В этом исследовании разработан стандартизированный протокол выделения первичных гепатоцитов от мышей со стеатотической болезнью печени (MASLD), связанной с метаболической дисфункцией, что позволяет проводить исследования стеатоза и метаболической дисфункции без искусственной липидной нагрузки. Метод позволяет получить высокопродуктивные и жизнеспособные гепатоциты, пригодные для механистических и терапевтических исследований.
Методическая статья
Простой протокол выделения и культивирования гепатоцитов у мышей MASLD
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стеатотическая болезнь печени, связанная с метаболической дисфункцией (MASLD), характеризующаяся патологическим накоплением липидов (стеатозом) в гепатоцитах, представляет собой значительную и растущую глобальную нагрузку на здоровье. Первичные культуры гепатоцитов мышей служат незаменимыми моделями ex vivo для выяснения патогенеза MASLD и терапевтических вмешательств. Тем не менее, надежное выделение высококачественных гепатоцитов из стеатозной печени остается технически сложной задачей. Здесь мы представляем простой протокол для эффективного выделения первичных гепатоцитов у мышей MASLD с использованием техники перфузии коллагеназы. Этот протокол генерирует гепатоциты, проявляющие врожденный стеатоз, не требуя искусственной индукции с помощью добавок пальмитата и олеиновой кислоты, тем самым сохраняя более физиологически значимый фенотип. Протокол позволяет получить высокожизнеспособные и высокочистые гепатоциты и универсально применим для выделения большого количества гепатоцитов у мышей MASLD. Кроме того, он подходит для фармакологической оценки или генетических интервенционных исследований. Таким образом, мы предоставляем воспроизводимый протокол для выделения высокопродуктивных, высокочистых и высокожизнеспособных гепатоцитов для последующих клеточных биологических исследований, чтобы облегчить открытие новых терапевтических мишеней и препаратов для MASLD.
Введение
Стеатозное заболевание печени, ассоциированное с метаболической дисфункцией (MASLD), характеризуется патологическим накоплением липидов в гепатоцитах и представляет собой наиболее распространенное хроническое заболевание печени во всем мире1. По оценкам, MASLD затрагивает 38% взрослого населения мира и стала значительной угрозой для здоровья человека2. Механизмы MASLD до конца не выяснены, а варианты лечения очень ограничены. Открытие новых терапевтических мишеней и разработка таргетных агентов для MASLD стали важнейшей клинической необходимостью. Гепатоциты, как преобладающий тип клеток....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные этапы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете науки и технологии Китая. Самцы мышей C57BL/6J получали пищу с высоким содержанием жиров (HFD, #12492, Research Diet) в течение более 12 недель в этом исследовании.
1. Подготовка планшета или чашки для культуры с коллагеновым покрытием
- Добавьте 15 мл 100% EtOH к 35 мл дважды дистиллированного H2O (ddH2O). Приготовьте раствор коллагена I типа 50 мкг/мл в 30% EtOH. Фильтр со стерильным наконечником 0,22 мкм.
- Нанесит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Текущий протокол был реализован на самцах мышей C57BL/6J, получавших HFD в течение более 12 недель. Выделенные первичные гепатоциты были исследованы на предмет морфологии и функции. Мы получили средний выход 2 ×10-7 клеток на изоляцию примерно из 40 г печени мыши. Жизнеспособность клеток была определена на уровне 85%-86% путем окрашивания живых клеток кальцеином AM. Выход из каждой изоляции мышей с ожирением, вызванным диетой (DIO), был достаточен для посева 15 стандартных 6-лу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выделение жизнеспособных гепатоцитов мышей включает в себя важнейшую двухэтапную процедуру, начинающуюся с тщательной перфузии сосудов с использованием изотонического раствора для удаления компонентов крови с последующим контролируемым ферментативным перевариванием с помощью активного раствора коллагеназы 9,10. Успешное выделение зависит от поддержания оптимальных физиологических условий на протяжении всего процесса, в частности .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не сообщали о потенциальном конфликте интересов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая [No 82373967].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 50 мл стерильные центрифужные пробирки | Nest | 602052 | |
| анти-HNF4&альфа; антитело | Immunoway | YM8517 | |
| антитело против IgG Proteintech | 30000-0-AP | ||
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| Центрифуга | Thermo | Sorvall ST16R | |
| Коллаген типа I | Corning | 354236 | |
| коллагеназа, тип 4 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| Задерживающая игла | BRAUN | 4254074B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| Этанол | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma | F2442 | |
| Глюкоза | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Isoginkgetin | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 · 12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| Игольчатый фильтр 0.22&микро; M | Millex-GP | SLGV033RB | |
| Nile | Red Invitrogen | N1142 | |
| пенициллин/стрептомицин (100X) | Gibco | 15140122 | |
| рекомбинантный аденовирус | Obio Technology Corp., ltd. | Рекомбинантные аденовирусы, кодирующие меченые флагом мыши IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) и контрольный аденовирус (Ad-NC), были созданы компанией Obio Technology Corp., ltd. | |
| Пентобарбитал натрия | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| Стерильные клеточные фильтры, 100 мкм; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Trypan Blue | Beyotime | ST2780-5g | |
| Перистальтический насос с переменным расходом | Longer | BT100-1F |
Ссылки
- Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
- Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
- Jung, Y., Zh....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеТеги
