Методическая статья

Использование микроперфузии открытого потока мозга для продольного собрания интерстициальной жидкости в животной модели глиобластомы

DOI:

10.3791/68748

⸱

23 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo межклеточные коммуникации, лежащие в основе многих заболеваний центральной нервной системы, таких как глиобластома (GBM), известны своей сложностью для измерения и характеристики. Здесь мы описываем процедуры микроперфузии открытого потока мозга (cOFM), которые могут использоваться для отбора проб компонентов интерстициальной жидкости в продольной животной модели GBM.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заболевания центральной нервной системы (ЦНС) проявляются через сложную, динамическую сеть межклеточной коммуникации. Глиобластома (GBM), самая распространённая и агрессивная первичная опухоль мозга, является символом этой сложности: её быстрое прогрессирование и мрачный прогноз измеряются месяцами, а не годами. Биология GBM основана на сложном обмене сигнальных молекул между неопластическими и стромовыми клетками, что способствует агрессивному прогрессированию заболевания. Здесь мы описываем подробный протокол микроперфузии открытого потока мозга (cOFM) в моделях мышей GBM, позволяющий проводить продольный мониторинг динамики микроокружения опухолей внутри интерстициальной жидкости (ISF) в реальном времени. Наш подход описывает имплантацию прочных креплений для головок направляющих канюлей, их использование для непосредственной трансплантации внутримозговой глиомы через направляющий, а также сбор высококачественных образцов cOFM для метаболомных и протеомных анализов LC-MS. Ключевым является то, что cOFM преодолевает ограничения молекулярного размера традиционного микродиализа. Помимо GBM, методология cOFM обещает преобразующие знания в спектре расстройств ЦНС, включая нейродегенеративные, эпилептические и нейропсихиатрические состояния, благодаря своей способности предоставлять этиологические и чувствительные к лечению биомаркеры в соответствующих животных моделях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) известно своей сложностью из-за сложной мультимодальной межклеточной сигнализации, опосредованной интерстициальной жидкостью (ISF)1,2,3,4. Эта сложность особенно заметна при опухолях мозга, таких как глиобластома (GBM), где межклеточные сигналы передаются между неопластическими и стромическимиклетками 5,6,7,8,9. Во многих случаях аномальный обмен различными биомолекулами, включая метаболиты и белковые мессенджеры, способствует формированию этиологии патологий ЦНС. Эта исследовательская сложность усугубляется, особенно при GBM, тем, что молекулярный состав ISF является временно динамичным и эволюционирует на протяжении всего заболевания, а также в ответ на интервенционное лечение(10,11).

Традиционные доклинические методы исследования GBM включают in vitro исследования и модели с одним конечным видом животных. Характер этих подходов ограничивает их более широкое клиническое применение из-за неспособности охватить как характеристики микросреды опухоли, так и продольные временные изменения. Достижения, достигнутые в начале 1980-х годов, преодолели эти контекстуальные ограничения благодаря развитию внутримозгового микродиализа (cMD)12,13,14,15. С момента своего основания 45 лет назад cMD зарекомендовал себя как стандартный метод продольного отбора пробы интерстициальной жидкости (ISF) в живоммозге. Это достигается путем свободной диффузии и конвекции высококонцентрационных растворённых веществ ISF через полупроницаемую мембрану в непрерывно текущий перфузат с низкой концентрацией растворённых веществ, обычно искусственную спинномозговую жидкость (aCSF)17. Эти полупроницаемые мембраны состоят из различных биосовместимых полимеров с общими порогами молекулярного размера пор от 20 кДа до 3MDa18. Эта минимально инвазивная процедура позволяет продольно собирать in situ разнообразный спектр аналитов — от мелких молекул, таких как метаболиты или нейромедиаторы, до крупных белков, таких как антитела. Однако структурная пористость мембран cMD в сочетании с адсорбционной природой их составных полимеров может существенно влиять на относительное восстановление аналитов с определёнными биохимическими или размерными характеристиками, такими как липиды или антитела соответственно19,20.

Достижения по преодолению этого ограничения мембран cMD начались в начале 2010-х годов с разработки микроперфузии открытого потока мозга (cOFM)21. Функционируя по схожим общим принципам, что и cMD, cOFM устраняет биохимические ограничения, наложенные полупроницаемыми мембранами, заменяя их на пластиковый решётчатый зонд с макроскопическими отверстиями с низкой адсорбцией примерно 100 мкмразмером 20. Множество отчётов показали улучшенную полезность cOFM по сравнению с cMD благодаря сбору обнаруживаемых компонентов ISF, включая пептидные гормоны, нанотела/антитела, мелкие липофильные терапевтические средства и PEGилированныелипосомы 19,22,23,24,25. Предыдущие отчёты, изучающие реакцию физиологической ткани на имплантацию cOFM-направляющего зонда, показывают, что целостность гематоэнцефалического барьера восстанавливается через 15 дней после имплантации, а глиальные рубцы не образуются до 30 дней послеимплантации 26 дней. Благодаря замене мембран микродиализа на макроскопические отверстия исследователи также продемонстрировали инновационную способность направляющих зондов cOFM облегчать введение ксенотрансплантированных глиомных клеток в мозг иммунодефицитных крыс, так что атравматическое приживание и рост опухоли происходит непосредственно вокруг зоны отбораcOFM 27.

При использовании cOFM при изучении патологий ЦНС необходимо учитывать его методологические ограничения. Из-за зависимости от пассивной диффузии и конвекции анализируемых ISF в текущий перфусат, эти ограничения связаны с концентрацией анализируемого вещества и объёмомобразца 18. Отобранные компоненты ISF будут разбавлены внутри собранного перфусата cOFM по сравнению с эндогенными уровнями, что привело к сравнению относительных соотношений анализируемых веществ междуэкспериментальными условиями 28. Типичные расходы варьируются от 0,1 мкл/мин до 1,0 мкл/мин, что эквивалентно всего 6–60 мкл/ч. При учете времени зачистки в мёртвом пространстве труб также следует учитывать общую продолжительность отбора проб. Это особенно важно при проведении сбора cOFM у анестезированных животных, где необходимо тщательно решать вопросы благополучия животных. Более подробное описание этих и других аспектов доступно в предыдущем отчёте по методам команды разработчиковcOFM 29.

В этой рукописи мы предлагаем обновлённый протокол применения продольного cOFM-отбора в изучении неврологических заболеваний с акцентом на GBM. Протокол включает этапы имплантации канюли с помощью cOFM, инъекции опухолевых клеток и приживки через cOFM-гид, а также две конфигурации отбора cOFM у бодрствующих, свободно движущихся животных. Мы представляем репрезентативные данные, показывающие влияние лечения на метаболомные и протеомные компоненты ISF, измеряемые с помощью cOFM, влияние конфигурации выборки на концентрацию анализируемых веществ и эффективность имплантации опухолевых клеток, управляемых cOFM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными, предусмотренные этим протоколом, одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Северо-Западном университете (идентификатор протокола: IS00021383) и соответствуют Руководящим принципам Национальных институтов здравоохранения (NIH). Этот протокол был разработан для использования у мышей C57BL/6J, как самцов, так и самок, с минимальным возрастом 8-10 недель. Клеточная линия глиомы мышей, используемая в этом протоколе, CT2A, была предоставлена лабораторией Сейфрида Бостонского университета и была выращена и подготовлена с учётом стерильных условий культуры тканей.

1. Хирургическое планирование и подготовка

  1. Информация о животных: Для экспериментов cOFM используйте мышей не менее 8-10 недель для полного роста и развития. Импланты с фиксированным положением черепа могут сдвинуть или нарушить правильный рост ещё развивающегося черепа и/или мозга.
  2. Хирургический выбор координат: используйте атлас мозга животных для определения ортогональных координат интересующей области относительно Bregma. Например, имплантация глиомных клеток обычно проводится в стриатум для наилучшего воспроизведения нативных микроокружений GBM и максимизации последующего развития опухоли. Координаты направляющей имплантации cOFM, используемые в этом протоколе: медилатеральная (ML) = 2,5 мм, переднезадняя (AP) = 0 мм и дорсовентральная (DV) = 3,5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стереотактические координаты могут различаться в зависимости от линии мыши и возраста. Пожалуйста, используйте атласные координаты, специфичные для видов и штамов, чтобы обеспечить желаемое размещение проводника cOFM.
  3. Выбор подходящих конфигураций компонентов cOFM: Заказывайте компоненты для соответствующих конфигураций cOFM с определённой общей длиной от 2 мм до 22 мм, с открытой поверхностью от 1 мм до 2 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут смещать неправильно имплантированные cOFM-направляющие крепления на голову во время выполнения процедур груминга. Чтобы минимизировать механическое давление на крепление головы во время этой работы, мы рекомендуем использовать направляющие не длиннее 2–3 мм дальше предполагаемого расстояния координат DV.
  4. Планирование временных точек хирургических и выборочных процедур для экспериментальных целей: в зависимости от интересующего заболевания и характеристик модели, тщательно планируйте время и порядок процедур, связанных с cOFM, чтобы оптимально изучить соответствующую биологию.
    1. Если вы изучаете различия в составе ISF между здоровыми микроокружениями мозга и опухоли, проведите процедуры отбора cOFM до и после имплантации опухоли в одном и том же животном.
    2. Если вы исследуете влияние клинических вмешательств на патологии ЦНС, проводите процедуры отбора проб cOFM до и после введения в параллельных когортах животных, получающих либо контрольное, либо экспериментальное лечение.

2. Операция по размещению с помощью cOFM

  1. Соберите хирургические инструменты для операции по установке cOFM ( таблица материалов) и стерилизуйте с помощью автоклава, если это необходимо.
  2. Подготовка к хирургическому рабочему месту:
    1. Дезинфекция биозащитного шкафа: Проводите хирургические процедуры в правильно дезинфицированном шкафу для биобезопасности. Активируйте поток воздуха в биобезопасном шкафе и очистите внутренние поверхности с помощью одобренного институционально дезинфицирующего средства и метода протирки. Выстилите нижнюю поверхность шкафа стерильными шторами.
    2. Подготовьте стереотактические приборы: очистите стереотаксическую раму дезинфицирующим средством и поместите её в шкаф с биобезопасностью. Аналогично, очистите и продезинфицируйте стереотаксический дрель и держатель направляющего и поместите их в биозащитный шкаф.
    3. Грелка хирургической стадии: используйте грелку на стереотаксической хирургической стадии для дополнительного тепла во время анестезии. Очистите и продезинфицируйте поверхность грелки и разместите её на стереотаксическом каркасе, где будет находиться животное. Включите грелку на слабый огонь и положите сверху 1-2 стерильных шторы.
    4. Разместить дополнительные хирургические инструменты и оборудование: Асептически разместить дополнительное стерилизованное оборудование в шкаф биобезопасности.
    5. Установка клетки для восстановления: Поставьте чистую клетку для восстановления на грелку, установленную на минимальную температуру. Каждое животное должно быть помещено в отдельную клетку до полного восстановления, поэтому общее количество клеток будет зависеть от результатов операции и времени восстановления.
  3. Предоперационные препараты для животных (краткое изложение на рисунке 1A):
    1. Анестезия: Вводите одобренные анестезиологические соединения и дозировки для достижения подходящей глубины анестезии, используя тест на рефлекс лапы, а также глубину/частоту дыхания для обеспечения достаточной анестезии. Например, внутрибрюшинная инъекция коктейля кетамина и ксилазина (100 мг/кг - 10 мг/кг, в физиологическом растворе) достаточна для достижения нужной глубины анестезии у мышей C57BL/6J.
    2. Обезболивание: Вводите одобренные институционально обезболивающие соединения для улучшения обезболивания во время перед и после операции. Например, подкожная инъекция мелоксикама (20 мг/кг, в физиологическом растворе) подходит для контроля боли в периоперационном состоянии.
    3. Удаление волос (бритье, депиляционный крем): удаляйте волосы с предполагаемого места операции на вершине черепа с помощью электробритвы и/или депиляционного крема. При использовании депиляционного крема убедитесь, что он не оставляется на коже слишком долго, чтобы избежать раздражения.
    4. Офтальмологическая мазь: используйте стерильный апликатор с ватным наконечником, чтобы аккуратно нанести глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время операции.
    5. Размещение животного в стереотаксической рамке: правильно поместите животное в стереотаксическую рамку, вставив резцы в блок укуса, плотно, но аккуратно вставьте ушные пруты в слуховые проходы и закрепите носовой зажим на носовой кости ( рисунок 1B). При правильном положении череп животного должен быть плотно закреплён без какого-либо движения.
    6. Асептические хирургические препараты: Протрите кожу вокруг хирургической области тремя чередующимися тампонами спирта (этил или изопропил-) и повидон йода для асептической дезинфекции места для разреза.
  4. Подготовка к разрезу и поверхности черепа:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны выполняться максимально асептично. Для этого основной ветеринар должен надеть стерильные хирургические перчатки вместо стандартных лабораторных перчаток перед продолжением разреза.
    1. Расположение и длина разреза: используйте стерильный скальпель для создания сагиттального среднего разреза вдоль поверхности черепа, начиная между глазами и простираясь хвостово на 8–10 мм ( рисунок 1C).
    2. Втягивание кожи: используйте стерильные щипцы, аппликаторы с хлопковыми наконечниками и/или лезвие скальпеля для бокового оттягивания кожи от среднего разреза. Убедитесь, что и Bregma, и Lambda видны, а если нет — удлините разрез.
    3. Разрез надкостника: Используйте стерильный скальпель для разреза в надственном скальпеле и латерально втягивайте ткань щипцем.
    4. Тампон с перекисью водорода: очистите поверхность черепа разбавленной перекисью водорода 1%–3%, нанесенной стерильным аппликатором с хлопковым наконечником ( рисунок 1D). Это также помогает идентифицировать Брегму и Лямбда через сагиттальные, корональные и ламбдовидные черепные швы.
    5. Самотравящийся зубной клей: используйте инсулиновый шприц размером 0,3–1,0 мл, чтобы равномерно нанести 20-40 мкл самотравляющегося зубного клея на поверхность черепа ( см. рисунок 1D). Примените светильник для окрепления зубов для облегчения травления. После высыхания используйте стерильные аппликаторы с хлопковыми наконечниками и физиологическим раствором, чтобы стереть лишний клей.
      ВНИМАНИЕ: Самотравящиеся зубные клеи, такие как Bond Force, являются потенциально опасными веществами: воспламеняющаяся опасность (GHS02: H225), опасность для здоровья (GHS07 и GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) и экологическая опасность (GHS09: H412). Пожалуйста, следуйте местным и институциональным рекомендациям по правильной утилизации опасных отходов.
  5. Поиск и сверление отверстий для жорнов:
    1. Вставьте стерилизованное сверло толщиной 0,7 мм в микродрель и установите его в стереотактическую раму с соответствующим держателем.
    2. Определите Брегму на пересечении сагиттального и коронального швов и используйте стереотактические микроманипуляторы для размещения сверла там.
    3. Переместите сверло на координату направляющего cOFM (ML = 2.5, AP = 0.0), включите бур до 15 000 об/мин и аккуратно просверлите отверстие для заусен, регулируя диск микроманипулятора DV (рисунок 1E). Часто наблюдайте толщину черепа во время сверления, чтобы предотвратить повреждение подлежащего мозга. Используйте физиологический физиологический раствор во время сверления, чтобы промыть костные остатки и уменьшить тепло между сверлом и черепом.
    4. Повторите процедуру сверления для каждой координаты анкерного винта (рисунок 1E). Рекомендуемые расположения анкерных винтов: ML = 2,5, AP = -2,5, ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. После просверления отверстий отверстия отсоедините микродрель и держатель сверла от стереотаксической рамы.
    6. Используйте иглу на 30 G, чтобы аккуратно проколоть твердую орудость под отверстием для направляющего жерна cOFM.
  6. Установите анкерные винты с помощью пары стерильных щипцов и стерильной отвёртки подходящего размера (рисунок 1F). В зависимости от шага резьбы винта, крепление крепления достаточно, если винт вставляется на глубину от одной до двух длин резьбы. Будьте осторожны, чтобы не вбить анкерные винты слишком глубоко, чтобы избежать повреждения коры.
  7. Установите направляющую cOFM и фиктивную сборку cOFM в держатель направляющей и крепление на стереотактическую раму. Разместите наконечник направляющего cOFM над отверстием для заусенцев (ML = 2,5 мм, AP = 0,0 мм) на уровне DV, равной высоте Bregma, и медленно опустите направляющую cOFM через отверстие для заусенцев на соответствующую заранее заданную глубину со скоростью 1 мм/мин ( см. рисунок 1F). Например, глубина размещения cOFM при предполагаемой имплантации опухолевых клеток составляет DV = -3,5 мм.
  8. Нанесите цементирующее средство на поверхность черепа, убедившись, что оно покрывает участки под и вокруг направляющих и анкерных винтов cOFM тонким, равномерным слоем. Используйте светильник для затвердевания каждого слоя цементирующего агента перед нанесением следующих слоёв ( рисунок 1G). Продолжайте наносить цементный агент, пока поверхность черепа между каждым компонентом не будет покрыта, анкерные винты полностью закрыты, а область под направляющей cOFM до и вокруг канавки не будет покрыта. Будьте осторожны, чтобы не размещать цементный агент на или рядом с фиксирующим клином.
    ВНИМАНИЕ: Цементирующие агенты, такие как Tetric EvoFlow, представляют потенциально опасные вещества: опасные для здоровья (GHS07: H317, H319, H335, H360). Пожалуйста, следуйте местным и институциональным рекомендациям по правильной утилизации опасных отходов.
  9. Отсоедините держатель направляющей от направляющей cOFM и медленно поднимите держатель направляющей с помощью ручки регулировки DV микроманипулятора. Удалите микроманипулятор из стереотактической рамки.
  10. Отсоедините животное от стереотаксической рамы, сначала ослабив и убрав ушные перекладины, ослабив и убрав носовой зажим, затем подняв резцы животного с блока укуса.
  11. Зашвите кожу над зубным цементующим агентом, обеспечивая открытость направляющего тела cOFM. Рекомендуются всыпающиеся швы 4-0, такие как полигликолевая кислота (PGA) или полиглактин (викрил) (рисунок 1H).
  12. Нанесите тройную антибиотиковую мазь на кожу рядом с исходным разрезом.
  13. Восстановление и поддержка животных:
    1. Переместите животное в изолированную клетку для восстановления (по одному животному в клетке) и дайте дополнительное тепло от грелки, установленной на низкий режим.
    2. Опционально: Дайте животному средство для реверсации анестетика для ускорения восстановления. Например, подкожные инъекции атипамезола (1 мг/кг, в физиологическом физиологическом растворе) ускоряют восстановление после анестезии примерно с 1 часа до примерно 20 минут.
    3. Обеспечивать постоянное наблюдение и поддержку до тех пор, пока животное не придёт в сознание и не придёт в грудное положение. Не оставляйте животных без присмотра, пока они полностью не восстановятся после операции и анестезии.
    4. После полного выздоровления животное может быть возвращено в общие клетки вместе с другими животными.
    5. На следующий день после операции окажите дополнительную обезболивающую поддержку, введя одобренный институционально обезболивающий, например мелоксикам (см. шаг 2.3.2).
  14. Выделите 14-дневное восстановление после операции по имплантации cOFM, чтобы обеспечить полное заживание гематоэнцефалического барьера перед проведением дополнительных процедур на животных.

3. Имплантация внутричерепных опухолевых клеток с помощью cOFM гида

  1. Культивирование и подготовка клеток:
    1. Культивировать и расширять клетки согласно протоколам, специфичным для типа клетки. Например, сингенные клетки глиомы мышей, такие как CT2A, могут выращивать в 10-сантиметровых чашах или термофляжках T-75, содержащих DMEM с 10% плодовой сывороткой (FBS) и 1% добавками пенициллина/стрептомицина.
    2. Подготовьте культивированные клетки к имплантации согласно протоколам, специфичным для типа клетки.
      1. Например, с помощью сингенных глиомных клеток CT2A удалять среду роста, кратковременно промывать с помощью PBS и инкубировать клетки в течение 5 минут с трипсином 0,05% (с EDTA 0,53 мм) при 37 °C.
      2. Нейтрализуйте трипсин с равным объёмом 1% DMEM, содержащим FBS, перенесите клетки в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугайте при 300 x г в течение 5 минут при 4 °C в гранулированные клетки.
      3. Удалите супернатант и ресуспензуйте клеточную гранулу в 1 мл PBS (физиологического физиологического раствора). Определите общее количество клеток на мл с помощью ручного или автоматического гемоцитометра. Центрифугуйте суспензию клетки при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C, затем удалите супернатант и снова суспензуйте в соответствующем объеме PBS (или физиологического раствора) для достижения 50 000 клеток на мкл. Поместите суспензию клетки на лёд до готовности к имплантации (шаг 3.5.2).
  2. Собрать хирургические инструменты для операции по имплантации внутричерепных опухолевых клеток (таблица материалов) и стерилизовать с помощью автоклава при необходимости.
  3. Подготовка хирургического рабочего пространства
    1. Дезинфекция биобезопасности: см. шаг 2.2.1.
    2. Подготовьте стереотактические приборы: очистите стереотактическую раму дезинфицирующими средствами и уберите её в шкаф с биобезопасностью. Аналогично, очистите и продезинфицируйте держатель для шприца, установленный на стереотаксическом месте, и прикрепите его к стереотактической рамке.
    3. Выполните шаги 2.2.3.–2.2.5. для оставшихся подготовительных этапов.
  4. Препараты для животных до операции:
    1. Выполните шаги 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4., и 2.3.5. для подготовки животных.
  5. Имплантация опухолевых клеток:
    1. Сборка шприца и инфузионной вставки (краткое изложение на рисунке 2)
      1. Замочите разъёмы трубок с фланцами в 70% этанола минимум на 5 минут.
      2. Вставьте кончик стерилизованного газонепроницаемого стеклянного шприца объёмом 10 мкл или 25 мкл в один конец разъёма фланцевой трубки.
      3. Вставьте вход инфузионной вставки cOFM в другой конец разъёма трубки.
      4. Закрепите вставку для инфузии шприца в держатель, установленный на стереотаксическом уровне.
    2. Загрузите вставку для инфузии шприца соответствующим объёмом суспензии клеток. Например, загрузите 3 мкл клеточной суспензии при 50 000 клеток на мкл, что в сумме даёт 150 000 клеток на животное.
    3. Замена манекенной вставки на инфузионную вставку:
      1. Используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей cOFM и мукетной конструкции, затем аккуратно вынимите манекен cOFM из направляющей.
      2. Используйте ручки регулировки ML и AP на микроманипуляторе, чтобы переместить вставку для инфузии шприца над направляющей cOFM. Используйте ручку регулировки DV, чтобы аккуратно опустить инфузионную вставку в направляющую cOFM и закрепить её, плотно вставив запирающий клин щипцем.
    4. Введите 3 мкл клеточной суспензии из шприца со скоростью 1 мкл/мин. Внимательно осмотрите область вокруг направляющей cOFM и инфузионной вставки, чтобы из сборки не выходило суспензия клеток. После того как весь объём будет введен, подождите ещё 1 минуту, чтобы внутричерепное давление уравновесилось.
    5. Замените инфузионную вставку на фиктивную вставку.
      1. Используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей cOFM и инфузионной вставки, затем аккуратно отрегулировать ручку регулировки DV микроманипулятора, чтобы вынуть инфузионную вставку cOFM из направляющей.
      2. Поставьте манекен cOFM в направляющую и закрепите его, вставив запирающий клин щипцем.
  6. Отсоедините животное от стереотаксической рамы, сначала ослабив и убрав ушные перекладины, ослабив и убрав носовой зажим, затем подняв резцы животного с блока укуса.
  7. Восстановление и поддержка животных:
    1. Переместите животное в изолированную клетку для восстановления (по одному животному в клетке) и дайте дополнительное тепло от грелки, установленной на низкий режим.
    2. Необязательно: Дайте животному средство для обратного обращения анестетика (например, атипамезол) для ускорения восстановления, см. шаг 2.13.2.
    3. Обеспечивать постоянное наблюдение и поддержку до тех пор, пока животное не придёт в сознание и не придёт в грудное положение. Не оставляйте животных без присмотра, пока они полностью не восстановятся после операции и анестезии.
    4. После полного выздоровления животное может быть возвращено в общие клетки вместе с другими животными.
    5. На следующий день после операции окажите дополнительную обезболивающую поддержку, введя одобренный институционально обезболивающий, например мелоксикам (см. шаг 2.3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании люциферазово-положительных клеточных линий можно провести биолюминесцентную визуализацию (BLI) через 1–2 недели после имплантации клетки для подтверждения успеха прищепления опухоли. Хотя физические характеристики, такие как шерсть животного или наличие на голове, могут препятствовать обнаружению люминесценции, её всё же можно использовать для приблизительных оценок наличия или отсутствия опухоли. Альтернативно, МРТ можно выполнить, если анкерные винты, используемые в установке направляющей cOFM, не являются ферромагнитными и совместимыми с МРТ.

4. cOFM отбор пробы мозговой интерстициальной жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая зависимость от пассивной диффузии анализа, образцы cOFM содержат концентрации разбавленных анализов по сравнению с эндогенной средой ISF. В связи с этим ранее было предложено несколько методов калибровки измерений образцов с целью лучшего отражения концентраций in situ 18. В этом разделе описываются два различных метода выборки. Шаг 4.1. описывает режим конфигурации, рекомендованный производителем (далее — фракционированный), который обеспечивает большую временную чувствительность, но за счёт концентрации анализируемых веществ. Шаг 4.2. Подробно описывается альтернативный способ конфигурации, который мы разработали (далее — рециркулированный), который может достигать большей концентрации анализируемых веществ за счёт снижения временного разрешения.

  1. Фракционированное cOFM отбор проб (краткое изложение на рисунке 3A):
    1. Замочите соединители с фланцами в 70% этаноле не менее 5 минут, чтобы облегчить крепление к трубке и вставкам для отбора проб.
    2. Загрузите в мешок с перфусатом достаточное количество перфусата aCSF. Например, 680 мкл минимум достаточно как для 20-минутной промывки по линии при 10 мкл/мин, так и для 8-часовой пробы при 1 мкл/мин. Однако рекомендуется использовать минимальный объём 2 мл, чтобы предотвратить сложение и неисправность перфузатного пакета.
    3. Предварительно заполняйте обе трубки для толкания и вытягивания соответствующим объёмом ЦСФ с помощью герметичных стеклянных шприцев. Например, универсальная трубка с низким содержанием с толкающим движением имеет внутренний диаметр 0,25 мм и длину отдельных труб 100 см. Это примерно соответствует 1 мкл на 2 см, то есть примерно 55 мкл в толкающей трубе и 100 мкл в тяговой трубе.
    4. Правильно установить перистальтическую часть трубки в головку насоса микроперфузионного насоса, как показано на рисунке 3A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите инструкцию по инструкции BASi для дополнительных инструкций, если это необходимо.
    5. Подключите мешок с перфузией к толкающей секции трубы с помощью разъёма Luer lock (рисунок 3A, компонент i).
    6. Соедините вставку для отбора проб к линиям труб с помощью фланцевых соединителей. Вход для отбора пробных вставок (длинная длина вала) должен быть прикреплён к выходному концу толкающей трубки, напротив линии трубки мешка с перфузией (рисунок 3A, вверху слева). Выход вставки для отбора проб (более короткий вал) должен быть прикреплён к входному концу трубки, параллельно линии трубки мешка с перфузией (рисунок 3A, вверху справа). Поместите подключённую вставку для отбора проб в стерильную микроцентрифугную трубку с 750 мкл aCSF в подготовке к промыву системы.
    7. Соедините стрелку сборщика фракции с помощью фланцевого разъёма трубки к выходной линии для трубки (противоположный конец от выхода вставки для отбора).
    8. Проведите промывку трубок в течение 20 минут при 10 мкл/мин, чтобы удалить задержанные газовые пузырьки внутри трубки.
    9. Настройка сборщика дробей:
      1. Маркировать и взвесить пробирки для сбора фракции, аннотировать каждый вес для последующего сравнения и валидации объема собранных образцов. Вставьте трубки в соответствующие отрезы карусели с коллектором фракций.
      2. Включите сборщик дробей и настройте настройки на нужные значения. Примеры настроек включают # сэмпла, время сэмпла (m), задержку (часы), охлаждение холодильника и режим _cannula.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отброс объёма жидкости в мёртвом пространстве в трубке, который никогда не контактировал с ортотопным ISF, приближается по i) длине и объёму трубки (примерно 2 см/мкл для OFM-PP2-100-LB), ii) расходу и iii) задержке (часах). Эти параметры следует тщательно учитывать при создании системы сбора для обеспечения правильного сбора фракций.
  2. Рециркулированная выборка cOFM (краткое изложение на рисунке 3B):
    1. Замочите соединители трубок с фланцами в 70% этаноле для облегчения крепления к трубкам и вставкам для отбора проб.
    2. Предварительно наполните трубку с соответствующим объёмом циркулярной жидкости с помощью газонепроницаемых стеклянных шприцев.
    3. Правильно установите перистальтическую часть трубки в головку насоса микроперфузионного насоса.
    4. Соедините вставку для отбора проб к линиям труб с помощью фланцевых соединителей. Вход для отбора пробных вставок (длинная длина вала) должен быть прикреплён к выходному концу тяговой трубки. Выход для отбора пробных вставок (более короткий вал) должен быть прикреплен к входному концу тяговой трубки. Поместите подключённую вставку для отбора проб в стерильную микроцентрифугную трубку с 750 мкл aCSF в подготовке к промыву системы.
    5. Проведите промывку трубок в течение 20 минут при 10 мкл/мин, чтобы удалить задержанные газовые пузырьки внутри трубки.
  3. Система вращающейся клетки:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вращающиеся системы клеток животных, такие как система Raturn, способствуют отбору пробуждения cOFM животных, предотвращая гиперскруто и запутывание трубок push and pull. Это также помогает автоматизировать cOFM-отбор, исключая необходимость ручного распутывания трубок во время бодрствующих сессий сбора cOFM.
    1. Равномерно расставьте чистую подстилку клетки по вращающемуся полу и оснасите её легко доступными источниками пищи и воды.
    2. Включите контроллер вращения клетки и проверьте его активность, повернув подвешенный трос. Клетка должна вращаться в противоположную сторону относительно направления вращения, заданного на трос. Установите контроллер вращения в режим ожидания, пока животное не будет прикреплено к тросу.
  4. Подключение животного к системе cOFM:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение и отделение животных от системы cOFM наиболее легко выполняются во время временной анестезии изофлурана. При правильном выполнении этот процесс занимает не более 5 минут на животное; однако настоятельно рекомендуется использовать офтальмологическую мазь.
    1. Анестезия для животных: поместить животное в камеру для индукционной анестезии изофлураном. Начинайте анестезию с кислородным потоком 2 л/мин и изофлураном, установленным на 3%. Наблюдайте за животным, пока оно не достигнет подходящего уровня анестезии (неподвижно с частотой дыхания примерно 1 вдох/с). Перенесите животное из индукционной камеры в анестезиологическую маску, установленную на 2 л/мин поток кислорода и 3% изофлуран.
    2. Одеть куртку с животным: Надеть животное в куртку подходящего размера, полностью протянуть передние конечности через проймы и надёжно застегнуть куртку вдоль спины животного (показано на рисунке 3C).
    3. Замена вставки на пробную вставку: Используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей и манекена, аккуратно вынимите манекен из направляющей. Аккуратно установите пробный элемент, вставьте его в направляющий, затем снова вставьте фиксирующий клин.
    4. Выведите животное из анестезии и поместите его в вращающуюся клетку. Прикрепите трос клетки к куртке животного и активируйте вращающуюся систему клетки.
  5. Проведение cOFM-дискретизации:
    1. Установите микроперфузионные насосы на 5 мкл/мин и проведите промывку на 2 минуты, чтобы удалить микропузырьки, которые могли образоваться при установке вставка cOFM.
    2. Измените настройки микроперфузионного насоса на правильную скорость расхода для режима насоса (например, 1 мкл/мин).
    3. Активируйте режим насоса. При фракционированном cOFM-отборе активируйте коллектор фракций.
    4. На начальных этапах отбора проб cOFM проводите внимательные наблюдения за трубками push and pull, чтобы убедиться в отсутствии газовых пузырьков, так как они могут нарушить работу машин и сбор образцов и потенциально угрожать животному. Если наблюдаются газовые пузырьки, остановить компоненты системы, отсоединить животное от системы cOFM и удалить газовые пузырьки путём промывки с помощью CSF через трубку.
    5. В течение всего процесса отбора проб cOFM проводите дополнительные частые наблюдения за трубками cOFM и поведением животных. Если поведение животных указывает на внезапные изменения в здоровье, немедленно прекратите компоненты системы и решите проблему, касающуюся здоровья животных. При необходимости проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом учреждения.
  6. Отделение животного от системы cOFM:
    1. Отключите вращающуюся систему клетки и отсоедините трос клетки от куртки животного.
    2. Переместить животное в камеру для индукции анестезии изофлурана, при этом вставка для отбора образцов и трубка cOFM останутся на месте. Начинайте анестезию с кислородным потоком 2 л/мин и изофлураном, установленным на 3%. Наблюдайте за животным, пока оно не достигнет подходящего уровня анестезии (неподвижно с частотой дыхания примерно 1 вдох/с). Переведите животное из индукционной камеры в анестезиологическую маску, установленную на 2 л/мин кислородного потока и 3% изофлурана.
    3. Замените вставку для отбора проб на фиктивную вставку: используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей и вставка для отбора проб, и аккуратно вынимите вставку для отбора проб из направляющей. Аккуратно вставьте фиктивную вставку обратно в направляющую, затем вставьте фиксирующий клин обратно.
    4. Снятие куртки: Отсоедините застёжки с обратной стороны куртки животного и аккуратно снимите куртку с животного.
    5. Восстановление и наблюдение животных: Выведите животное из анестезии изофлурана и поместите его в чистую клетку для восстановления, обеспечивая постоянное наблюдение до полного прихождения в сознание и восстановление грудины. После полного восстановления животное переселите в домашнюю клетку.
  7. Сбор и хранение образцов:
    1. Фракционированное отбор проб:
      1. Вынимите трубки для сбора фракций из сборщика фракций и поместите их на лёд для краткосрочного транспорта.
      2. Взвесьте каждую пробирку и сравните с весом предварительного сбора, чтобы проверить объём образца.
      3. Переходите к дальнейшему анализу образцов cOFM или помещайте их в морозильник при температуре -80 °C для длительного хранения.
    2. Рециркулированная выборка:
      1. Оставив трубку для отбора проб прикреплённой к выходу cOFM для отбора проб (короткий вал), отсоедините её от остальной части и поместите трубку и вставку для отбора проб в новую, чистую микроцентрифугную трубку.
      2. Прикрепите стерильную иглу 18G к стерильному шприцу объемом 1–5 мл и наполните её воздухом.
      3. Аккуратно вставьте иглу в разъём фланцевой трубки на входном конце трубки.
      4. Убедившись, что вставка cOFM остаётся в пробирке микроцентрифуги, нажмите на поршень шприца, чтобы выбросить рециркулированный объём cOFM из трубки с воздухом. Убедитесь, что весь образец cOFM выведен из пробирки в микроцентрифуговую трубку, отсоединяя шприц и при необходимости наполняя его воздухом.
      5. Поместите рециркулированный образец cOFM на лёд для краткосрочного транспорта.
      6. Переходите к анализу на следующий этап или помещайте их в морозильник при температуре -80 °C для длительного хранения.
  8. Хранение припасов cOFM при повторяющем отборе cOFM в одном и том же животном:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное использование одноразовых cOFM-материалов, таких как пробные вставки и впускно-выходные трубки, не рекомендуется производителем.
    1. Промите трубу cOFM с помощью примерно 500 мкл стерильного aCSF или физиологического раствора со скоростью не более 10 мкл/мин. Затем сделайте аналогичную промывку 1-2 мл 70% этанола. Наконец, используйте шприц объемом 5 или 10 мл с иглой 18G и фланцевым соединителем трубки для промывания трубки воздухом.
    2. Промывать впускные и выходные трубки вставки cOFM с 50 мкл стерильного aCSF или физиологического раствора с помощью газонепроницаемого стеклянного шприца с фланцевым разъёмом трубки. Затем добавляйте 50 мкл этанола 70%. Отсоедините вставку cOFM от разъёма трубки и храните его в флаконе, наполненном 70% этанолом, до повторного использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные оценочные показатели для оценки успеха эксперимента могут проводиться на промежуточных или кульминационных этапах, в зависимости от специфического характера патологии и модели исследуемых животных. Для исследований биологии GBM биолюминесцентная визуализация (BLI) может использоваться как промежуточная оценка эффективности прищепления опухолевых клеток с помощью cOFM (рисунок 4A). Однако это используется для простых дихотомических оценок опухоли, н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры cOFM, описанные в этом протоколе, имеют потенциал революционизировать изучение заболеваний ЦНС благодаря своей способности продольно отбирать эндогенные компоненты ISF патологической ткани. Однако успешность исследования применения этой методологии зависит от правильного выполнения нескольких критически важных этапов. Из них одним из самых важных является правильное и надёжное размещение направляющей канюли cOFM. Неправильные хирургические процедуры или стратегии крепления могу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта 1R01NS096376, 1R01NS112856 и SPORE P50CA221747 трансляционных подходов к раку мозга (A.U.A.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,7 мм сверлоТонкие научные инструменты19008-07Бурение отверстия с жорном
Шприц объёмом 1–5 млBD#309646Рециркулированный образец перфузата ретривал
Игла 18 GBD#305195Рециркулированный образец перфузата ретривал
Игла на 30GBD Ultra-Fine328438Пробивающая твердость
Викриловые швы 4-0Динарекс9130Закрытая операция будет
Спиртовые салфеткиFisherBrand22-363-750Дезинфекция кожи в операционном месте
Анкерные винтыBASiMD-1310Размещение крепления головы cOFM
Искусственная спинномозговая жидкость (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400Дискретизация ISF
cOFM-вставка с фиктивным вставкойBASi (Joanneum)cOFM-D- #Размещение крепления головы cOFM
Руководство cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #Размещение крепления головы cOFM
Держатель направляющего cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1Размещение крепления головы cOFM
Инфузионная вставка cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #Инъекция клеток
cOFM-блокирующий клинBASi (Joanneum)cOFM-LOCKРазмещение крепления головы cOFM
Вставка cOFM для отбора пробBASi (Joanneum)cOFM-S-XДискретизация ISF
Аппликаторы с хлопковыми наконечникамиFisherBrane22363160Поглощение жидкости с применением перекиси водорода
Клеточная линия глиомы CT2A у мышиЛаборатория Сейфрида — Бостонский университетNAПрививчатые опухолевые клетки
Стоматологический цементирующий агентIvoClar595953USРазмещение крепления головы cOFM
Светильник для закаления зубовГенри Шайн5700253Размещение крепления головы cOFM
Депиляционный кремVeet3116875Удаление волос в области хирургического участка
ЭлектробритваWahl Clipper Corp. 8841Удаление волос в области хирургического участка
Щипцы с мелким наконечникомТонкие научные инструменты5SFРазрез, установка анкерного винта
Разъёмы трубок с фланцамиBASi (Joanneum)MD-1510Инъекция клеток
Флаконы для сбора фракцийBASi (Joanneum)MF-5281Фракционированное хранение образцов
Герметичный стеклянный шприц (25 μ L)Гамильтон80465Инъекция клеток
Перекись водорода (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Очистка поверхности черепа
Инсулиновые шприцы (0,3–1,0 мл) с иглами 31GBD Ultra-Fine328438Анестезия и анальгетики
Микроцентрифугальные трубкиБасикс02-682-002Рециркулированный образец перфузата ретривал
Микродрель и держатель стереотаксического механизмаАппаратура Гарварда75-1874Бурение отверстия с жорном
Мышиная курткаЛомирMJ 02Связь животных с вращающейся системой клеток
OFM-трубка с низким связываниемBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBДискретизация ISF
OFM-насос — микроперфузионный насосBASi (Joanneum)MPP102-PCДискретизация ISF
Офтальмологическая мазьДехра211-38Пери-сугрическая смазка глаз
Пассивированная металлическая игла для отбора пробBASi (Joanneum)MW-2310Фракционированное хранение образцов
Перфусатная сумкаBASi (Joanneum)OFM-BAGДискретизация ISF
Физиологический физиологический растворОтделение интенсивной терапии (ICU Medical );0990-7983-03Очистка поверхности черепа, помощь при сверлении заусенцев
Повидон-йодные мазкиЗдравоохранение PDISKU B40600Дезинфекция кожи в операционном месте
Держатель зондаШтёльтинг51633
Рефрижераторный дробный коллекторBASi (Joanneum)MD-1201Фракционированное хранение образцов
Вращающаяся клеткаBASi (Joanneum)AMD-R RaturnАвтоматизированное оболочение для отбора cOFM в бодрствующем состоянии
Лезвия и рукоятки скальпеляFisher Scientific 22079693Разрез
ОтвёрткаРазмещение крепления головы cOFM
Самотравляемый зубной клей и bbsp;ТокуямаГрунтовка поверхности черепа для цементирующего агента
Силиконовая крышка для флаконов для сбораBASi (Joanneum)MF-5283Фракционированное хранение образцов
Стереотактическая рамаШтёльтинг51725

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorders with impaired neurofluid dynamics. Magn Reson Med Sci. 23 (1), 1-13 (2024).
  3. Matsumae, M., et al. Research into the physiology of cerebrospinal fluid reaches a new horizon: Intimate exchange between cerebrospinal fluid and interstitial fluid may contribute to maintenance of homeostasis in the central nervous system. Neurol Med Chir (Tokyo). 56 (7), 416-441 (2016).
  4. Filannino, F. M., Panaro, M. A., Benameur, T., Pizzolorusso, I., Porro, C. Extracellular vesicles in the central nervous system: A novel mechanism of neuronal cell communication. Int J Mol Sci. 25 (3), 1629(2024).
  5. Marcus, H. J., Carpenter, K. L., Price, S. J., Hutchinson, P. J. In vivo assessment of high-grade glioma biochemistry using microdialysis: A study of energy-related molecules, growth factors and cytokines. J Neurooncol. 97 (1), 11-23 (2010).
  6. De Ruiter Swain, J., Michalopoulou, E., Noch, E. K., Lukey, M. J., Van Aelst, L. Metabolic partitioning in the brain and its hijacking by glioblastoma. Genes Dev. 37 (15-16), 681-702 (2023).
  7. Teer, L., Yaddanapudi, K., Chen, J. Biophysical control of the glioblastoma immunosuppressive microenvironment: Opportunities for immunotherapy. Bioengineering (Basel). 11 (1), 93(2024).
  8. De Boeck, A., et al. Glioma-derived il-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression. Nat Commun. 11 (1), 4997(2020).
  9. Yeo, E. C. F., Brown, M. P., Gargett, T., Ebert, L. M. The role of cytokines and chemokines in shaping the immune microenvironment of glioblastoma: Implications for immunotherapy. Cells. 10 (3), 607(2021).
  10. Riviere-Cazaux, C., et al. Longitudinal glioma monitoring via cerebrospinal fluid cell-free DNA. Clin Cancer Res. 31 (5), 881-889 (2025).
  11. Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
  12. Lehmann, A., Isacsson, H., Hamberger, A. Effects of in vivo administration of kainic acid on the extracellular amino acid pool in the rabbit hippocampus. J Neurochem. 40 (5), 1314-1320 (1983).
  13. Sandberg, M., Lindstrom, S. Amino acids in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat--collection in vivo. J Neurosci Methods. 9 (1), 65-74 (1983).
  14. Tossman, U., et al. Brain amino acids measured by intracerebral dialysis in portacaval shunted rats. J Neurochem. 41 (4), 1046-1051 (1983).
  15. Zetterstrom, T., et al. Purine levels in the intact rat brain. Studies with an implanted perfused hollow fibre. Neurosci Lett. 29 (2), 111-115 (1982).
  16. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  17. Darvesh, A. S., et al. In vivo brain microdialysis: Advances in neuropsychopharmacology and drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (2), 109-127 (2011).
  18. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. Chapter 7 (Unit7), 1(2009).
  19. Altendorfer-Kroath, T., et al. Comparison of cerebral open flow microperfusion and microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances. J Neurosci Methods. 311, 394-401 (2019).
  20. Custers, M. L., et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 1178, 338803(2021).
  21. Birngruber, T., et al. Cerebral open flow microperfusion: A new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (12), 864-871 (2013).
  22. Kleinert, M., et al. Time-resolved hypothalamic open flow micro-perfusion reveals normal leptin transport across the blood-brain barrier in leptin resistant mice. Mol Metab. 13, 77-82 (2018).
  23. Le Prieult, F., Barini, E., Laplanche, L., Schlegel, K., Mezler, M. Collecting antibodies and large molecule biomarkers in mouse interstitial brain fluid: A comparison of microdialysis and cerebral open flow microperfusion. MAbs. 13 (1), 1918819(2021).
  24. Altendorfer-Kroath, T., et al. Quantification of the therapeutic antibody ocrelizumab in mouse brain interstitial fluid using cerebral open flow microperfusion and simultaneous monitoring of the blood-brain barrier integrity. Pharmaceutics. 15 (7), 1880(2023).
  25. Birngruber, T., et al. Enhanced doxorubicin delivery to the brain administered through glutathione pegylated liposomal doxorubicin (2b3-101) as compared with generic caelyx,((r))/doxil((r))--a cerebral open flow microperfusion pilot study. J Pharm Sci. 103 (7), 1945-1948 (2014).
  26. Birngruber, T., et al. Long-term implanted cOFM probe causes minimal tissue reaction in the brain. PLoS One. 9 (3), e90221(2014).
  27. Altendorfer-Kroath, T., et al. Atraumatic access to human glioblastoma in a xenograft animal model by cerebral open flow microperfusion. J Neurosci Methods. 393, 109893(2023).
  28. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 52(2021).
  29. Hummer, J., Altendorfer-Kroath, T., Birngruber, T. Cerebral open flow microperfusion to monitor drug transport across the blood-brain barrier. Curr Protoc Pharmacol. 85 (1), e60(2019).
  30. Sundheimer, J. K., et al. Experimental insights and recommendations for successfully performing cerebral microdialysis with hydrophobic drug candidates. Clin Transl Sci. 18 (5), e70226(2025).
  31. Altendorfer-Kroath, T., Hummer, J., Birngruber, T. In vivo monitoring of brain pharmacokinetics and pharmacodynamics with cerebral open flow microperfusion. Biopharm Drug Dispos. 44 (1), 84-93 (2023).
  32. Kreß, S., et al. Innovative platform for the advanced online monitoring of three-dimensional cells and tissue cultures. Cells. 11 (3), 412(2022).
  33. Bjorkli, C., et al. In vivo microdialysis in mice captures changes in alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers consistent with developing pathology. J Alzheimers Dis. 84 (4), 1781-1794 (2021).
  34. Gorska, A. M., et al. Evaluation of cerebrospinal fluid (csf) and interstitial fluid (isf) mouse proteomes for the validation and description of alzheimer's disease biomarkers. J Neurosci Methods. 411, 110239(2024).
  35. Pemmari, T., et al. Screening of homing and tissue-penetrating peptides by microdialysis and in vivo phage display. Life Sci Alliance. 8 (5), e202201490(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи