Методическая статья

Простой протокол выделения и культивирования гепатоцитов у мышей MASLD

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68782

⸱

18 июля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании разработан стандартизированный протокол выделения первичных гепатоцитов от мышей со стеатотической болезнью печени (MASLD), связанной с метаболической дисфункцией, что позволяет проводить исследования стеатоза и метаболической дисфункции без искусственной липидной нагрузки. Метод позволяет получить высокопродуктивные и жизнеспособные гепатоциты, пригодные для механистических и терапевтических исследований.

Аннотация

Стеатотическая болезнь печени, связанная с метаболической дисфункцией (MASLD), характеризующаяся патологическим накоплением липидов (стеатозом) в гепатоцитах, представляет собой значительную и растущую глобальную нагрузку на здоровье. Первичные культуры гепатоцитов мышей служат незаменимыми моделями ex vivo для выяснения патогенеза MASLD и терапевтических вмешательств. Тем не менее, надежное выделение высококачественных гепатоцитов из стеатозной печени остается технически сложной задачей. Здесь мы представляем простой протокол для эффективного выделения первичных гепатоцитов у мышей MASLD с использованием техники перфузии коллагеназы. Этот протокол генерирует гепатоциты, проявляющие врожденный стеатоз, не требуя искусственной индукции с помощью добавок пальмитата и олеиновой кислоты, тем самым сохраняя более физиологически значимый фенотип. Протокол позволяет получить высокожизнеспособные и высокочистые гепатоциты и универсально применим для выделения большого количества гепатоцитов у мышей MASLD. Кроме того, он подходит для фармакологической оценки или генетических интервенционных исследований. Таким образом, мы предоставляем воспроизводимый протокол для выделения высокопродуктивных, высокочистых и высокожизнеспособных гепатоцитов для последующих клеточных биологических исследований, чтобы облегчить открытие новых терапевтических мишеней и препаратов для MASLD.

Введение

Стеатозное заболевание печени, ассоциированное с метаболической дисфункцией (MASLD), характеризуется патологическим накоплением липидов в гепатоцитах и представляет собой наиболее распространенное хроническое заболевание печени во всем мире1. По оценкам, MASLD затрагивает 38% взрослого населения мира и стала значительной угрозой для здоровья человека2. Механизмы MASLD до конца не выяснены, а варианты лечения очень ограничены. Открытие новых терапевтических мишеней и разработка таргетных агентов для MASLD стали важнейшей клинической необходимостью. Гепатоциты, как преобладающий тип клеток, составляющих печень, являются основным местом метаболизма глюкозы, липидов и лекарств в печени. Первичные гепатоциты сохраняют более полную функцию гепатоцитов, чем клеточные линии гепатоцитов, и являются полезным инструментом для изучения механизмов заболевания печении разработки лекарств. Выделение и культивирование первичных гепатоцитов у мышей с жировой дистрофией печени является фундаментальным методом изучения патофизиологии печени, включая липидный обмен, инсулинорезистентность и воспалительные реакции. В предыдущем протоколе, разработанном для выделения гепатоцитов из мышиных моделей жировой болезни печени, использовалось градиентное центрифугирование, чтобы обеспечить разделение как нормальных, так и накапливающих липиды популяций гепатоцитов. Таким образом, эти изолированные гепатоциты, насыщенные липидами, представляют собой важнейшую модельную систему in vitro для исследования патобиологии жировой болезни печени3. Основной целью этого подхода является простое и экономичное получение высокожизнеспособных и высокопродуктивных гепатоцитов, которые сохраняют специфические для заболевания фенотипические характеристики и, таким образом, способны имитировать MASLD in vitro.

Общая процедура выделения гепатоцитов у мышей состоит из двух этапов, которые начинаются с промывки крови из печени изотоническим раствором перфузии, таким как сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), а затем переваривание печени с использованием раствора для пищеварения, содержащего коллагеназу. Последние достижения в области перфузии печени и методов ферментативного переваривания улучшили выход и жизнеспособность первичных гепатоцитов у самок мышей4. Усовершенствования традиционных двухступенчатых методов перфузии коллагеназы, такие как оптимизация состава буфера и сокращение времени переваривания, сыграли решающую роль в адаптации экспериментальных протоколов к образцам жировой дистрофии печени. Первичные гепатоциты служат незаменимыми моделями для выяснения патофизиологических механизмов, лежащих в основе MASLD и его кардиометаболических осложнений, в частности, через их роль в опосредовании перекрестных помех между сердцем и печенью и взаимодействием между осью печень и сосуды через эндотелиальные медиаторы и ангиогенные факторы 5,6. Эти клетки обеспечивают критически важную информацию о мультиорганных коммуникационных сетях, способствующих прогрессированию заболевания, о чем свидетельствуют клинические ассоциации между MASLD, хронической болезнью почек и ишемической болезнью сердца7, предлагая при этом физиологически значимую платформу для разработки таргетной терапии, направленной на лечение как печеночных, так и сердечно-сосудистых проявлений метаболического синдрома. Современные исследования MASLD in vitro преимущественно опираются на стимулированные пальмитиновой/олеиновой кислотой (PA/OA) нормальные гепатоциты или клеточные линии гепатоцитов человека (например, HepG2 и Huh7), которые неадекватно воспроизводят патофизиологические особенности стеатотических гепатоцитов в болезненных условиях, ограничивая их трансляционную значимость для изучения взаимодействия сердца, печени и сосудов. Этот подход не учитывает хроническую метаболическую дисфункцию, воспалительное микроокружение и специфические для заболевания межорганные перекрестные помехи, характерные для прогрессирования MASLD.

Этот протокол может быть использован для выделения гепатоцитов у мышей MASLD без необходимости искусственного добавления препаратов пальмитиновой и олеиновой кислотой. В заключение мы представляем простой и воспроизводимый метод получения высокопродуктивных гепатоцитов с превосходной жизнеспособностью, который подходит для последующих исследований клеточной биологии с целью поддержки открытия новых терапевтических мишеней и разработки лекарств для MASLD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные этапы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете науки и технологии Китая. Самцы мышей C57BL/6J получали пищу с высоким содержанием жиров (HFD, #12492, Research Diet) в течение более 12 недель в этом исследовании.

1. Подготовка планшета или чашки для культуры с коллагеновым покрытием

  1. Добавьте 15 мл 100% EtOH к 35 мл дважды дистиллированного H2O (ddH2O). Приготовьте раствор коллагена I типа 50 мкг/мл в 30% EtOH. Фильтр со стерильным наконечником 0,22 мкм.
  2. Нанесите на планшет или чашку для клеточной культуры 30 мкл раствора коллагена на см2 . Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
  3. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки и высушите культуральную тарелку или чашку. Облучайте покрытую покрытием посуду ультрафиолетовым светом в течение 0,5 ч для стерилизации. Хранить при температуре 4 °C менее 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волны УФ-лампы составляет 254 нм, а интенсивность УФ-излучения – не менее 400 мВт/м2. Расстояние от источника УФ-лампы от посуды, покрытой коллагеном, составляет 1 м.

2. Приготовление перфузионного раствора

  1. За несколько дней до выделения гепатоцитов готовят реагенты для выделения гепатоцитов и питательные среды, указанные в таблице 1. Фильтрующий перфузионный раствор А и В со стерильным фильтрующим наконечником 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C менее 1 месяца. Приготовьте водяную баню и установите температуру 37 °C.
  2. Предварительно разогрейте перфузионные растворы А и В на водяной бане при 37 °С. Добавьте 40 мг коллагеназы IV типа к 80 мл перфузионного раствора В перед операцией.
  3. Откачайте 75% EtOH со скоростью 4 мл/мин в течение 5 мин с помощью перистальтического насоса на RT. Переключите трубки насоса с 75% EtOH на предварительно нагретый перфузионный раствор А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите нагретый циркуляционный заправочный блок в соответствии с конфигурацией, показанной на рисунке 1A.

3. Хирургическое вмешательство

  1. Обезболите мышь утвержденным методом. Введите пентобарбитал натрия (50 мг/кг) внутрибрюшинно. Прежде чем продолжить, проверьте потерю поворотного рефлекса.
  2. Закрепите верхние и нижние конечности мыши на доске для вскрытия. Простерилизуйте операционную область 75% спиртом.
  3. Разрежьте внутреннюю и наружную оболочки брюшной полости с помощью инструментов для вскрытия. Поверните висцеральные органы на левый бок мыши с помощью ватного тампона, чтобы обнажить нижнюю полую вену (IVC) и воротную вену печени (PV).
  4. Прижмите нижнюю полую вену ватным тампоном, чтобы выпячивать ее. Введите иглу 22-G параллельно нижней полой вене.
  5. Извлеките железную часть из постоянной иглы. Оставьте катетер в нижней полой вене. Подсоедините иглу к перфузионной линии с помощью фильтрующего наконечника 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Игла для постоянного проживания состоит из железной иглы и пластиковой части катетера. Обеспечьте точное введение в нижнюю полую вену и подождите, пока игла заполнится кровью. Избавьтесь от всех пузырьков воздуха от постоянной иглы. Завершите всю процедуру быстро, чтобы избежать тромбоза.
  6. Установите скорость перфузии на 5 мл/мин перфузионной жидкости A. Начните перфузию и наблюдайте за печенью до тех пор, пока она не станет опухшей. Немедленно отрежьте воротную вену.
  7. Аккуратно помассируйте печень с помощью ватного тампона, чтобы обеспечить тщательное промывание крови. Продолжайте перфузию до тех пор, пока печень не станет землисто-желтой.
  8. Переключитесь на перфузионную жидкость В, содержащую 0,05% коллагеназы IV типа. Продолжайте перфузию до тех пор, пока печень полностью не переварится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для переваривания печени каждой мыши требуется не менее 10 минут. Объема 80 мл перфузионного раствора В, содержащего коллагеназу, достаточно для того, чтобы одна мышь переварила ее печень. Печеночная ткань подвергается полному ферментативному расщеплению до достижения максимального размягчения, при этом заключенная в капсулу паренхима достигает состояния крайней хрупкости, подверженной механическому разрушению.
  9. Удалите печень из брюшной полости мыши. Поместите печень в посуду диаметром 10 см с ДМЭМ.
  10. Действуйте в шкафу биобезопасности. Измельчите печень в порошок с помощью пинцета (хорошо переваренная печень легко высвобождает гепатоциты).
  11. Отфильтруйте суспензию через сетчатый фильтр 70 мкм в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Отрегулируйте объем до 45 мл (на мышь) с помощью DMEM medium.
  12. Центрифуга при 50 × г в течение 4 мин. Слейте надосадочную жидкость полностью.
  13. Повторно суспендируйте гранулу средой DMEM до конечного объема 25 мл (на мышь). Снова центрифугируйте при 50 × г в течение 2 мин.
  14. Слейте надосадочную жидкость полностью. Ресуспендировать гранулу в 25 мл питательной среды с добавлением 10% FBS.
  15. Тщательно перемешайте суспензию. Окрасьте ячейки Трипаном синим для подсчета. Приступайте к прививке для культуры немедленно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите 2 мл среды, содержащей 2 × 105 клеток, на лунку в 6-луночные чашки, покрытые коллагеном. Замените среду DMEM через 2 ч после инокуляции клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Текущий протокол был реализован на самцах мышей C57BL/6J, получавших HFD в течение более 12 недель. Выделенные первичные гепатоциты были исследованы на предмет морфологии и функции. Мы получили средний выход 2 ×10-7 клеток на изоляцию примерно из 40 г печени мыши. Жизнеспособность клеток была определена на уровне 85%-86% путем окрашивания живых клеток кальцеином AM. Выход из каждой изоляции мышей с ожирением, вызванным диетой (DIO), был достаточен для посева 15 стандартных 6-лу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выделение жизнеспособных гепатоцитов мышей включает в себя важнейшую двухэтапную процедуру, начинающуюся с тщательной перфузии сосудов с использованием изотонического раствора для удаления компонентов крови с последующим контролируемым ферментативным перевариванием с помощью активного раствора коллагеназы 9,10. Успешное выделение зависит от поддержания оптимальных физиологических условий на протяжении всего процесса, в частности ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщали о потенциальном конфликте интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая [No 82373967].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
50 мл стерильные центрифужные пробиркиNest602052
анти-HNF4&альфа; антителоImmunowayYM8517
антитело против IgG Proteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
ЦентрифугаThermo Sorvall ST16R
Коллаген типа I Corning354236
коллагеназа, тип 4Sangon BiotechA004186-0001
Задерживающая иглаBRAUN4254074B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
ЭтанолMerck (SigmaAldrich)493511
Фетальная бычья сывороткаSigmaF2442
ГлюкозаMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
Игольчатый фильтр 0.22&микро; MMillex-GPSLGV033RB
NileRed InvitrogenN1142
пенициллин/стрептомицин (100X)Gibco15140122
рекомбинантный аденовирусObio Technology Corp., ltd. Рекомбинантные аденовирусы, кодирующие меченые флагом мыши IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) и контрольный аденовирус (Ad-NC), были созданы компанией Obio Technology Corp., ltd.
Пентобарбитал натрияMerck (SigmaAldrich)P3761
Стерильные клеточные фильтры, 100 мкм; mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Перистальтический насос с переменным расходомLongerBT100-1F

Ссылки

  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex vivo
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи