвитрогенAM94800.2 и микро; m фильтровано
N-и гамма;-малеймидобутирил-оксисукцинимид-эфирThermo Scientific22309Решение GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Кубит 1 и раз; Набор для анализа dsDNA HSThermo ScientificQ33231
Решение SDSSangon BiotechB648118-010010% SDS
СтрептавидинСигма Олдрич189730Хранение при 2°°; C до 8&°; C 
Фоторезист СУ-8MicroChemСУ-8 3050
Набор силиконового эластомера SYLGARD 184Dow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7.5)LEAGENENR00721 моль/л, pH=7,5, без РНазы
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 моль/л, pH=8,0, без рназы
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Набор подготовки библиотеки ДНК TruePrep V2 для Illumina ВазимеTD502Набор для подготовки библиотеки ДНК
Tween-20Sangon BiotechA600560-0500
Чистые бусины ДНК VAHTSВазимеN411Магнитные шарики с твердофазной обратимой иммобилизацией (SPRI) для очистки ДНК

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles