Исследовательская статья

Микрокапельная цифровая полимеразная цепная реакция для точного обнаружения мутаций немелкоклеточного рака легкого

653 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68770

⸱

29 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол для чувствительного и специфического обнаружения мутаций EGFR T790M с помощью капельной цифровой полимеразной цепной реакции (ddPCR), который также может быть расширен для быстрой идентификации других опухолевых мутаций, таких как G719S, L858R, L861Q и S768I.

Аннотация

В глобальном масштабе рак легких продолжает оставаться основной причиной смертности, связанной с раком, при этом его распространенность уступает только заболеваемости раком почки. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет примерно 80-85% всех зарегистрированных случаев рака легких. Мутация T790M в гене EGFR является широко признанным первичным фактором, определяющим приобретенную резистентность к ингибиторам тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR-TKIs). Наличие этого состояния наблюдалось примерно у 50-60% пациентов с прогрессирующим заболеванием. Таким образом, реализация оперативного и высокочувствительного подхода к выявлению мутаций T790M в гене EGFR имеет важное значение для быстрой идентификации немелкоклеточного рака легкого. В настоящем исследовании для выявления мутации T790M использовалась ddPCR с пределом обнаружения 10 копий/мкл, что в 10 раз превышает чувствительность кПЦР (1 × 102 копий/мкл). Для 15 смоделированных образцов ddPCR была способна обнаруживать наличие мутаций T790M в гене EGFR, которые наблюдались на сниженных уровнях при анализе с помощью количественной ПЦР. В настоящее время исследуется обнаружение мутаций T790M внутри гена EGFR методом быстрого обнаружения с целью определения его пригодности.

Введение

Рак легких является основной причиной смертности, связанной с раком, во всем мире и занимает второе место по распространенности злокачественных новообразований в целом. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет значительное большинство, примерно от 80% до 85%, от всех зарегистрированных случаев рака легких 1,2,3,4. Для пациентов с диагнозом прогрессирующего НМРЛ с мутациями EGFR установленный терапевтический подход включает применение ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) эпидермального фактора роста (EGFR) первого, второго или третьего поколения. Тем не менее, у большинства пациентов, получавших EGFR-ИТК первого или второго поколения, в конечном итоге развивается приобретенная устойчивость к препарату. Эту устойчивость часто связывают с наличием мутации T790M в гене EGFR, которая обнаруживается примерно у 50-60% пациентов с прогрессированием заболевания 8,9,10,11,12.

Традиционно генетические аномалии в опухолевой ДНК из образцов тканей выявляются с помощью таких методов, как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) или секвенирование нового поколения (NGS)13,14. Тем не менее, биопсия тканей может быть затруднена из-за недоступности опухоли, плохого состояния здоровья пациента или недостаточного содержания опухолевых клеток 15,16,17. В качестве альтернативы, жидкостная биопсия, особенно из плазмы, предлагает менее инвазивный способ выявления драйверных мутаций путем обнаружения циркулирующей опухолевой ДНК (цДНК). Опухолевые клетки выделяют ДНК в кровоток, плевральную жидкость, слюну или кал, являясь ценным источником для генетического анализа18,19. Генетический профиль цДНК часто отражает генетический состав опухоли, предлагая всестороннее представление о гетерогенности опухоли, что является решающим фактором для точной диагностики иперсонализированного лечения рака.

Среди различных методов идентификации мутаций EGFR в периферической крови, включая секвенирование, полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ОТ-ПЦР), цифровую ПЦР, денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию (DHPLC), амплификационную рефрактерную мутационную систему (ARMS) и обогащенную мутантами ПЦР (ME-PCR), микрокапельная цифровая ПЦР (ddPCR) стала высокоэффективным инструментом для обнаружения мутаций цДНК22,23. Его превосходная чувствительность, точность и способность обнаруживать мутации с низким содержанием и высокой точностью отличают его. В отличие от традиционной ПЦР, ddPCR разделяет образцы на тысячи капель, что позволяет проводить абсолютную количественную оценку целевых последовательностей ДНК без стандартных кривых. Это делает его исключительно подходящим для обнаружения редких мутаций, таких как мутация T790M в EGFR. Несмотря на преимущества ddPCR, его широкое клиническое применение было ограничено проблемами в подготовке образцов, оптимизации системы и сравнительном анализе производительности с установленными методами, такими как qPCR. Существует критический пробел в оптимизации протоколов ddPCR для выявления мутаций цДНК, особенно в отношении чувствительности, специфичности и воспроизводимости, необходимых для клинического внедрения.

В этом исследовании мы предполагаем, что ddPCR обеспечивает более высокую чувствительность и надежность для обнаружения мутации EGFR T790M в цДНК по сравнению с традиционными методами количественной ПЦР. Мы сосредоточились на оптимизации процесса экстракции нуклеиновых кислот для повышения эффективности, а затем на оптимизации ddPCR для обнаружения мутаций. Кроме того, мы сравнили производительность ddPCR и qPCR с точки зрения чувствительности, специфичности и воспроизводимости с использованием смоделированных образцов. Систематически оценивая потенциал ddPCR, мы стремимся утвердить ее в качестве жизнеспособной и превосходной альтернативы qPCR для обнаружения мутаций EGFR в жидких биопсиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании не участвовали люди, человеческие ткани или эксперименты на живых животных; Таким образом, формального этического одобрения не требовалось. Все процедуры проводились в соответствии с институциональными и национальными руководящими принципами. Мутантная плазмида T790M была коммерчески синтезирована. Свиная кровь, используемая для моделирования клинических образцов, была получена от сертифицированного поставщика в соответствии с правилами защиты животных, без участия живых животных. Все остальные реагенты, включая магнитные шарики, праймеры, зонды и ферменты ПЦР, были получены на коммерческой основе и использовались в соответствии с инструкциями производителей.

Экстракция нуклеиновых кислот
Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с помощью набора для экстракции магнитными шариками и полностью автоматического инструмента для экстракции нуклеиновых кислот. Стандартная процедура включала добавление 200 мкл образца и 20 мкл протеиназы К в колонку 1 или 7 предварительно упакованного глубоколуночного планшета. Затем в колонку 2 или 8 добавляли 15 мкл магнитных шариков, поставляемых в комплекте. Программа экстракции была запущена на приборе, при этом магнитная втулка была помещена в назначенное место. После экстракции жидкость из колонки 6 или 12 переносили в новую безнуклеазную пробирку объемом 1,5 мл и хранили при температуре -20 °С.

Для оптимизации экстракции низкоконцентрированных целевых нуклеиновых кислот были проведены эксперименты по оптимизации. Рекомендуемыми параметрами экстракции были: температура лизиса 70 °C, время лизиса 10 мин, 1 мин для каждого из трех моющих растворов, 2 мин сушки и 3 мин элюирование при 56 °C. Наиболее влиятельные параметры были систематически оптимизированы: температура лизиса (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C и 78 °C), время лизиса (1, 3, 5, 7 и 9 мин) и размер магнитных шариков (100 нм, 200 нм, 300 нм, 400 нм, 500 нм и 1000 нм). Эти оптимизации были выполнены с использованием мутантной плазмиды T790M в концентрации 1 × 105 копий/мкл. Магнитные шарики с длиной волны 100 нм поставлялись в комплекте с экстракционным набором, в то время как частицы других размеров были получены от биотехнологической компании. Эффективность каждого условия экстракции оценивали путем анализа кривых амплификации количественной ПЦР и значений Ct экстрагированных образцов. Статистический анализ этих результатов был выполнен с помощью статистического программного обеспечения.

Стандартная плазмидная ДНК
Мутантная плазмида T790M гена EGFR была специально синтезирована биотехнологической компанией. Четыре микрограмма сухого плазмидного порошка были ресуспендированы в 100 мкл 1x TE буфера. Концентрацию плазмид определяли с помощью спектрофотометра. Количество копий на микролитр рассчитывали по формуле: Число копий/мкл = [(6,02 × 1023) × (концентрация ДНК (нг/мкл) × 10-9)] / (длина ДНК в парах оснований × 660). Концентрация синтезированного фрагмента составила 1,26 × 109 копий/мкл. Затем эту исходную плазмиду разбавляли в 126 раз с получением рабочей концентрации 1 ×10-8 копий/мкл.

Проектирование и синтез грунтовки
Праймеры и зонд TaqMan для мутации EGFR T790M были разработаны с использованием праймера 6 на основе стандартных принципов проектирования праймеров. Грунтовка для разведки и добычи: 5'-CCTCACCTCCACCGTGC-3'; Последующая грунтовка24: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Зонд: 5'-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3'. Все праймеры и зонды были синтезированы с помощью коммерческой службы синтеза олигонуклеотидов.

Создание и оптимизация системы количественного обнаружения флуоресценции ddPCR и TaqMan
Плазмидный материал T790M в концентрации 1 × 108 копий/мкл разбавляли до 1 × 106 копий/мкл с использованием буфера 1× TE для использования в экспериментах по оптимизации систем ddPCR и qPCR.

Оптимизация системы ddPCR: Система ddPCR была оптимизирована на основе рекомендаций производителя фермента. Первоначально рекомендованная система включала: 7,5 мкл 4-кратной смеси для ПЦР, 1,2-3 мкл предварительного праймера (10 мкМ), 1,2-3 мкл нисходящего праймера (10 мкМ), 0,3-1,8 мкл зонда (10 мкМ), 1-15 мкл матрицы ДНК и воду без нуклеаз до конечного объема 30 мкл. Рекомендуемый цикл амплификации включал начальные 10 мин при 95°С, за которыми следовали 40 циклов по 30 с при 94°С и 60 с при 55-65°С. Систематически оптимизирули температуру отжига (55-61,8 °C), концентрацию праймера (1-3 мкл), концентрацию зонда (0,75-1,75 мкл) и концентрацию матрицы (3-15 мкл). Результаты оптимизации были статистически проанализированы с помощью статистического программного обеспечения.

Оптимизация системы количественной ПЦР: Система количественной ПЦР была оптимизирована в соответствии с рекомендациями производителя ферментов. Первоначально предложенная система включала: 5 мкл Taq-полимеразы, 0,45 мкл 250 мМ MgCl2, 0,5-2,5 мкл прямого праймера (10 мкМ), 0,5-2,5 мкл обратного праймера (10 мкМ), 0,5-2,5 мкл зонда (10 мкМ), 5 мкл образца ДНК и воду, не содержащую нуклеаз, до конечного объема 25 мкл. Рекомендуемая программа амплификации составляла 5 мин при 95°С; затем 45 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 56-64 °C, с сбором флуоресценции при 56-64 °C. Оптимизировали температуру отжига (56-64 °С), концентрацию праймера (1-3 мкл), концентрацию зонда (0,5-2,5 мкл) и концентрацию матрицы (1-5 мкл). Статистический анализ этих результатов был выполнен с помощью статистического программного обеспечения.

ddPCR и флуоресцентный количественный тест чувствительности ПЦР Taqman
Для оценки чувствительности ddPCR по сравнению с qPCR плазмиду T790M в 1 × 108 копий/мкл последовательно разбавляли в 10 раз с использованием 1x TE Buffer для создания градиента концентрации в диапазоне от 106 до 101 копий/мкл. Для ddPCR было приготовлено семь реакционных растворов в соответствии с оптимизированной системой ddPCR, по одному для каждой концентрации, включая отрицательный контроль. Образцы загружали на чип генератора микрокапель и обрабатывали с помощью прибора для генерации капель для генерации микрокапель. Затем эти капли амплифицировали с помощью термоамплификатора ПЦР, а затем анализировали с помощью цифрового прибора для обнаружения ПЦР. Одновременно было подготовлено семь реакционных решений на основе оптимизированной системы количественной ПЦР с идентичными шаблонами. Они были проведены с помощью ПЦР-инструмента в реальном времени для оценки соответствующей чувствительности двух подходов (n = 3).

Тесты на повторяемость ddPCR
Для оценки повторяемости стандартную плазмидную ДНК T790M в концентрации 1 × 108 копий/мкл разбавляли для получения высоких (1 × 106 копий/мкл), средних (1 × 104 копий/мкл) и низких (1 × 102 копий/мкл) концентраций. Шесть реакционных растворов были приготовлены в соответствии с оптимизированной системой ddPCR. Образцы загружали на чип генератора микрокапель и обрабатывали с помощью прибора для генерации капель с образованием микрокапель. Затем микрокапли амплифицировали с помощью термоамплификатора и анализировали с помощью цифрового прибора для обнаружения ПЦР. Был включен отрицательный контроль. Эксперимент проводили в трех экземплярах. Воспроизводимость оценивали путем сравнения профилей амплификации и расчета значений коэффициента вариации (CV) из трех экспериментальных реплик.

Тестирование аналоговых образцов
С целью проверки надежности систем ddPCR и qPCR с мутацией T790M мы использовали кровь свиней, случайным образом смешанную с высокими и низкими концентрациями стандартных плазмид мутации T790M соответственно, а кровь свиней без смешанных стандартных плазмид использовали в качестве отрицательных образцов, и случайным образом готовили 15 смоделированных образцов, а из моделируемых образцов экстрагировали нуклеиновую кислоту. и обнаруживается с помощью методов ddPCR и qPCR соответственно.

Статистический анализ
Все эксперименты проводились как минимум в трех технических повторах. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10. Различия между группами анализировались с использованием t-критерия Стьюдента или одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) в зависимости от ситуации. p-значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимизация экстракции нуклеиновых кислот
Рабочий процесс на основе ddPCR для выявления мутации EGFR T790M схематически обобщен на рисунке 1. Во-первых, мы определили оптимальную температуру лизиса. Как показано на рисунке 2A, температура спайности 66 °C дала наименьшее среднее значение Ct, что указывает на наиболее эффективное спайность. Поэтому для последующих экспериментов была выбрана температура 66 °C. Затем мы оптимизировали время лизис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Рак легких, являясь основной причиной смертности от рака во всем мире, всегда был в центре внимания медицинских исследований. В этом исследовании мы изучаем несколько критических аспектов рака легких, стремясь обеспечить более глубокое понимание его диагностики, лечения и прогноза. Краеугольным камнем точной диагностики и лечения рака легких является точное генетическое тестирование. Как показали Zhao et al.25, традиционное генетическое тестирование в значительной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Совместный специальный проект Департамента науки и технологий провинции Юньнань и Куньминского медицинского университета, 202101AY070001-134

ВКЛАД АВТОРА
Юмин Лэй и Гуоли Лю внесли равный вклад в эту работу и являются соавторами. Юмин Лэй и Гуоли Лю задумали и спроектировали кабинет. Цинмэй Ян внес свой вклад в сбор и анализ данных. Цзинь Дуань и Юньфэй Ши руководили анализом и интерпретацией данных, отредактировали рукопись и утвердили окончательную версию для публикации. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1&раз; TE BufferSangon BiotechB548144Трис-ЭДТА буфер используется для разведения ДНК
в 4 раза; Смесь ферментов Unimix-UTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR смесь ферментов
A300 Fast Thermal CyclerLongGeneA300ПЦР амплификация
Анализатор биочиповSEED BioDigitalPCR-BiochipDetection system for digital PCR
Drop Marker Инструмент для подготовки образцовXinyi BiotechnologyЦифровая платформа ПЦР TD-2Приготовление микрокапель
Набор для экстракции нуклеиновых кислот с магнитными шарикамиLemnisCare TechnologyMXP-1005Чип
для генерации микрокапельTargetingOne BiotechMG-Chip-01Используется для генерации микрокапель для ddPCR
NanoDropAllshengNC-500Измерение концентрации нуклеиновых кислот после экстракции образца
NanoDrop ND-500 спектрофотометрAllsheng ПриборыND-500Спектрофотометр для количественного определения ДНК
ПЦР прибор A300 Быстрый термоамплификаторLongGeneA300Термоамплификатор для ПЦР амплификации
Праймеры и зонд TaqManSangon BiotechСпециально синтезированныепраймеры и зонд TaqMan для обнаружения T790M
кПЦР прибор Gentier miniTianlong TechnologyGentier miniReal-time PCR инструмент
T790M мутация плазмидыTsingke биологияT790Mстандартная кривая и предельный тест обнаружения

Ссылки

  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EGFRT790MEGFR
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи