Стандартизированная мышиная модель с трёхчеловекным рабочим процессом для изучения острого клеточного и антитело-опосредованного отторжения в ксенотрансплантации

Краткое содержание

В этом исследовании установлены две стандартизированные модели ксенотрансплантации мышей для конкретного воспроизведения острого клеточного отторжения и острого отторжения, опосредованного антителами. Эти модели служат надёжной платформой для изучения механизмов иммунного отторжения ксенотрансплантата, оценки иммуносупрессивных стратегий и продвижения доклинических исследований ксенотрансплантации.

Аннотация

Несмотря на недавние достижения в ксенотрансплантации, острое отторжение остаётся серьёзным препятствием для её клинического применения. Острое клеточное отторжение (ACR) и острое антитело-опосредованное отторжение (AMR) являются основными иммунными ответами, приводящими к ранней неэффективности трансплантата у реципиентов ксенотрансплантата. Хотя крупные животные модели, такие как нечеловеческие приматы и генетически модифицированные свиньи, дали ценные сведения, их использование ограничено высокими затратами, этическими ограничениями и значительной экспериментальной вариативностью. Модели на мелких животных предлагают практическую, воспроизводимую альтернативу для механистических исследований иммунного отторжения. В этом исследовании были разработаны две стандартизированные модели ксенотрансплантации мышей, специально имитирующие ACR и AMR. Для обеспечения воспроизводимости и минимизации вариативности, связанной с оператором, был внедрён структурированный хирургический протокол с тремя членами и рабочим процессом на конвейере, что позволило стабильно генерировать модели с высокой эффективностью и качеством. Полученные модели не только воспроизводят ключевые иммунопатологические особенности клинического отторжения ксенотрансплантата, но и предоставляют надёжную платформу для изучения иммунных механизмов и оценки таргетных иммуносупрессивных стратегий. Эти модели помогут ускорить доклиническую разработку ксенотрансплантационных терапий.

Введение

Ксенотрансплантация стала одной из самых перспективных стратегий для решения проблемы нехватки донорских органов для трансплантации. В последние годы быстрый прогресс в технологиях генетического редактирования, стратегиях регуляции иммунитета и биомедицинской инженерии привёл к значительному прогрессу в этой^{области 1}. За последние три года несколько исследовательских групп по всему миру провели клинические испытания, связанные с ксенотрансплантацией на людях, включая два случая генетически модифицированной трансплантации сердца свиньи в Университете Мэриленда, испытание по пересадке почки свиньи в Массачусетской общей больнице и исследование трансплантации тимопочек в Нью-Йоркском^{университете} 2,3,4,5 . Несмотря на эти беспрецедентные достижения, иммунное отторжение остаётся основной проблемой, ограничивающей клиническое применение ксенотрансплантации. Даже при высоко оптимизированных генетически модифицированных донорских органах и комбинированных иммуносупрессивных режимах отторжение остаётся серьёзным препятствием. Текущие исследования показывают, что острое отторжение является критически важным препятствием в ксенотрансплантации, в основном классифицируемой на острое клеточное отторжение (ОКР) и острое антитело-опосредованное отторжение (АМР). ACR в основном опосредована Т-клетками, что характеризуется обширной инфильтрацией Т-клеток в трансплантат, что приводит к повреждению тканей и нарушению функциональных функций. Его основные механизмы включают презентацию ксеногенного антигена, активацию Т-клеток и высвобождение воспалительных^{цитокинов 6,7}. В отличие от этого, АМР обусловлен заранее сформированными или недавно сформированными донороспецифическими антителами. Эти антитела связываются с эндотелиальными клетками внутри трансплантата, вызывая активацию комплемента и устойчивый иммунный ответ, что в конечном итоге приводит к микрососудистым повреждениям, тромбозу и отказу трансплантата ^8,9,10. Поэтому более глубокое понимание этих механизмов отторжения и разработка более точных иммунорегуляторных стратегий необходимы для продвижения ксенотрансплантации от доклинических исследований к долгосрочному клиническому применению.

Чтобы решить проблему острого отторжения при ксенотрансплантации, необходимо вернуться к фундаментальным исследованиям и доклиническим исследованиям, чтобы выяснить лежащие в основе иммунологические механизмы. Крупные животные модели, особенно нечеловеческие приматы (NHPs) и генетически модифицированные свиней, широко используются в исследованиях ксенотрансплантации благодаря их анатомическим и физиологическим сходствам с людьми. Эти модели дают критическое понимание механизмов отторжения иммунного отторжения и иммуномодуляторных стратегий. Однако их применение существенно ограничено высокими затратами, этическими соображениями и сложностью долгосрочного послеоперационного ухода. Кроме того, значительная вариабельность иммунных ответов между отдельными НГП влияет на воспроизводимость экспериментальных^{результатов} 11,12,13. Хотя модели крупных животных остаются незаменимыми для клинической трансляции, их ограничения в экспериментальной осуществимости и согласованности подчёркивают острую необходимость более экономичных, масштабируемых и механистически значимых моделей малых животных.

Учитывая эти сложности, модели мелких животных приобретают всё большее значение в исследованиях ксенотрансплантации благодаря низкой стоимости, коротким экспериментальным циклам и простоте крупномасштабного применения. Эти модели не только предоставляют важную платформу для изучения механизмов иммунного отторжения, но и служат важным мостом между исследованиями in vitro и экспериментами на крупных животных, способствуя более точному изучению иммунорегуляторных стратегий. В этом исследовании были установлены две стандартизированные модели ксенотрансплантации мышей, которые конкретно имитируют ACR и AMR. Для обеспечения воспроизводимости и согласованности были внедрены стандартизированные трёхчленные хирургические протоколы и упрощённый конвейерный подход к генерации моделей. Этот стандартизированный рабочий процесс минимизирует вариативность, зависящую от оператора, что приводит к высокоунифицированным моделям трансплантации сердца. Эти усовершенствования предоставляют надёжную платформу для механистических исследований и оценки новых иммуносупрессивных стратегий. Этот протокол особенно подходит для исследователей, проводящих исследования иммунных механизмов ксенотрансплантации на мелких животных и для оценки иммуносупрессивных стратегий. Он предлагает такие преимущества, как низкая стоимость, высокая воспроизводимость и стандартизированный рабочий процесс, обеспечивая надёжную экспериментальную основу для последующих исследований на крупных животных и доклинических исследованиях.

Протокол

Этот протокол может выполняться одним оператором или командой из трёх человек, при этом каждый участник отвечает соответственно за извлечение донорского сердца, подготовку реципиента и анастомоз донорского сердца. Вся процедура завершается за 10 минут, что обеспечивает быструю, высокопроизводительную и стандартизированную генерацию моделей.

Эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) больницы Фувай, Китайской академии медицинских наук (Одобрение No 0108-1-70-ZX(X)-41). Все процедуры выполнялись в строгом соответствии с нормативами по благополучию животных и этическими нормами для обеспечения соблюдения соответствующих стандартов. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Предоперационная подготовка

1. Подготовка манжет
   1. Используйте полиимидную трубку для изготовления манжет для трансплантационной операции. Для артериальной манжеты выберите полиимидную трубку с внутренним диаметром 0,3–0,5 мм и разрежьте её на сегменты по 2 мм под стереомикроскопом (увеличение 10×–20×).
   2. Частично разрежьте зажимную секцию каждого сегмента по окружности пополам, чтобы получить ручкообразное удлинение. Для венозной манжеты выберите полиимидную трубку с внутренним диаметром 0,4–0,7 мм и разрежьте её на сегменты по 3 мм. Аналогично, частично разрезать зажимную секцию по окружности пополам, чтобы создать удлинение, похожее на ручку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замочите манжеты в 75% этанола на 30 минут, затем тщательно смойте обычным физиологическим раствором.
2. Подготовка мышей: Используйте неонатальных крыс Sprague-Dawley (SD) в возрасте 10–12 дней в качестве доноров, а также мышей C57BL/6 или Balb/c в возрасте 7–8 недель в качестве реципиентов. Чтобы обеспечить надлежащий уход и минимизировать стресс, транспортируйте неонатальных донорских крыс вместе с матерью-крысой. Все животные содержатся в определённой среде без патогенов (SPF).

2. Сбор донорского сердца

1. Фиксация и анестезия
   1. Анестезия новорождённых крыс с помощью внутрибрюшнической инъекции 30 мкл/г триброметанола (Jitianbio, JT0781) (согласно утверждённым институциональными протоколами).
   2. После полной анестезии положите крысу в положение на спине и закрепите под стереомикроскопом. Дезинфицируйте грудную абдоминальную область ватными шариками, пропитанными повидоном и йодом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с триброметанолом в перчатках и защитных глазах в вентилируемом помещении; Избегайте контакта с кожей и вдыхания.
2. Гепаринизация
   1. Дезинфицируйте грудную абдоминальную область ватными шариками, пропитанными повидоном и йодом. Аккуратно отодвините кишечник ватной палочкой, чтобы обнажить нижнюю полую вену.
   2. Введите гепаринизированный физиологический раствор (0,2–0,5 мл) в нижнюю полую вену с помощью инсулинового шприца, затем аккуратно сжатие места инъекции ватным шариком для предотвращения кровотечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении или инъекции гепаринизированного физиологического раствора надевайте перчатки и защиту глаз; Утилизируйте шприцы как отходы для острого предмета. Приготовьте гепаринизированный физиологический раствор, растворив один флакон медицинского гепарина натрия (125 мг) в 100 мл обычного физиологического раствора.
3. Остановка сердца
   1. Разрезайте диафрагму, разрежьте грудную стенку в обеих сторонах и втяните её, чтобы полностью открыть сердце. Удалите тимус. Перерезать верхнюю полую вену для снятия давления и ввести 1 мл раствора Университета Висконсина (UW) в аорту, чтобы вызвать остановку сердца.
   2. Продолжайте перфузию, пока сердце не сменит цвет с красного на бледный. Одновременно положите марлевую прокладку, пропитанную ледяным физиологическим раствором, на сердце, чтобы снизить его температуру и предотвратить обезвоживание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте стерильную марлю на кусочки по 1 см × 1 см и предварительно замочите их в ледяном физиологическом растворе перед использованием.
4. Сбор донорского сердца
   1. Перевязывайте верхнюю и нижнюю полую вену шелковым швом размером 8–0, затем перерезайте их. Разрежьте аорту в аортальной дуге и перерезайте легочную артерию в её бифуркации.
   2. Наконец, перевязывайте все лёгочные вены с показателем 8-0 Швить швом и удалить сердце донора. Временно храните собранное сердце в ледяном солевом растворе для сохранения.

3. Подготовка получателя

1. Анестезия
   1. Анестезируйте мышь-реципиент тем же методом и поместите её в положение на спине для стабилизации.
2. Дезинфекция
   1. Удаляйте волосы с области шеи с помощью депиляционного крема, затем дезинфекцируйте кожу повидон-йодом.
3. Кожный разрез
   1. Сделайте продольный разрез диаметром 2 см примерно в 1 см справа от средней линии шеи с помощью офтальмологических ножниц. Проведите тупую диссекцию для постепенного удаления подкожного жира и мышечных слоёв, а также удалите поднижнюю железу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении нижней челюсти базальные кровеносные сосуды следует перевязывать швом 8–0 или прижигать электрокоагуляторной ручкой для предотвращения кровотечения.
4. Подготовка наружной яремной вены
   1. После экспонирования наружной яремной вены индивидуально прижгайте ветви с помощью электрокоагуляционного перо, установленного в режиме низкой коагуляции (5–10 Вт). Второе место 8-0 шелковые швы расположены возле дистального конца вены для перевязки.
   2. Используйте микрохирургические ножницы, чтобы перерезать наружную яремную вену между двумя лигатурами. Введите наружную яремную вену через венозную манжету, прижайте манжету к основанию вены и закрепите сосудистым зажимом.
   3. Удалите лигатуры с помощью микрохирургических ножниц и промите остатки крови из вены с помощью гепаринизированного физиологического раствора. Выверьте наружную яремную вену через манжету с помощью микрохирургических щипцов и зафиксируйте её 8-0 Шёлковый шов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электрокоагуляторную ручку аккуратно и старайтесь избежать ожогов. Наружная яремная вена имеет несколько притоков, которые следует тщательно изолировать и герметизировать для минимизации кровотечения.
5. Подготовка сонной артерии
   1. Проведите тупую диссекцию сзади грудино-ключидомастовидной мышцы, чтобы найти сонную оболочку. Откройте сонную оболочку и аккуратно отделите общую сонную артерию от внутренней яремной вены и блуждающего нерва.
   2. Перевязывайте и перерезайте артерию так же, как вену. Введите нижний конец перерезанной артерии через артериальную манжету, выверните её и закрепите на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сонная артерия, внутренняя яремная вена и блуждающий нерв заключены в сонную оболочку. При открытии оболочки следует быть осторожным, чтобы не повредить блуждающий нерв. Сонная артерия имеет меньший диаметр, чем наружная яремная вена, но более эластична, что затрудняет эверсию по сравнению с веной.

4. Донорский анастомоз сердца

1. Анастомоз аорты в сонную артерию
   1. После обрезания донорского сердца немедленно поместите его в шею мыши-реципиента. Используйте 8-0 Шёлковый шов с свободным узлом, чтобы образовать петлю вокруг донорской аорты.
   2. Наденьте донорскую аорту поверх артериальной манжеты на сонной артерии реципиента и закрепите её 8-0 Шёлковая лигатура.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При закреплении аорты шов должен быть завязан выше линии связки сонной артерии, чтобы предотвратить прямой контакт между местом перевязки и кровью реципиента.
2. Анастомоз легочной артерии наружной яремной вены
   1. Используйте 8-0 Шёлковый шов с свободным узлом, чтобы создать петлю вокруг донорской легочной артерии. Проведите легочную артерию через венозную манжету наружной яремной вены реципиента и закрепите её 8-0 Шёлковая лигатура.
3. Возобновление сердечного процесса
   1. Освободить сосудистые зажимы с сонной артерии и наружной яремной вены реципиента, чтобы восстановить кровоток. Обратите внимание, что донорское сердце возобновляет сильные схватки и быстро краснеет в течение 10 секунд.
4. Закрытие разреза
   1. Когда сердце донора восстановит стабильный ритм, измените его положение и закройте кожный разрез на шее реципиента 4-0 швовами. Продезинфицируйте место операции повидон-йодом.

5. Послеоперационный уход

1. Послеоперационная анальгезия
   1. Наносите гель лидокаина наружно для облегчения боли после завершения закрытия кожи. Если мышь проявляет значительные признаки боли, вводите мелоксикам (2 мг/кг ) через внутрибрюшинную инъекцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мелоксикам растворяется в 10% ДМСО и 90% кукурузного масла, а объём инъекции рассчитывается на основе необходимой дозы.
2. Восстановление
   1. Положите мышь на тёплую мягкую подушечку с температурой 37–38 °C для поддержания температуры тела и контролируйте её до прихода в сознание. Когда мышь полностью проснётся, поместите мыши в клетку с достаточным доступом к еде и воде.
3. Мониторинг
   1. Ежедневно следите за пересаженным сердцем с помощью визуального осмотра и пальпации, чтобы оценить его ритм и общую жизнеспособность трансплантата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и соблюдайте институциональные нормы по биобезопасности и уходу за животными. Все химические остатки, перфусаты и ткани животных, образующиеся в ходе эксперимента, должны быть собраны и утилизированы в соответствии с институциональными нормами. Растворы, содержащие трибромеэтанол или гепарин, следует рассматривать как опасные химические отходы, а животные ткани и материалы, полученные из крови, — как биологические отходы и стерилизовать автоклавированием или утилизировать через сертифицированные предприятия.

Результаты

Рисунок 1 демонстрирует стандартизированный рабочий процесс трёх человек для создания модели ксенотрансплантации мышей. В этой системе три оператора работают параллельно, каждый выполняет определённую задачу многократно: подготовка реципиента, получение донорского сердца или анастомоз донорского сердца. Такое распределение обязанностей позволяет завершать одну полную модель трансплантации каждые 10 минут. Хотя один оператор может завершить одну модель пример...

Обсуждение

Ксенотрансплантация мышей — это высокоинвазивная процедура, требующая высокого уровня технической подготовки и стабильности от оператора. Во время создания модели оператор оказывает значительное влияние на результаты^{экспериментов 14,15}. В одноличном рабочем процессе сложность и продолжительность процедуры приводят к приблизительному времени работы в 30 минут на модель, что приводит к низкой эффективности. Кроме того, индивидуальн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анти-CD3 антитело	Abcam	ab16669
Анти-CD68 антитело	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Депиляционный крем	Veet	-
Электрокаутер	Yuyan Instrument	-
Флуоресцентные вторичные антитела	Thermofisher	A-11008
Комплект для окрашивания HE	Beyotime	C0105S
Ледогенератор	Shjingmi	IMS-20
Инсулиновые шприцы	KDL	U-40
Гель лидокаина	Tide Pharm
Мелоксикам	Sigma-Aldrich	444800
Микрохирургические форцепсы	ZHENHAO	FS217
Микрохирургические наконечники	BIOFIVEN	HH01231
Микрохирургические ножницы	ZHENHAO	FS237
Физиологический раствор	Kelun Pharmaceutical	-
Полиимидные трубки	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Внутренний диаметр: 0.3-0.5 мм
Полиимидные трубки	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Внутренний диаметр: 0.4-0.7 мм
Растворы повидона-йода	INOHV	-
Гепарин натрия	Qianhong bio-pharma	-
Стереомикроскоп	Murzider	MSD204
Хирургические шовные материалы	Jinhuan Medical	Шелковые нити 8-0 и 4-0
Хирургические прогревающие подушечки	Hani Pet	-
Триброметанол	Jitianbio	JT0781
Растворы Университета Висконсина	Belzer	-
Васкулярные клеммы	RWD Life	R31005-10