Методическая статья

Совершенствование технологии химерных антигенных рецепторов-внеклеточных везикул (CAR-EV): будущее терапии рака

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапевтическое применение внеклеточных везикул (ВВ) может произвести революцию в лечении рака и доставке лекарств. Полученные из клеток химерного антигена рецептора (CAR) ВВ (CAR-EV), выделенные с помощью ионообменной хроматографии, демонстрируют повышенную грузоподъемность, что значительно повышает их функциональную эффективность. В этом исследовании дополнительно характеризуются CAR-EV для выяснения их биологической активности и терапевтического потенциала.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия CAR значительно продвинула персонализированное лечение нескольких гематологических злокачественных новообразований. В настоящее время семь продуктов CAR-cell одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и шесть — Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) для лечения лимфомы, множественной миеломы и хронического лимфоцитарного лейкоза. Остается ряд проблем и ограничений, наиболее значительными из которых являются синдром высвобождения цитокинов (CRS) и синдром нейротоксичности, ассоциированной с иммунными эффекторными клетками (ICANS). Бесклеточная терапия, такая как CAR-EV, имеет существенные преимущества по сравнению с клеточными аналогами. К ним относятся усиленная инфильтрация опухоли и возможность повторного введения при минимизации рисков CRS, ICANS и других неблагоприятных побочных эффектов. Кроме того, активность CAR-EV может быть настроена путем включения цитотоксических агентов и изменяющих функцию рибонуклеиновых кислот (РНК). В данной статье мы сообщаем о разработке масштабируемой платформы CAR-EV для производства настраиваемых CAR-EV. Эта платформа включает в себя проектирование и предварительную подготовку клеток-продуцентов EV (например, CAR-T и CAR-естественных киллеров (CAR-NK)) клеток), выделение и обогащение CAR-EV с использованием платформы ионообменной хроматографии (IEX) в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP), полностью автоматизированный высокопроизводительный анализ субпопуляций EV и in vitro оценка функциональной цитотоксической активности CAR-EV. Платформа была валидирована с использованием CAR-NK-EV и CAR-T-EV как для гематологических, так и для клеточных линий солидных опухолей. Платформа CAR-EV представляет собой многообещающий подход к быстрой разработке готовых терапевтических CAR-EV, адаптированных к конкретным заболеваниям, с потенциалом снижения неблагоприятных побочных эффектов, связанных с терапией на основе CAR-клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия на основе CAR-клеток была одобрена для лечения гематологических злокачественных новообразований, однако сохраняются значительные трудности и ограничения1. В частности, риски СВК и ICANS остаются критическими факторами при оценке пригодности пациента для терапии CAR, что подчеркивает необходимость постоянного совершенствования стратегий лечения2.

ВВ, полученные из CAR-клеток (CAR-EVs), стали более эффективным и потенциально более безопасным аллогенным терапевтическим вариантом. Такие ВВ обладают рядом преимуществ, включая сниженную иммуногенность, меньший риск СВЦ, улучшенную инфильтрацию опухоли, пригодность для повторного дозирования, потенциал для комбинированной терапии, а такжеэффективные процессы производства и хранения. Биологически полученные ВВ могут быть сконструированы для экспрессии молекул, нацеленных на рак, которые связываются с высоким сродством к специфическим поверхностным рецепторам на раковых клетках. После модификации эти дизайнерские электромобили представляют собой многообещающую стратегию для селективной доставки терапевтического груза с потенциалом минимизации побочных эффектов. Полученные из CAR-клеток, эти вооруженные электромобили демонстрируют улучшенные функциональные свойства, которые обеспечивают более точную и мощную терапевтическую доставку. Присущие им особенности дают множество преимуществ, которые в совокупности способствуют повышению эффективности лечения.

Двумя основными препятствиями на пути эффективного использования электромобилей в клинике являются масштаб и эффективность. Описанные здесь методологии демонстрируют присущую им масштабируемость и легко адаптируются к широкому спектру экспериментальных парадигм. Масштабирование производства электромобилей до производства клинического класса является областью активных разработок, но требует дальнейшей оптимизации для производства достаточного количества материала клинического класса4. Важно отметить, что недавние исследования продемонстрировали многообещающие подходы к повышению эффективности ВВ, такие как предварительное кондиционирование родительских клеток интерлейкинами (например, IL-7, IL-15, IL-21) и генерация ВВ в условиях гипоксии (1-2%O2) 5,6,7.

Целью данного исследования было изучение терапевтического потенциала рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), нацеленных на CAR EVs in vitro, с использованием клеток рака молочной железы MCF-7 и клеток миелоидного лейкоза K562. ВВ выделяли и обогащали из кондиционированных CAR клеточных сред (КМ) с помощью IEX, характеризовали с помощью отслеживания наночастиц и вестерн-блоттинга, а также подвергали функциональным анализам. CAR EV, содержащие эндогенный цитотоксический груз, эффективно индуцировали гибель клеток in vitro. Полученные данные устанавливают возможность масштабируемого целевого производства электромобилей для терапевтических применений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте все живые клетки в сертифицированном шкафу уровня биобезопасности 2 (BSL-2) с использованием соответствующих СИЗ (например, перчаток, лабораторных халатов). Биологически опасные материалы, такие как клеточные гранулы, содержащие живые клетки, должны быть обеззаражены с помощью окончательного 10% раствора гипохлорита натрия (отбеливателя).

1. Клеточная культура и сбор КМ

  1. Культивирование CAR-клеток
    Примечание: Несмотря на то, что лентивирально-трансдуцированные CAR-клетки, используемые в этом исследовании, были переданы на аутсорсинг, протокол остается применимым к CAR-T/NK-клеткам, полученным внутри компании с помощью стандартных методов клеточной инженерии.
    1. Поддерживайте CAR NK/T-клетки в культуре, свободной от ксеносов (питательная среда с добавлением 100 МЕ/мл IL-2) при плотности 0,5-1 x 106/мл, в увлажненной камере при 37 °C (5% CO2, 21%O2). Проводите мониторинг каждые 2-3 дня и ограничьте количество клеток до 3 раз в неделю из-за ограниченного количества проходов.
    2. Подтвердите экспрессию CAR с помощью микроскопии, убедившись, что клетки флуоресцентны (если они правильно помечены). Клетки в здоровых скоплениях указывают на устойчивую культуру клеток CAR.
  2. Коллекция CM
    1. Как только клеточные культуры достигнут 80% конфлюенции, оцените жизнеспособность клеток и определите плотность живых клеток с помощью автоматизированного анализа подсчета клеток Trypan blue.
    2. Центрифугируйте ячейки при 300 × г (комнатной температуры) в течение 5 минут до образования гранулы.
    3. Осторожно соберите надосадочную жидкость и центрифугируйте при 3 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для осветления.
    4. Храните осветленный CM при температуре -80 °C до тех пор, пока он не будет готов к обогащению EV.

2. Изоляция и обогащение электромобилей

Примечание: Следующие методы описывают два подхода к обогащению внеклеточными везикулами (ВВ): метод IEX, разработанный для выделения ВВ для функционального анализа in vitro , и метод захвата панэкзосом с высокой пропускной способностью, оптимизированный для последующих исследований характеристик.

  1. Обогащение функциональных автомобильных электромобилей с помощью IEX
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемные характеристики выражаются в терминах объема колонки (CV), отражающего пропорциональное соотношение между объемами реагента и объемом слоя смолы в хроматографической колонке.
    1. Доведите колонку IEX (подробную информацию об используемой колонке см. в Таблице материалов ) до комнатной температуры (RT), дав ей постоять 15 минут перед использованием. Добавьте 10 CV регенерационного буфера, а затем уравновесьте с помощью изотонического уравновешивающего буфера 10 CV (при pH 7,4) (см. Таблицу материалов для получения подробной информации о буферах).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте пересыхания колонки в течение длительного времени. Всегда держите колонну вертикально.
    2. Разморозьте CM и пропустите через фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,22 мкм.
    3. Добавьте образец в уравновешенную колонку (до 31,2 CV), а затем 10 CV изотонического буфера для промывки (при pH 7,4). Добавьте 2,5 CV гипертонического элюирующего буфера (см. Таблицу материалов) и соберите поток через него, так как это образец элюирования EV.
    4. Выполните замену буфера на элюате EV с использованием имеющихся в продаже ультрафильтрационных центробежных фильтров (отсечка 30 кДа) и изотонического раствора в качестве разбавителя, обеспечивая минимальный коэффициент разбавления 100x. Целевой объем после замены буфера может быть определен пользователем в соответствии со своими экспериментальными параметрами.
    5. Проведите заключительный этап фильтрации с использованием фильтра 0,22 мкм для стерилизации обогащенных EV для функционального анализа in vitro .
    6. Определение распределения, концентрации и выхода CAR-EV по размерам с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA)8,9.
  2. Высокопроизводительная изоляция пан-экзосом EV (с помощью автоматизированной системы очистки, выполненной при комнатной температуре (ОТ)) для характеризации ограниченного или большого массива образцов10,11.
    1. Подготовьте три планшета для глубоких лунок (DW) по 1 мл 1x PBS на лунку.
    2. Создайте «элюирующую» пластину, добавив в каждую лунку 35 μл 1% буфера додецилсульфата натрия (SDS).
    3. Подготовьте «переплетающий» планшет, содержащий 1 мл образца CM и 30 μл гранул захвата панэкзосом EXO-NET на лунку.
    4. Установите следующие настройки на автоматизированной системе изоляции:
      1. Шаг 1: Возьмите наконечник: Убедитесь, что протокол изоляции начинается с того, что инструмент задействует гребень с наконечником на 96 лунок, чтобы обеспечить манипуляции с магнитными шариками на протяжении всего процесса изоляции.
      2. Шаг 2: Убедитесь, что образец CM и магнитные шарики смешиваются в непрерывных условиях низкой скорости в течение 30 минут, чтобы обеспечить эффективный захват EV на магнитных частицах. После смешивания включаются 5 циклов по 30 секунд каждый, чтобы обеспечить захват магнитных шариков.
      3. Шаг 3: Убедитесь, что на каждом из трех этапов мойки используется мягкая смесь с низкой скоростью 30 с для удаления неспецифически связанных загрязнений, сохраняя при этом целостность связанных электромобилей. Как и ранее, этап завершается 5 циклами по 30 с каждый для захвата магнитных шариков.
      4. Шаг 4: Элюирование белка EV (лизис): Убедитесь, что связанные EV лизируются для восстановления белка с помощью двухэтапного процесса. Первоначальное перемешивание в течение 30 с (донное перемешивание) выполняется перед инкубацией в течение 7 мин и 30 с в приостановленном состоянии, при этом положение зонда удерживается над лункой. По истечении этого времени следует еще 30 секунд смешивания и пауза еще на 7 минут и 30 секунд. Наконец, включаются 5 циклов по 30 с каждый.
      5. Шаг 5: На этом этапе убедитесь, что содержание белка находится в буфере, а бусины прикреплены к кончику. После этапа элюирования использованный кончик расчески отбраковывается, завершая протокол.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы Exo-Net Pan-Exosome Capture содержат 0,05% (масса) раствора консерванта. Несмотря на то, что они не классифицируются как опасные в соответствии с правилами Управления по охране труда и здоровья (OSHA), при обращении с ними следует использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), особенно в контексте биожидкостей.

3. Определение характеристик электромобилей с помощью вестерн-блоттинга

ПРИМЕЧАНИЕ: CAR-EV характеризовались вестерн-блоттингом (Гранзим В и Кальнексин) по сравнению с клетками в качестве контроля.

  1. Приготовьте клеточные лизаты, добавив 10 мкл 1x буфера для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) (с ингибиторами протеазы) на 1 ×10 6 клеток. Инкубируйте на льду в течение 30 минут, затем центрифугируйте при 14 000 × г (4°C) в течение 15 минут, чтобы удалить клеточный мусор. EV могут быть лизированы с использованием того же буфера или 1% SDS.
  2. Количественно определите количество белка с помощью анализа бицинхониловой кислоты (ВСА) (или подходящего наноспектрофотометра).
  3. Соберите 4-12% SDS-полиакриламидный гель в аппарате для электрофореза в соответствии с протоколом производителя. Приготовьте лизаты белка с помощью буфера Леммли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гелевые системы могут различаться в зависимости от бренда
  4. Загрузите по 5 г образца в каждую лунку и запустите гели при напряжении 200 В в течение 20 минут.
  5. Выполните западный перенос с использованием мембран из поливинилиденфторида (PVDF), блокируя блоттинг 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 1x Tris-буферизованном физрастворе с 0,1% Tween 20 (1x TBST) после этого.
  6. Блоттинг инкубируют в первичных моноклональных антителах (Гранзим В и Кальнексин, разведение 1 на 500 в растворе 5% БСА в 1х ТБСТ), в стационарном состоянии (без встряхивания) и в течение ночи при 4 °С.
  7. На следующий день промойте блоттинги 3 раза в течение 5 минут каждый 10-15 мл 1x TBST перед инкубацией во вторичном антителе (в зависимости от вида, 1 на 1000 разведение в растворе 5% BSA в 1x TBST в течение 1 часа в режиме РТ). Детектирование полос с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) с изображениями, полученными с помощью цифровой камеры с заряженной связью (ПЗС).

4. Функциональный анализ (через МТС)

Примечание: Цитотоксичность оценивали методом in vitro MTS [(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметофенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий], в котором клетки восстанавливали соединение тетразолия до растворимого цветного формазанового продукта, измеряемого при абсорбции 490 нм. Клетки рака молочной железы MCF-7 и K-562 лечили в течение 3 дней в трех независимых экспериментах с увеличением концентраций (0-500 000 частиц на клетку) CAR-EV.

  1. Засейте 5 000 клеток-реципиентов в лунку (50 мкл/лунка) в 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки. Зарезервируйте одну колонку для пустого носителя (для вычитания фона реагента МТС). Избегайте краевых лунок, заполнив их 200 μл стерильной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адгезивные клетки должны быть покрыты за день до начала лечения, чтобы обеспечить прикрепление клеток к поверхности планшета.
  2. Добавляйте EV в возрастающих количествах (например, 2,5 x 105 и 4,5 x 105, или 0,5, 0,75 и 1 миллион EV на ячейку). Включите контроль: «No EV», 1x PBS «EV buffer» и положительный контроль уничтожения клеток (например, низкомолекулярный ингибитор, специфичный для мишеней, или 0,1% TX-100).
  3. Инкубируйте клетки в увлажненной камере при 37 °C (5%CO2, 21%O2) в течение 2-3 дней.
  4. В назначенное время лечения исследуйте клетки с помощью микроскопии. Добавьте реагент MTS (20 мкл на каждые 100 мкл культуры на лунку). Инкубируйте в течение 1-4 часов, измеряя абсорбцию с помощью планшетного ридера при 490 нм, каждый час.
  5. Вычтите показания поглощения пустой среды для анализа данных. Рассчитайте статистику с помощью t-критерия Стьюдента для сравнения двух групп или одностороннего ANOVA с множественными сравнениями для трех или более групп.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичный рабочий процесс культивирования клеток CAR T/NK с последующей изоляцией EV, определением характеристик и использованием EV в функциональном анализе проиллюстрирован на рисунке 1. Перед обогащением EV и последующей характеристикой (включая анализ отслеживания наночастиц) собирается CM из культивирования CAR T/NK-клеток (включая анализ отслеживания наночастиц), а функциональная активность оценивается с помощью многолуночного анализа MTS (рис. 1).

CAR-клетки, меченные GFP, могут быть визуализированы с помощью микроскопии для подтверждения экспрессии конструкции CAR в культуре. Микроскопия должна проводиться в качестве рутинного этапа до и во время сбора КМ для обеспечения достаточной эффективности трансдукции. Важно накладывать каналы светлого поля и GFP, чтобы улавливать потенциальную автофлуоресценцию при оценке эффективности. Следует отметить, что Т-клетки обладают тенденцией к естественному скоплению (аналогично наблюдается у NK-клеток; данные не показаны), а флуоресценция может четко наблюдаться, когда клетки демонстрируют комковатый фенотип (рис. 2).

После обогащения ВВ ВВ можно охарактеризовать с помощью NTA и западного иммуноблоттинга. Используя NTA, анализ выхода частиц может подтвердить повышенную концентрацию в изолированных EV по сравнению с CM (рис. 3A). Данные вестерн-блоттинга дополнительно подтверждают экспрессию цитолитического маркера гранзима B в клетках CAR и EV, а также отсутствие кальнексина в последних, что подтверждает отсутствие клеточного материала в препаратах. HEK293T клетки включены в CAR-отрицательный контроль (рис. 3В).

Анализ функциональности ЭВ проводили с помощью МТС-анализа для определения жизнеспособности/пролиферативной способности клеток. Влияние CAR-EV, нацеленных на EGFR и HER2, на жизнеспособность и рост клеток рака молочной железы MCF-7 и K562 определяется путем измерения колориметрического реагента MTS при поглощении 490 нм (после удаления фонового сигнала). В этом примере EGFR, нацеленный на CAR-EV, снизил жизнеспособность клеток MCF-7 и K562 на 70% и 40% соответственно. HER-2, нацеленный на CAR-EV, снижает MCF-7 на ~10% (что определено с помощью t-критерия Стьюдента). Учитывая экспериментальную схему, использование непараметрического теста (например, Mann-Whitney U) может дать более надежное понимание в последующих исследованиях (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Поколение CAR-EV, обогащение, определение характеристик электромобиля и функциональное считывание. Принципиальная диаграмма, изображающая типичный рабочий процесс генерации, производства и определения характеристик обогащенных образцов CAR-EV до анализа функциональности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативный микроскопический анализ путем подтверждения экспрессии GFP в CAR-T-клетках, нацеленных на HER2. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием 20-кратного объектива. Белая чешуйчатая линейка представляет собой длину 50 мкм. Т-клетки имеют естественную тенденцию расти группами перед отделением на отдельные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Характеристика CAR-клеток и ВВ. (A) Анализ наноотслеживающих частиц CAR-T CM и обогащенных ВВ. Концентрация частиц ВВ была в 1,6-2,1 раза выше, чем у КМ, при этом концентрация белка была снижена на >80%. Статистически значимые различия были проверены с помощью одностороннего ANOVA и теста множественного сравнения Тьюки; р≤ 0,001, **** р≤ 0,0001. (B) Вестерн-блоттинг трансдуцированных Т-клеток и обогащенных CAR-EV подтвердил наличие цитолитического гранзима B как в клетках CAR, так и в EV, в то время как в HEK293T клетках, не относящихся к CAR, было отмечено его отсутствие. Кальнексин не был обнаружен в CAR-EV, что указывает на низкую контаминацию частицами эндоплазматического ретикулума. Белковая нагрузка на дорожку = 5 мкг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Влияние CAR-EV на жизнеспособность клеток-мишеней (клетки рака молочной железы MCF-7 и клеточная линия хронического миелолейкоза K562). Клетки-мишени обрабатывали однократной дозой 4,5 x 105 и 2,5 x 105 EV на клетку (EGFR или HER2 CARs соответственно) или контролем (буфер EV) в течение 3 дней. (A) CAR-EVs-клетки, нацеленные на EGFR. (B) CAR-EV, нацеленные на HER2. Снижение показателя абсорбции (свидетельствующее об эффективности лечения) наблюдалось в обеих клеточных линиях. Данные представляют собой среднее поглощение ± SD (n = 3), проанализированное с использованием двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента, с p-значениями, указывающими на статистическую значимость; ** стр≤ 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетание доказанной эффективности CAR-терапии с многообещающими преимуществами терапии на основе внеклеточных везикул (EV) может повысить эффективность лечения рака, как было продемонстрировано в исследованиях, нацеленных на рак молочной железы и легких12,13. Терапевтический подход CAR-EV направлен на устранение текущих ограничений CAR-терапии, таких как проблемы с доставкой и связанная с этим токсичность, при этом используя биосовместимость и целевые возможности EV. Интеграция этих методов может способствовать разработке новых терапевтических стратегий для лечения рака, расширяя возможности применения ВВ в клинических условиях. Кроме того, инженерия и обогащение функциональных ВВ обеспечивает более безопасный (путем инкапсуляции цитолитического груза) и более точный метод (т.е. добавление целевых доменов) для доставки терапевтического груза, особенно в сложные места, такие как ядро опухоли, костный мозг и области, защищенные барьерами, такие как гематоэнцефалический барьер или гематоэнцефалический барьер 14,15,16. Несмотря на хорошо зарекомендовавший себя метод обогащения EV с помощью ультрацентрифугирования, остается несколько ограничений. К числу заметных ограничений относятся: масштабируемость, коизоляция примесей и ограниченный выход продукции после производства17. Существует явная потребность в улучшении процессов для создания терапевтических ВВ в больших масштабах.

Это экспериментальное исследование демонстрирует, что IEX является масштабируемым и эффективным методом производства, изоляции и обогащения функциональных CAR-EV с использованием осветленного CM из CAR-экспрессирующих клеток в качестве входных данных. IEX обеспечивает высокую производительность обработки и поддерживает как исследования, так и производство в масштабе cGMP, позволяя контролировать качество на протяжении всего рабочего процесса — от создания электромобиля до тестирования конечного лекарственного продукта18,19. Несмотря на то, что определение характеристик EV имеет важное значение для подтверждения функции, выход может значительно варьироваться из-за различий в объеме образца, входной концентрации и свойствах, специфичных для EV, таких как поверхностный заряд и связывающие свойства. Собственные данные с использованием ячеек MCF-7 показывают средний выход предварительной очистки ~2,85 × 108 частиц/мл, при этом концентрации после очистки обычно варьируются от 3 × 1011 до 1 × 1012 частиц/мл. Эти уровни можно регулировать, изменяя объем ресуспендирования во время замены буфера в соответствии с потребностями ниже по потоку. Учитывая эту вариативность, пользователям настоятельно рекомендуется оптимизировать протокол с помощью CM, соответствующий их экспериментальной установке, чтобы обеспечить воспроизводимый и стабильный выход.

Несколько этапов в рамках протокола имеют решающее значение для успешного производства CAR-EV, с особым акцентом на фазах загрузки и элюирования образца. Эти этапы напрямую влияют на эффективность улавливания EV колонной и, следовательно, на общий выход продукции. Этап замены буфера имеет решающее значение, так как неполное удаление избыточных растворенных веществ может нарушить стабильность электромобиля, что со временем приведет к его деградации. Затем EV можно охарактеризовать с помощью таких методов, как NTA или протеомное профилирование. Если CAR-EV предназначены для функциональных анализов, таких как исследования клеточного поглощения или терапевтические вмешательства, стерильность имеет первостепенное значение. Заключительная стадия стерилизации «терминальной» (0,22 мкм) имеет важное значение для предотвращения микробного загрязнения, которое может исказить результаты экспериментов или создать угрозу биобезопасности. Учитывая эти факторы, пользователям настоятельно рекомендуется проявлять особую осторожность на этих этапах, чтобы сохранить воспроизводимость и функциональную целостность конечного препарата EV.

Для решения распространенных проблем, возникающих при производстве CAR-EV, может потребоваться внести несколько изменений в протокол. Низкий выход продукции чаще всего вызван неоптимальной нагрузкой на КМ, превышающей или отстающей от связующей способности колонны. Для определения оптимального входного объема целесообразно провести исследование титрования КМ, постепенно увеличивая нагрузку для определения точки максимального восстановления EV. Засорение фильтра, обычно наблюдаемое на заключительном этапе стерильной фильтрации, часто является результатом чрезмерной концентрации и вязкости образца, что может способствовать агрегации EV. В таких случаях рекомендуется разбавление финального препарата EV. Если разбавление невозможно, то перед заменой буфера может быть проведена стерильная фильтрация; Однако такой подход требует, чтобы все последующие этапы проводились в строгих асептических условиях для поддержания стерильности.

Разработка ВВ в качестве средства лечения рака требует воспроизводимых производственных процессов и надежной проверки их эффективности против целевых линий раковых клеток. Общим ограничением IEX в обогащении EV является коизоляция частиц, отличных от EV, что является проблемой, которую можно выявить с помощью последующего анализа маркеров, специфичных для EV, и уменьшить за счет дальнейшей оптимизации CM. Определение характеристик ЭВ с контрольным выбросом должно включать: НТА для определения количества и размера частиц, а также концентрацию ЭВ после обогащения; генетический анализ и анализ транскриптов экспрессии CAR-конструктов; определение экспрессии клеточных и EV-белков CAR, канонических биомаркеров EV и цитолитических маркеров (например, гранзима B и перфорина); а также эффекты на цели и за ее пределами. Внедрение дополнительных методов, таких как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), обеспечит морфологическую валидацию в дополнение к характеристике на основе размеров, способствуя более всестороннему анализу. Для поддержания контроля качества продукты EV должны проходить тестирование на микоплазму и загрязнение эндотоксинами, чтобы убедиться в стерильности и пригодности для клинического производства. Использование подходящих составов для длительного хранения функциональных CAR-EV может предложить возможности для повышения их стабильности, включая поддержание качества, количества и терапевтической эффективности. Последовательная оценка функциональных характеристик имеет важное значение для обеспечения целостности продукта. Примечательно, что анализ MTS, используемый в этом исследовании, предлагает косвенную оценку цитотоксичности через измерение метаболической активности. Будущие исследования выиграют от интеграции стандартизированных анализов цитотоксичности, таких как высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ), окрашивание аннексином V/PI или профилирование активации каспаз, для более точного определения цитотоксических эффектов. Кроме того, включение компараторов CAR-клеток (не включенных в настоящее исследование из-за ограниченности источников) отдельно или в комбинации с CAR-EV, а также параллельное лечение контрольных нераковых клеточных линий, может повысить интерпретативную ценность полученных результатов.

Это исследование подчеркивает потенциальное использование электромобилей EGFR/HER2 CAR в качестве жизнеспособной терапевтической стратегии для конкретных видов рака. Повышение эффективности CAR EV может быть достигнуто за счет многократного введения или предварительной активации родительских Т-клеток для усиления цитотоксичности. Более того, достижения в новых подходах, таких как грузы миРНК, и улучшение связывающей способности EGFR/HER2 предоставляют возможности для совершенствования дизайна этих терапевтических платформ20,21. Многообещающее применение двойных химерных антигенных рецепторов (dual-CARs) в клеточной терапии открывает дополнительные возможности для прогресса. Расширение использования двойных CAR за счет использования их аналогов EV в терапии может стать ключевым шагом в расширении их терапевтической сферы и улучшении методов лечения22,23. Мониторинг цитотоксичности раковых клеток, вызванной CAR EV, в режиме реального времени (например, активация каспазы 3/7, считывание импеданса) дает ценную информацию для определения оптимальных режимов дозирования, способствуя упрощенному внедрению в будущие приложения in vivo.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Асари К., Челваретнам К., Мом К.Т., Бхуйян С., Фам К., Фитри А., Пальма С., Шоджаи М., Ханабдали Р., Хинч Л. и Райс Г. являются сотрудниками INOVIQ Ltd.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Сиене Бартон, Хибе Рашид, Саре Никсерешт, Шаялини Вигнараджа и Абелю Судживу за их вклад в работу лаборатории. Авторы выражают признательность всем внутренним и внешним сотрудникам, при этом данное исследование поддерживается и финансируется компанией INOVIQ Ltd.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочные>Материалы
1x фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4Gibco10010049Обогащение электромобилей
1% додецилсульфат натрия (SDS)СигмаЛ3771-100ГРастворите 1 г порошка SDS в 10 мл сверхчистой воды
1x трис буферизованный физиологический раствор с Tween-20 (TBST)Термонаучные химикатыДж77500. К2Разбавьте сверхчистой водой, чтобы получить 1x раствор (в качестве альтернативы приготовьте 0,1% раствор Polysorbate-20/Tween-20 в 1x трис-буферном физрастворе)
96-луночный прозрачный микропланшет с плоским дном, обработанный ТС, стерильныйКорнинг3595In vitro функциональный анализ
Протеиновые гели Bolt Bis-Tris Plus Mini, 4-12%, 1,0 мм, формат WedgeWellИнвитрогенОпределение характеристик ячеек/электромобилей
Бычий сывороточный альбуминСигма-ОлдричА9647-100ГОпределение характеристик ячеек/электромобилей
Антитела к кальнексинуКлеточная сигнализация2433СОпределение характеристик ячеек/электромобилей
Клетки CAR-NK/TБиотехнологии ProMabМеняетсяВнеклеточный лиганд-связывающий домен CAR зависит от предпочтительной мишени на клетках-реципиентах
CellTiter 96 AQueous One Solution Анализ пролиферации клеток (MTS)Компания PromegaГ3580In vitro функциональный анализ
cOmplete, Mini, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАРош11836170001Лизис клеток
Реагент для обнаружения вестерн-блоттинга ECLАмершамRPN2232Определение характеристик ячеек/электромобилей
Элюирующий буферINOVIQОбогащение/изоляция электромобилей
Буфер равновесияINOVIQОбогащение/изоляция электромобилей
Колонка EXO-ACE IEXINOVIQОбогащение/изоляция EV для последующего функционального анализа
Идентификатор патента AU2024901931
Шарики захвата панэкзосом EXO-NETINOVIQИзоляция электромобилей для определения характеристик на последующих этапах потока
Номер патента WO/2014/011673
Антитела к гранзиму ВКлеточная сигнализация4275Определение характеристик ячеек/электромобилей
Ил-2 Ил-2 человека, премиум классМилтеньи Биотек130-097-744Свободная от ксеносов культура T/NK-клеток
Передаточные стеки iBlot 2, PVDFИнвитрогенОпределение характеристик ячеек/электромобилей
ImmunoCult-XF (цГМФ)Технологии стволовых клеток100-0956Свободная от ксеносов культура T/NK-клеток
К-562АТКССКЛ-243In vitro функциональный анализ
МКБ-7АТКСХТБ-22In vitro функциональный анализ
Millex-GP шприцевой фильтрующий блок, 0,22 &; mМерк МиллипорSLGPR33RSФильтрация терминалов
Буфер регенерацииINOVIQОбогащение/изоляция электромобилей
Буфер RIPA (10X)Технология клеточной сигнализации9806Лизис клеток
Раствор трипанового синего, 0,4%Gibco15250061Оценка жизнеспособности и плотности клеток
Буфер для промывкиINOVIQОбогащение/изоляция электромобилей
<сильный>Оборудование
Автоматический счетчик ячеекИнвитрогенГрафиня II FLОценка жизнеспособности и плотности клеток
Настольный автоматизированный вытяжной приборИнвитрогенСистема KingFisher ApexВысокопроизводительная автоматизированная система очистки
Подробности протокола см. по ссылке: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Флуоресцентный микроскопЦейссAxio Observer 7Культура клеток
Анализ отслеживания наночастиц (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Анализ частиц
Считыватель пластинBMG LabtechSPECTROstar NanoIn vitro функциональный анализ
Настольная центрифуга с охлаждениемБекман КоултерAvanti J-15RКлеточные культуры и Обогащение электромобилей
SDS-PAGE мини гелевый бакИнвитрогенА25977Определение характеристик ячеек/электромобилей
Система переноса вестерн-блоттингаИнвитрогенiBlot 2Определение характеристик ячеек/электромобилей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CARGMPCAR EGFRCAR HER2

Похожие статьи