Method Article

Обновленный протокол сборки и использования минибиореакторной решетки (МБР)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Массив минибиореакторов (MBRA) — это высокопроизводительная, настраиваемая система культивирования с непрерывным потоком, которая позволяет культивировать сложные микробные сообщества, поддерживая параллельные эксперименты по изучению динамики микробиома, терапевтических взаимодействий и реакции микроорганизмов на факторы окружающей среды.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробиом человека включает в себя разнообразные и динамичные микробные сообщества, которые играют важную роль в здоровье хозяина. Понимание этих сообществ и их реакции на факторы окружающей среды имеет решающее значение для развития терапии на основе микробиома. Традиционные модели in vitro для культивирования микробиоты, полученной от человека, часто не обладают масштабируемостью и требуют обширных технических знаний, что ограничивает их доступность и пропускную способность. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали систему Minibioreactor Array (MBRA) — модульную, одноступенчатую платформу с непрерывным потоком для высокопроизводительного культивирования микробных сообществ. Эта система позволяет параллельно культивировать до 48 различных микробных сообществ, поддерживая экспериментальную гибкость при сохранении стабильного роста сложных экосистем. Этот протокол содержит подробные рекомендации по изготовлению, сборке, стерилизации и эксплуатации MBRA. Модульная конструкция системы обеспечивает простую интеграцию в анаэробные камеры и позволяет адаптировать ее к широкому спектру экспериментальных применений. Он использовался для изучения реакции микроорганизмов на антибиотики, пищевые соединения и инвазию патогенов, а также для скрининга сообществ, устойчивых к патогенам. Благодаря своей доступности, масштабируемости и воспроизводимости, MBRA представляет собой мощную модельную систему для изучения микробных взаимодействий и продвижения исследований микробиома.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробиом человека представляет собой сложную экосистему микроорганизмов, которая играет важнейшую роль во многих физиологических процессах и оказывает глубокое влияние на здоровье человека. Микробиом человека охватывает множество анатомических участков по всему нашему телу, каждый из которых содержит динамичные микробные сообщества, активно взаимодействующие способами, которые нам еще предстоит полностью понять1. Расширение наших знаний об участии микробных сообществ в здоровье и болезнях зависит от нашего понимания микробных взаимодействий, происходящих в этих средах1. Для эффективного изучения и манипулирования этими сложными системами в терапевтических целях необходим редукционистский подход. Изучение отдельных микробных взаимодействий с использованием упрощенных модельных систем способствует лучшему пониманию всей сложности микробиома2.

Существует широкий спектр модельных систем для выращивания микробных сообществ, полученных от человека. Эти системы углубили наше понимание микробных сообществ, связанных с человеком, и варьируются от одноступенчатого периодического культивирования до более сложных многоступенчатых систем непрерывного потока. Модельные системы, такие как Симулятор кишечной микробной экосистемы человека3, Двухсосудистая одноступенчатая система хемостата4 и Система контроля окружающей среды для кишечной микробиоты5 , воспроизводят физиологические условия конкретных анатомических участков и обеспечивают близкое приближение микробной среды in vitro . Тем не менее, их применение микробиологами ограничено, поскольку они дорогостоящие, требуют высокого уровня технических знаний для эксплуатации и обслуживания, а также имеют ограниченную пропускную способность.

Для решения этих проблем мы разработали систему Minibioreactor Array (MBRA) – одноступенчатую систему культивирования с непрерывным потоком, предназначенную для обеспечения стабильного роста микробных сообществ из различных источников в контролируемой среде 6,7,8. Система MBRA отличается от других моделей кишечника простотой сборки и эксплуатации в сочетании с высокой пропускной способностью, которая позволяет одновременно культивировать несколько микробных сообществ, повышая эффективность эксперимента. Кроме того, простая и компактная природа этой системы позволяет использовать ее в анаэробных и микрокислородных камерах, чтобы способствовать росту бактерий из анаэробных и гипоксических зон, таких как желудочно-кишечный тракт и вагинальный тракт. Универсальный характер этой системы был использован для скрининга желудочно-кишечныхсообществ, устойчивых к Clostridioides difficile9, а также для тестирования влияния антибиотиков10,11 и пищевых субстратов12 на микробные сообщества.

MBRA изготавливаются с помощью 3D-печати или аддитивного производства, при этом при выборе материалов приоритет отдается прозрачности и водостойкости (информацию о полимерах см. в Таблице материалов ). Каждый массив состоит из шести отдельных камер, оснащенных портами для импорта среды, вывоза отходов и сбора образцов. Свежая среда непрерывно подается в систему, в то время как отходы удаляются одновременно, при этом скорость потока точно контролируется двумя перистальтическими насосами. Содержимое системы постоянно перемешивается с помощью перемешивающих стержней и 60-точечной перемешивающей пластины для обеспечения однородности культур. Описанный здесь протокол оптимизирован для рабочего объема 15 мл на камеру, хотя каждый биореактор может вмещать диапазон от 1 до 20 мл в зависимости от экспериментальных требований. Перистальтический насос и насосные трубки могут выдерживать расход в диапазоне от 0,016 до 2,9 мл/мин, что соответствует скорости оборота примерно от 15,63 до 0,09 ч соответственно. Несмотря на то, что система совместима с широким спектром составов сред и диетических или питательных добавок, необходимо учитывать некоторые практические соображения: высоковязкие среды могут потребовать повторной калибровки расхода, а присутствие нерастворенных частиц или нерастворимых компонентов может засорить трубки насоса или узкие соединители, особенно при более низких скоростях потока. Модульность системы позволяет быстро и легко адаптировать эксперименты путем регулировки выбора среды, сбора образцов, скорости потока и рабочего объема. В сочетании с четырьмя 24-канальными перистальтическими насосами и двумя 60-точечными мешалками система может запускать 48 отдельных камер за эксперимент в одной анаэробной камере, поддерживая высокопроизводительный анаэробный скрининг.

Данный протокол служит наглядным руководством и обновленной версией ранее опубликованного метода сборки и эксплуатации MBRA, разработанного нашей лабораторией4. Несколько ключевых улучшений были включены для повышения воспроизводимости, оптимизации рабочего процесса и минимизации загрязнения. Во-первых, соломинки из ПТФЭ теперь подвергаются химическому травлению, чтобы предотвратить их отсоединение и попадание в камеры биореактора. Во-вторых, в линии подачи была добавлена соломинка для фильтрующего материала, которая направляет поток материала в нижнюю часть камер, предотвращая стекание абразива по стенкам камеры. Это был известный источник образования биопленки. В-третьих, длина трубок C-flex была стандартизирована и сокращена, а держатель трубки, напечатанный на 3D-принтере, был разработан для создания более компактной и организованной конфигурации. Наконец, биореакторы больше не полностью разбираются между каждым использованием, что значительно сокращает время и материальные затраты, связанные с повторными экспериментами. Эти и другие постепенные усовершенствования отражают итеративную оптимизацию, основанную на широком использовании системы в нескольких проектах в нашей лаборатории.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для подготовки и сборки одной полоски MBRA (Рисунок 1). Каждая MBRA состоит из напечатанного на 3D-принтере биореактора, трубки для облегчения притока питательной среды и трубки для облегчения оттока отходов из камер биореактора. Полный список деталей, составляющих одну MBRA, включая изображения, можно найти в таблице 1. Дополнительное необходимое оборудование включает в себя два перистальтических насоса и мешалку (характеристики устройства см. в Таблице материалов ).

1. Подготовка к сборке

  1. Травление политетрафторэтилена (ПТФЭ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как химические свойства ПТФЭ делают его идеальным для использования в этой системе MBRA, его смазывающая способность делает невозможным сцепление с другими частями биореактора с использованием только эпоксидной смолы. Чтобы закрепить трубку из ПТФЭ в резьбовом люэре с наружной резьбой, ее необходимо сначала химически вытравить, чтобы обеспечить сцепление эпоксидной смолы. Используется флюорокарбоновый травитель (см. Таблицу материалов). Рисунок 2A служит визуальным руководством по обклеиванию трубок из ПТФЭ для облегчения этого процесса травления.
    1. Отрежьте двенадцать трубок из ПТФЭ длиной 25 мм. Шесть из них будут разрезаны пополам после травления, чтобы они служили соломинками для линий подачи («соломинка для среды»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Травлению подлежит только склеиваемая секция. Чтобы предотвратить травление внутренней поверхности и нежелательных участков, трубка должна быть заклеена лентой и герметизирована с обоих концов.
    2. С помощью лабораторной маркировочной ленты общего назначения (ширина 19 мм) полностью оберните ленту сверху, покрывая ~5 мм трубки из ПТФЭ (Рисунок 2A). Наклейте еще один участок ленты вокруг дна, охватывающий ~10 мм трубки из ПТФЭ (Рисунок 2A).
    3. Сильно зажмите концы ленты, чтобы раствор для травления не попал внутрь фторопласта (Рисунок 2A). Это должно оставить ~10 мм трубки из ПТФЭ открытыми для травления.
    4. Приготовьте четыре раствора: раствор фторуглеродного травителя, нагретый до 55 °C (подробную информацию о растворе фторуглеродного травителя см. в Таблице материалов ), 100% этанол (EtOH), дистиллированный H2O, нагретый до 70 °C, и дистиллированный H2O + 2-5% уксусной кислоты, нагретый до 70 °C.
      ВНИМАНИЕ: Раствор фторуглеродного травителя обладает высокой коррозионной активностью. Выполняйте все действия в вытяжном шкафу с СИЗ. Утилизируйте химические вещества в соответствии с институциональными рекомендациями.
    5. Нагрейте все растворы до температур, указанных в пункте 1.1.4. Раствор фторуглеродного травителя следует нагревать на водяной бане, другие растворы можно нагревать на горячей плите. Налейте растворы в 4 отдельные стеклянные емкости на глубину, достаточную для полного погружения трубки с лентой.
    6. Погрузите все трубки из ПТФЭ в раствор фторуглеродного травителя. Закрутите для обеспечения равномерного воздействия на поверхность. Замочите на 1 минуту, пока протравленная поверхность не станет коричневой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Металлическая ложка для фильтра скиммера может использоваться для переноса трубок из ПТФЭ между растворами.
    7. Перенесите трубку в ванну EtOH на 5-20 с.
    8. Переведите трубку в ванну 70 °C H20 на 15-30 с.
    9. Переведите трубку в ванну с уксусной кислотой 70 °C20 + 2-5% на 1 минуту.
    10. Снимите трубку и положите на абсорбирующую прокладку внутри вытяжного шкафа. Дайте травленой трубке высохнуть в течение ночи (не менее 16 часов). После высыхания снимите ленту с протравленной трубки.
    11. Протравленный ПТФЭ готов к склеиванию и остается пригодным для склеивания в течение нескольких месяцев при хранении при комнатной температуре. Как только коричневая окраска на поверхностях травления исчезает, она больше не склеивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте травленый ПТФЭ воздействию ультрафиолетового света, так как это приведет к ухудшению травления.
    12. Разрежьте пополам 6 травленых трубок из ПТФЭ, которые будут служить соломинками для линий подачи (Рисунок 2A).
  2. Эпоксидные отходы и соломинки для сред
    1. Вставьте каждую из 6 травленых соломинок для отходов ПТФЭ и 6 травленых соломинок из ПТФЭ в соответствующие резьбовые наружные луэры. Убедитесь, что протравленные поверхности совпадают с нижней частью люэра с наружной резьбой (Рисунок 2).
    2. Смешайте эпоксидную смолу и отвердитель в соотношении 1:1 в весовой лодке или чашке Петри. С помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл нанесите эпоксидную смолу вокруг основания резьбового луэра с наружной резьбой, где он встречается с трубкой из ПТФЭ.
    3. Расположите каждую деталь вертикально и дайте эпоксидной смоле застыть в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пустая коробка для наконечника для пипетки объемом 1 мл хорошо подходит для удержания их в вертикальном положении.

2. Сборка MBRA

  1. MBRA и подготовка деталей
    1. Убедитесь, что полоски массива минибиореакторов напечатаны на 3D-принтере (см. Дополнительный файл 1) и содержат 6 независимых камер биореактора. Каждая камера содержит три отверстия 1/4 дюйма, которые должны быть прорезаны резьбой для вставки фитингов. Нарезание резьбы с помощью метчика с фракцией 1/4 дюйма-28NF с Т-образной рукояткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При нарезании резьбы в портах рекомендуется использовать направляющую метчика, чтобы обеспечить отвесную резьбу.
    2. После нарезания резьбы промойте каждую камеру биореактора водой, чтобы удалить остатки пластика. Добавьте в каждую камеру магнитную мешалку размером 10 x 3 мм и 1 мл дистиллированной воды. Вода поможет процессу стерилизации во время автоклавирования.
    3. Установите резиновую шайбу в верхней части каждого порта биореактора. Для каждой камеры вкрутите 1 люэр с наружной резьбой для отходов, 1 люэр с трубочной резьбой и 1 люэр с пустой резьбой в каждый из портов, как показано на рисунке 2B.
    4. Вставьте 6 резиновых перегородок на 3/32-дюймовые заусеницы Люэра с внутренней резьбой. Загните верхний рукав септы вниз, чтобы прикрыть горловину. Прикрепите их к портам каждой камеры, показанным на рисунке 2B.
    5. Отрежьте полосы трубок C-flex следующей длины: 2 3/8 дюйма, 3 11/16 дюйма, 5 1/4 дюйма, 6 1/2 дюйма, 7 13/16 дюйма, 9 дюймов и 9 дюймов (по две каждой длины потребуется как для сливных линий, так и для линий подачи). После разрезания прикрепите заусеницу Люэра с внутренней резьбой 1/8 дюйма к одному концу и соединитель с фиксатором с наружной резьбой к противоположному концу трубки каждого отрезка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь длины оптимизированы для уменьшения беспорядка и для насосов, расположенных на расстоянии ~1 дюйма от мешалки. В зависимости от желаемой конфигурации может потребоваться более длинная конструкция.
    6. Вставьте заусеницу Люэра с внутренней резьбой 1/16 дюйма в каждый конец красной трубки E-lab с 2 ступенями (внутренний диаметр 1,14 мм) и оранжевой трубки E-lab с 2 ступенями выдержки (внутренний диаметр 0,89 мм). Повторите этот процесс шесть раз для каждой полосы MBRA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для более легкой установки 1/16-дюймовой внутренней заусеницы Люэра кратковременно погрузите концы трубки E-lab в почти кипящую воду, чтобы размягчить пластик.
    7. Подсоедините трубку E-lab к трубке C-flex, подготовленной на шаге 2.1.5. Каждый из 6 отрезков трубок C-flex должен быть подключен к одной красной и одной оранжевой линиям E-lab с помощью люэров с внутренней резьбой.
    8. Отрежьте двадцать один кусок размером 1 дюйм, один кусок 2 дюйма, три кусок 3 дюйма и один кусок 12 дюймов трубки C-flex. Прикрепите заусеницу Люэра с внутренней резьбой 1/8 дюйма и соединитель с фиксатором с наружной резьбой к концам одной 3-дюймовой детали и 12-дюймовой трубки. К оставшимся трубкам прикрепите разъемы люэровского замка с наружной резьбой на обоих концах. Эти детали будут состоять из сборок линии отходов и дерева линий подачи.
  2. Сборка дерева мусоропровода
    1. Следуйте 3D-схеме, показанной на рисунке 3B , чтобы собрать дерево линии отходов.
    2. Прикрепите открытые концы красной трубки E-lab с 2 ступенями обращения (внутренний диаметр 1,14 мм) к клеммным замкам Люэра с наружной резьбой на собранном дереве водопровода. Прикрепите их в порядке возрастания в зависимости от длины трубки C-flex, прикрепленной к трубке E-lab с 2 ступенями. Прикрепите 3-дюймовую трубку C-flex с помощью 1/8-дюймовой внутренней заусенцы Люэра и штекерного соединителя люэра к верхней части дерева водопровода.
  3. Сборка дерева подающих линий
    1. Следуйте 3D-схеме, показанной на рисунке 3A , чтобы собрать дерево линий подачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Деревья линий подачи не включают в себя соединители Люэра типа «вилка-вилка», используемые в дереве линий отходов. По нашему опыту, эти соединители подвержены утечкам и могут легко ослабнуть, что увеличивает риск загрязнения как в камерах биореактора, так и в бутылках со средой. Чтобы смягчить эту проблему, дерево линий подачи создается без этих компонентов.
    2. Прикрепите открытые концы оранжевой трубки E-lab с 2 ступенями обращения (внутренний диаметр 0,89 мм) к клеммным замкам Люэра с наружной резьбой на собранном дереве подающей линии. Прикрепите их в порядке возрастания в зависимости от длины трубки C-flex, прикрепленной к трубке E-lab с 2 ступенями. Прикрепите 12-дюймовую трубку C-flex к верхней части дерева подающей линии.
  4. Полная сборка: Объедините подготовленные компоненты в культуральную систему MBRA.
    1. Прикрепите трубку C-flex переменной длины в конце дерева подающей линии к биореактору в порядке возрастания, причем самая короткая линия находится слева от полосы биореактора, а самая длинная — справа.
    2. Прикрепите трубку C-flex переменной длины в конце дерева линии отходов к полосе биореактора в порядке убывания, при этом самая длинная линия находится слева, а самая короткая — справа. Самая короткая линия отходов расположена с правой стороны полосы биореактора, потому что она находится ближе всего к насосу для отходов. Напротив, самая длинная линия подачи находится с правой стороны, потому что подающий насос расположен слева (Рисунок 1).
  5. Стерилизация собранных массивов: Подготовьте собранную систему к стерилизации.
    1. Свяжите все подающие линии C-flex вместе с левой стороны MBRA и закрепите стяжкой. Проделайте то же самое с водосточной линией с правой стороны полосы.
    2. Сформируйте петлю с помощью оранжевой трубки E-lab с 2 ступенями между линиями C-flex. Закрепите петлю с помощью автоклавного скотча. Проделайте то же самое с красной трубкой E-lab с 2 ступенями на стороне отходов полосы биореактора. Это позволит сэкономить место при автоклавировании.
    3. Накройте гнездо самки на конце сливного трубопровода и подающего трубопровода куском фольги, чтобы предотвратить загрязнение после извлечения из автоклава. Ослабьте люэры с наружной резьбой с перегородками на каждой камере биореактора, чтобы обеспечить выход пара во время автоклавирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения выхода пара из биореактора во время автоклавирования. При неправильной вентиляции может произойти растрескивание камер биореактора.
    4. Поместите MBRA в бункер автоклава и растяните деревья линии подачи и отвода отходов в отдельные бункеры, примыкающие к бункеру с MBRA. Если трубка E-lab рядом с внутренней люэровской заусеницей диаметром 1/16 дюйма или какие-либо участки трубки C-flex будут перекручены во время автоклавирования, трубка может засориться, препятствуя потоку среды или отходов.
    5. Автоклав при 121 °C, ≥ 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 25 мин. Используйте программу медленного выпуска, типичную для жидкостных циклов. Дайте биореактору остыть при комнатной температуре в соответствии с циклом автоклава. После того как MBRA достаточно остынет, снова затяните резьбовые мужские люэры с перегородками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоски автоклавного биореактора становятся податливыми и склонными к растрескиванию при сжатии. Дайте достаточно времени для остывания, прежде чем затягивать фитинги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевая трубка E-lab с 2 ступенями подвержена растрескиванию в процессе автоклава и может отделяться от внутренней люэровской заусеницы 1/16 дюйма. Если произошло растрескивание, опрыскайте оба конца 70% этанолом, затем разрежьте треснувший конец стерильной бритвой и снова прикрепите трубку к заусенице Люэра. В качестве альтернативы дополнительные трубки E-lab с прикрепленной внутренней резьбой 1/16 дюйма можно простерилизовать отдельно в автоклавном мешке, а также заменить всю трубку.

3. Узел фильтрующего материала и бутылки для отходов

  1. Узел бутылки со средой
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере вся система питается из одной бутылки объемом 2 л. На рисунке 4A приведено изображение узла крышки бутылки со средой.
    1. Вкрутите адаптеры Dibafit (адаптеры для крышек от бутылок) в два резьбовых порта в верхней части крышки от бутылки серии Q. Добавьте 3-дюймовый участок C-flex трубки к одному из адаптеров и 12-дюймовый участок C-flex к другому. В конце каждой секции трубки добавьте разъем для замка Люэра с наружной резьбой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина трубки, необходимая для достижения дерева подающей линии MBRA, может варьироваться и может быть отрегулирована соответствующим образом.
    2. Отрежьте 12-дюймовый кусок трубки из ПТФЭ, который будет служить соломинкой для забора материала. Обрежьте конец под углом 45° с помощью лезвия бритвы, чтобы предотвратить засорение боковой стенки бутылки. Вставьте ПТФЭ в небольшое отверстие на дне крышки бутылки, соединенное с 12-дюймовым участком трубки C-flex.
    3. Отрежьте 2-дюймовый кусок трубки C-flex и прикрепите к одному концу заусеницу люэра с внутренней резьбой, а к другому — разъем с фиксатором люэра с наружной резьбой. Прикрепите эту трубку к 12-дюймовому участку трубки, которая в конечном итоге будет соединена с деревом подающей линии. Закрепите 2-дюймовую деталь с помощью Pinchcock. Поместите петлю Pinchcock вокруг 3-дюймовой трубки крышки бутылки. Это послужит временной пробкой для предотвращения утечки среды во время и после автоклавирования.
    4. Подготовьте нужный носитель. Установите полностью собранную крышку от бутылки на бутылку со средой. Оберните 12-дюймовую трубку C-flex вокруг бутылки и закрепите конец с помощью Pinchcock на 2-дюймовой трубке, как описано выше. Не закручивайте колпачок туго, а слегка ослабьте его, чтобы предотвратить повышение давления во время автоклавирования.
    5. Используйте фольгу, чтобы закрыть конец 3-дюймовой трубки, исходящей от крышки бутылки. Автоклав на время, соответствующее протоколу носителя. После стерилизации снимите фольгу с 3-дюймовой трубки и вкрутите шприцевой фильтр 0,22 мкм в разъем замка Люэра с наружной резьбой. Это обеспечит приток воздуха в бутылку со средой во время перекачки, но предотвратит загрязнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что крышки бутылок серии Q плотно прилегают к бутылкам, так как неправильное уплотнение может помешать правильному потоку.
  2. Сборка бутылок для отходов: Чтобы не менять бутылки для отходов каждый день, лаборатория создала многоуровневую систему сбора отходов (рис. 4B), которая позволяет заполнять отходами несколько бутылок объемом 2 л во время эксперимента. Настройка этой многоуровневой системы отходов заключается в следующем:
    1. Вкрутите адаптеры для крышек от бутылок в два резьбовых порта в верхней части крышки для бутылки серии Q. Повторите для 2-4 крышек от бутылок, в зависимости от количества необходимых бутылок для хранения отходов.
    2. Отрежьте кусок ПТФЭ толщиной 2 дюйма для каждой крышки от бутылки. Вставьте эту деталь внутрь крышки бутылки в отверстие, предназначенное для удаления отходов к следующей бутылке в системе.
    3. Отрежьте отрезок трубки C-flex длины, достаточный для того, чтобы он протянулся между деревом трубопровода отходов, идущим от насоса, до места установки системы бутылок для отходов. Установите штекерный разъем люэровского замка на конец, прилегающий к дереву водопровода, и подсоедините другой конец к адаптеру крышки бутылки без трубки из ПТФЭ на крышке бутылки.
    4. Отрежьте второй отрезок трубки C-flex, чтобы соединить крышки от бутылок на первой и второй бутылках для отходов. Прикрепите трубку к адаптеру для крышки бутылки с соломинкой из ПТФЭ на первой бутылке и к адаптеру для крышки бутылки без соломинки из ПТФЭ на второй бутылке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая бутылка в каскаде многоярусных бутылок для отходов должна быть расположена над первой, чтобы сила тяжести способствовала потоку от одной бутылки к другой (Рисунок 4B). Рекомендуется поместить все бутылки во вторичный контейнер (например, открытый пластиковый контейнер для хранения) и расположить их в порядке убывания с помощью стояков, таких как контейнеры с перевернутыми острыми предметами.
    5. Продолжайте эту цепочку на столько бутылок, сколько хотите. На последней бутылке прикрепите 3-дюймовый сегмент трубки C-flex с разъемом для замка Люэра с наружной резьбой к адаптеру свободной крышки бутылки. Затем подключите шприц объемом 20 мл, чтобы создать вакуум и облегчить каскад отходов.

4. Подключение, эксплуатация и демонтаж MBRA

  1. Крепление к насосам
    1. Снимите автоклавную ленту, скрепляющую трубки E-lab как для слива, так и для линии подачи. Развяжите пучки трубок C-flex.
    2. Расположите MBRA между двумя насосами в верхней части мешалки. Его можно закрепить на пластине с помощью напечатанных на 3D-принтере держателей (см. Дополнительный файл 2). Убедитесь, что он выровнен по указанным положениям перемешивания на перемешивающей пластине.
    3. Подсоедините трубку линии подачи E-lab к картриджам перистальтического насоса. Установите упоры трубки E-lab в пазы на картриджах. Проделайте то же самое с трубкой для слива E-lab на насосе справа от мешалки.
    4. Зафиксируйте картриджи перистальтического насоса в насосе. Убедитесь, что картриджи полностью прилегают к насосу, а трубка находится внутри канала картриджей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксируйте картриджи на месте на насосах только в том случае, если вы собираетесь запустить поток в течение 24 часов. Если оставить пробирки в зажиме без потока среды дольше 24 часов, они могут сдавиться и засориться. Если это произошло, просто снимите зажим и аккуратно помассируйте трубку в месте сжатия.
    5. Приведите в порядок трубку C-flex с помощью напечатанных на 3D-принтере держателей трубок (Дополнительный файл 3).
    6. Прикрепите конец дерева мусоропровода к трубке, ведущей к бутылкам с отходами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нескольких MBRA деревья линии отходов необходимо соединить друг с другом, прежде чем прикреплять к трубке, ведущей к бутылкам для отходов. Это можно сделать, создав простое дерево ветвления для каждой дополнительной MBRA.
    7. Прикрепите гнездовой луэр на входной трубке подающей линии к штекерному соединителю на 12-дюймовой трубке от крышки бутылки со средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе оба конца должны быть стерильными. Избегайте прикосновения к ним с любым потенциальным источником загрязнения. При подозрении на загрязнение замочите каждый конец в 10% отбеливателе на 10 минут перед подключением.
    8. Включите оба насоса, чтобы начать подачу среды. Убедитесь, что насосы движутся в правильном направлении (оба установлены по часовой стрелке («CW»), если отходы находятся справа от насосов).
    9. Наблюдение за размером и частотой капель среды, попадающих в каждую камеру биореактора; Любые большие различия в этом могут указывать на изменчивость расхода. Если наблюдается изменчивость, рекомендуется заменить любую оранжевую 2-ступенчатую трубку подачи E-lab, подключенную к проблемной камере биореактора. Это поможет ограничить изменчивость расхода в экспериментальном режиме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это время для диагностики и устранения любых утечек в системе, поэтому внимательно следите за процессом первоначального заполнения.
    10. Как только камеры биореактора выйдут на полную мощность, выключите оба насоса и дайте биореакторам постоять в течение 24-48 часов. Этот шаг необходим для проверки на наличие потенциального загрязнения в камерах до начала эксперимента.
  2. Инокуляция MBRA
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы опишем основной протокол стерилизации перегородок и введения инокулюма.
    1. Подготовьте инокулят в соответствии с желаемыми спецификациями.
    2. Нанесите свежеприготовленный 10% раствор отбеливателя на верхнюю часть перегородок в каждой камере биореактора с помощью пластиковой пипетки. Нанесите достаточное количество отбеливателя, чтобы полностью покрыть верхнюю часть перегородок. Оставьте на 10 минут. Высушите перегородки с помощью стерильной лабораторной салфетки.
    3. С помощью иглы длиной 3 дюйма 22 G и шприца с образцом проткните центр перегородки. Убедитесь, что игла соприкасается со средой внутри камеры, затем введите инокулюм в камеру биореактора. Промойте шприц, удалив среду и снова введя ее обратно в камеру. Извлеките иголки из перегородок и выбросьте их в контейнер для острых предметов.
    4. Дайте инокулятиву расти в течение соответствующего периода времени, исходя из экспериментального дизайна, прежде чем начать поток. Например, фекальные бактериальные сообщества требуют начального роста партии в течение 4-16 часов для увеличения достаточной биомассы8.
    5. Включите оба насоса на желаемый расход, в зависимости от требуемого времени оборота. Дополнительную информацию о расходе см. в руководстве по перистальтическому насосу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от желаемого расхода, отработанный насос всегда должен работать с более высокой скоростью, чем насос для фильтрующего материала, чтобы камеры биореактора не переполнялись. Для культивирования желудочно-кишечного бактериального сообщества мы используем скорость оборота 1,92 мл/ч, достигаемую за счет установки фильтрующего насоса на 1,0 об/мин, а насоса отходов — на 2,0 об/мин.
    6. Опять же, обратите внимание на размер и частоту капель среды, попадающих в каждую камеру биореактора, любые большие различия в этом могут указывать на изменчивость расхода. Если наблюдается изменчивость, рекомендуется заменить любую оранжевую 2-ступенчатую питательную трубку E-lab, подключенную к проблемной камере биореактора. Это поможет ограничить изменчивость расхода при экспериментальных прогонах.
  3. Отбор проб MBRA
    1. Нанесите 10% раствор отбеливателя на верхнюю часть перегородок в каждой камере биореактора, достаточно, чтобы полностью покрыть поверхность. Оставьте на 10 минут. Через 10 минут высушите перегородки с помощью стерильной лабораторной салфетки.
    2. Используя иглу 22-го калибра длиной 3 дюйма и шприц, проткните центр перегородки и полностью введите иглу в камеру биореактора. Удерживая шприц, потяните поршень назад, чтобы извлечь образец из камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте более 20% от общего объема камеры биореактора за один раз. Удаление большего количества отходов может нарушить микробное сообщество, так как отток отходов прерывается до тех пор, пока свежая среда не заполнит камеру до уровня отработанной соломинки из ПТФЭ.
    3. Извлеките иглу и разложите образец в соответствующую емкость. Выбросьте иглу в контейнер для острых предметов.
  4. Демонтаж и восстановление MBRA
    ПРИМЕЧАНИЕ: После экспериментов MBRA необходимо простерилизовать и подготовить к будущим экспериментам.
    1. Переключите вход фильтрующего материала с 1 л 10% отбеливателя в деионизированной (DI) воде. Увеличьте расход на обоих насосах до максимума, чтобы вытеснить содержимое камер биореактора раствором отбеливателя.
    2. Как только камеры станут прозрачными (все среды будут заменены отбеливателем), переверните MBRA для дезинфекции выше линии заполнения в течение 5 минут. Через 5 минут выправьте полоску и подождите еще 5 минут для стерилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте отбеливателю оставаться дольше 10 минут, как описано выше, так как это приведет к обесцвечиванию пластика и ослаблению среды и трубок для отходов.
    3. Замените 10% раствор отбеливателя 1 л деионизированной воды. Промойте систему деионизионной водой, пока через нее не пройдет вся вода. Отсоедините трубку биореактора E-lab от насосов и снимите MBRA.
    4. Для восстановления удалите использованные септы и все, кроме 1 мл воды, из каждой камеры.
    5. Замените перегородки и оранжевую трубку E-lab с 2 ступенями обращения и выполните предыдущие шаги для подготовки к автоклавированию (шаги 2.5.1–2.5.5) до 3 раз. После третьего повторного использования MBRA должна быть полностью разобрана, трубка C-flex заменена, а каждая отдельная деталь стерилизована 70% EtOH или заменена в случае поломки. Эпоксидная смола, удерживающая отходы и исходный ПТФЭ, станет хрупкой после нескольких циклов автоклава, и ее необходимо будет наносить повторно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевая трубка E-lab с 2 ступенями заменяется между каждым прогоном, чтобы ограничить изменчивость расхода, вызванную износом и повторяющимися циклами автоклава.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы способствовать росту анаэробных бактерий, таких как те, которые находятся в желудочно-кишечном тракте, MBRA может быть установлен и работать внутри анаэробных камер. Чтобы продемонстрировать способность выращивать сложные бактериальные сообщества непосредственно из соответствующих участков человеческого тела, был подготовлен образец человеческих фекалий, который был выращен в этой системе. Все работы проводились в анаэробной камере, установленной на 37°С, а культуры выращивались в наших биореакторных средах BRM37.

Фекальную суспензию готовили путем анаэробного размораживания человеческого стула и последующего смешивания с фосфатно-солевым буфером (PBS) до конечной концентрации 25% мас./об. После подтверждения стерильности в девять камер биореактора было внесено по 3 мл одной и той же каловой суспензии. Микробные сообщества выращивали в течение ночи без ввода среды или удаления отходов, что приводило к раздельным культурам партий в течение 16 часов. Затем питательные насосы включались и настраивались на расход 1,92 мл в час. После четырех дней непрерывного потока образцы были собраны из биореакторов и проанализированы на состав микробного сообщества с использованием секвенирования гена 16S рРНК с последующим шумоподавлением с помощью Deblur и таксономической классификации с помощью базы данных SILVA 138 SSU в QIIME 213. В общей сложности 65 родов были обнаружены во всех девяти репликах, но в биореакторах преобладали только 18 родов, каждый из которых содержал не менее 2% содержания в любой из девяти реплик (рис. 5). Биореакторы показали высокую воспроизводимость, так что 22 из 65 родов были обнаружены во всех девяти репликах, а еще 17 родов были обнаружены по крайней мере в половине реплик. Большинство родов, отсутствовавших по крайней мере в одном реакторе (37 из 43 родов), были редкими видами, каждый из которых имел относительную численность ниже 2% в биореакторах. Таким образом, культуры MBRA с непрерывным потоком поддерживали сложные, воспроизводимые микробные сообщества, полученные из одного и того же образца стула, даже после отдельных культур партии в течение 16 часов в каждой камере биореактора.

figure-results-1
Рисунок 1: Массив минибиореакторов (MBRA). Полностью собранный MBRA, включая этикетки для дерева трубок линии подачи и отходов, камер биореактора и полосы биореактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Руководство по травлению ПТФЭ и схема порта MBRA. (A) Блок-схема для протравливания носителя и отходов соломинок из ПТФЭ. (В) Каждая камера биореактора содержит порт для фильтрующей трубочки + резьбовая наружная трубка, отработанная соломинка + резьбовая наружная трубка и перегородка + резьбовая наружная резьба люэр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Деревья линий подачи и отходов MBRA. Ниже приведены репрезентативные изображения при сборке (A) дерева линий подачи и (B) дерева линий отходов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Крышка бутылки со средой и система ярусов слива. (A) Пример собранной крышки от бутылки серии Q, используемой для втягивания фильтрующего материала в MBRA. (B) Изображение многоуровневой системы сбора отходов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Относительная численность родов бактерий. (A) Столбчатая диаграмма с накоплением показывает относительную численность всех родов, которые составляют не менее 2% численности в любом из отображаемых образцов. (B) Показатели альфа-разнообразия наблюдаемых OTU и разнообразия Шеннона между всеми девятью камерами биореактора. Все девять камер биореактора были инокулированы одной и той же фекальной суспензией, приготовленной из человеческих стулов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Компоненты MBRA. Изображения и описания всех отдельных деталей, необходимых для полной сборки MBRA, а также количество, необходимое для каждого компонента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Руководство по устранению неполадок. Распространенные проблемы, возникающие при работе MBRA, а также их потенциальные причины и рекомендуемые решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: STL файл для 3D-печати полосок Minibioreactor Array. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: STL файл для 3D-печати держателей биореакторов, используемых для крепления биореакторов к мешалкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3.: Stl для 3D-печати держателей труб, используемых для организации отходных и подающих трубок C-flex, отходящих от MBRA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается полная сборка и основные принципы работы минибиореакторной решетки (MBRA) для высокопроизводительного культивирования бактериальных сообществ, включая несколько ключевых усовершенствований ранее опубликованного метода. Система MBRA остается универсальным и экономически эффективным инструментом, который позволяет исследователям культивировать сложные микробные экосистемы, поддерживая при этом многочисленные экспериментальные репликации параллельно. В этой обновленной версии мы представляем улучшения, которые повышают воспроизводимость, оптимизируют рабочий процесс и снижают риск загрязнения. К ним относятся химически травленые соломинки из ПТФЭ (Рисунок 2) для предотвращения отслоения, подающая соломинка на линии фильтрующего материала (Рисунок 2) для минимизации образования биопленки, стандартизированные длины трубок с прилагаемым 3D-печатным держателем трубки (Дополнительный файл 3) для более компактной и организованной установки, а также оптимизированный протокол повторного использования, который устраняет необходимость в полной разборке между экспериментами. В совокупности эти усовершенствования представляют собой итеративные усовершенствования, разработанные в результате широкого использования системы MBRA в различных экспериментальных приложениях в нашей лаборатории. Рассматривая как критические этапы сборки, так и практические усовершенствования, эта дискуссия подчеркивает полезность MBRA как постоянно развивающейся модельной системы для исследований микробиома.

Успех системы MBRA в значительной степени зависит от точной сборки и стерилизации компонентов для обеспечения работы без загрязнений. Основные этапы включают в себя надлежащую установку крышек, трубок и соединителей серии Q, которые облегчают модульную сборку и позволяют поступать в среду и собирать отходы. Обеспечение плотного прилегания между бутылками со средой, резервуарами для отходов и камерами биореактора имеет важное значение для предотвращения утечек и поддержания стерильных условий. Еще одним важным шагом является проверка скорости потока перистальтического насоса перед экспериментом, поскольку несоответствия могут привести к неравномерной подаче среды и повлиять на динамику роста микроорганизмов. Большинство многоканальных перистальтических насосов, в которых используются кассеты, оснащены механизмом регулировки окклюзии, который следует использовать для точной настройки расхода в каждом канале. Даже при правильной калибровке трубки E-lab остаются основным источником вариативности. Чтобы смягчить эту проблему, важно визуально контролировать частоту и размер капель среды, поступающих в каждую камеру биореактора как во время первоначального заполнения, так и во время начала экспериментов. Эти визуальные проверки позволяют заблаговременно выявлять несоответствия расхода, которые в противном случае могут поставить под угрозу экспериментальную воспроизводимость. В таблице 2 приведены стратегии устранения распространенных проблем, возникающих во время сборки и использования MBRA. Эти шаги по устранению неполадок обеспечивают воспроизводимость экспериментов и предотвращают сбои во время долгосрочного выращивания.

Несмотря на свои сильные стороны, система MBRA имеет определенные ограничения, которые необходимо учитывать при планировании экспериментов. В отличие от более продвинутых систем, в MBRA отсутствуют возможности активного мониторинга, такие как измерение оптической плотности (OD) в режиме реального времени, контроль pH и регулирование температуры. Отсутствие активных измерений ограничивает возможности системы по мониторингу динамических изменений в росте микроорганизмов и метаболической активности в режиме реального времени. Кроме того, хотя система поддерживает анаэробное выращивание в камерах, она не включает в себя встроенное управление газом, что может ограничить применение, требующее точных микроаэрофильных или обогащенных CO2 сред. Для исследований, требующих такого контроля, могут быть более подходящими альтернативные системы со встроенной газовой регуляцией.

Система MBRA имеет ключевые преимущества по сравнению с существующими моделями биореакторов, включая высокую пропускную способность, масштабируемость и экономическую эффективность, сохраняя при этом способность культивировать сложные бактериальные сообщества в непрерывном потоке для имитации динамических сред, таких как желудочно-кишечный тракт человека 6,8,10. Его компактная модульная конструкция позволяет одновременно работать нескольким биореакторам, что делает его идеальным для высокопроизводительных исследований, таких как скрининг фекальных сообществ на устойчивость к вторжениюпатогенов9. Такая модульная конструкция обеспечивает широкую экспериментальную гибкость: каждая полоска может подаваться из одной бутылки со средой, как показано в данном протоколе, или из шести отдельных источников среды, по одному на каждую камеру биореактора. Рабочий объем регулируется длиной тонкой соломинки для отходов из ПТФЭ, вставленной в сливное отверстие каждой камеры, которая устанавливает высоту жидкости; В этом протоколе соломинки диаметром 25 мм сохраняют рабочий объем 15 мл, но объем от 1 до 20 мл может быть достигнут путем обрезки или удлинения соломинки. Кроме того, во входное отверстие фильтрующего материала вставляются более короткие подающие соломинки, которые направляют приток к основанию камеры, предотвращая стекание фильтрующего материала по стенкам камеры и уменьшая образование биопленки над линией заполнения. Скорость насоса или диаметр трубки насоса также могут быть отрегулированы для изменения скорости оборота системы. На сегодняшний день система MBRA широко используется для изучения функциональных и композиционных изменений микробных сообществ в ответ на различные факторы, включая антибиотики10, лекарства от рака14 и различные пищевые соединения 12,15,16,17. Простая модульная конструкция делает его идеальным для адаптации к различным экспериментальным потребностям. Например, MBRA был модифицирован для изучения биопленок в хемостат-подобныхусловиях18, что продемонстрировало его универсальность для исследований экологии микроорганизмов, выходящих за рамки планктонных культур.

Будущие итерации системы MBRA могут выиграть от дополнительных инженерных обновлений, которые расширят ее функциональность, точность и потенциал пропускной способности. Одним из таких усовершенствований является включение дополнительных портов в каждую камеру биореактора. Эти порты могут использоваться для поддержки активного мониторинга параметров окружающей среды, таких как pH, температура, газ или оптическая плотность. Это позволило бы устранить одно из наиболее существенных ограничений модели, обеспечив обратную связь и мониторинг в режиме реального времени. Улучшение геометрии камеры или порта может способствовать более тщательной и доступной очистке, уменьшая накопление остатков и обесцвечивание, а также улучшая возможность повторного использования в долгосрочной перспективе. Интеграция дополнительных перистальтических насосов с программируемыми таймерами позволит использовать импульсные или суточные входы среды, лучше моделируя среду, связанную с хозяином, такую как циклы кормления в кишечнике человека. Наконец, 3D-печать с использованием альтернативных материалов, таких как химически стойкие, автоклавируемые полимеры, может обеспечить большую долговечность и совместимость с более широким спектром реагентов. В совокупности эти усовершенствования могут значительно расширить экспериментальный масштаб и точность платформы MBRA.

В заключение следует отметить, что MBRA предоставляет мощную, высокопроизводительную платформу для культивирования и изучения микробных сообществ в контролируемых условиях. Несмотря на то, что он имеет ограничения в активном мониторинге и контроле pH, его гибкость, масштабируемость и экономическая эффективность делают его бесценным инструментом для широкого спектра микробиологических исследований, особенно тех, которые требуют высокой воспроизводимости и экспериментальной производительности. Важно отметить, что модульная конструкция системы и подход к изготовлению делают ее по своей сути адаптируемой; исследователи уже адаптировали и могут продолжать адаптировать MBRA для решения широкого круга экспериментальных задач. Такая адаптивность гарантирует, что MBRA может продолжать развиваться вместе с возникающими научными вопросами и технологиями, сохраняя свою актуальность в качестве универсальной платформы для исследований микробиома.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана стипендией NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease Predoctoral Fellowship, NIH T32DK007664 и NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Fight Antibiotic Resistance in Metabolism Surfaces.

Авторы благодарят Хейдена Кернина за его вклад в проектирование и изготовление держателей биореакторов и держателей трубок, используемых в этой системе.

Рисунок 2 и рисунок 3 были частично созданы в https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Направляющая V-образного метчика, стандартные размеры от 0-80 до 5/8"Инструменты Big GatorSTD500NP 
0,22 μ Шприцевой фильтр МРыбакSLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Привод перемешивания (только привод)2МАГМФ 41060
Air-tite Иглы для подкожных инъекций, 22G x3"ВВР89219-274
BD 1mL Slip Tip Стерильные шприцы стерильныеРыбак14-823-434
БиореакторПрото-лабораторииNA3D-печать из пластика DMS Somos Watershed Plastic. Шаблон см. в дополнительном файле 1
Держатели биореакторовПрото-лабораторииNA3D-печать из PA 12 Black. Шаблон см. в дополнительном файле 2.
Diba Omnifit Крышка для бутылки с растворителем Q-Series, GL38/38-430 (стекло), 2 порта UNF(F) без клапанов, синийКоул ПармерРЭБ-21942-86
Трубка Diba Omnifit, ПТФЭ, наружный диаметр 1/8 дюйма (3,2 мм) x внутренний диаметр 1,5 ммКоул ПармерEW-21942-76
Адаптер Dibafit, 1/4"-28 UNF(M) плоское дно с внутренним диаметром 3,2 мм, PEEKКоул ПармерEW-21941-49
IRWIN 12001ZR Ключ для крана #0-1/4" Т-образная рукояткаАмазонкаB00004YOB0
Метчик Irwin Hanson из высокоуглеродистой стали SAE 1/4 дюйма. 1 штЗороG7695682
Loctite Сверхмощная эпоксидная быстросъемная бутылка объемом 8 жидких унцийАмазонкаB0044F59N0
Разъем Luer Lock с вилкой на вилкуМикрофлюидика ДарвинаДМ-ММ-ЛЮЭР-ПП Альтернатива: Strategic Applications Inc Разъем Люэра с вилкой на вилку - 10/шт - Fisher - NC9876577
Адаптерные фитинги Masterflex, Люэр-Люэр, Нейлон, AvantorВВРMFLX45502-56
Фитинг Masterflex, нейлон, прямой, переходник с внутренней резьбой Luer на заусеницу шланга, внутренний диаметр 1/16 дюймаВВРMFLX45502-00
Фитинг Masterflex, нейлон, прямой, переходник Luer с внутренней резьбой на шланг, внутренний диаметр 3/32 дюймаВВРMFLX45502-02
Фитинг Masterflex, нейлон, прямой, с внутренней резьбой Люэр и переходники для шланга, 1/8"ВВРMFLX45502-04
Фитинг Masterflex, нейлон, прямой, фиксатор с наружной резьбой Luer к переходнику для шланга, 1/8ВВРMFLX45505-04
Фитинг Masterflex, нейлон, прямой, наружная резьба Luer x 1/4-28 UNFВВРMFLX45505-82
Фитинг Masterflex, полипропилен, колено, адаптер люэра с внутренней резьбой на гнездо ЛюэраВВРMFLX45508-26
Трубка для насоса Masterflex Ismatec, 2-ступенчатая, Tygon S3 E-Lab, внутренний диаметр 0,89 ммВВРMFLX96460-26
Трубка для насоса Masterflex Ismatec, 2-ступенчатая, Tygon S3 E-Lab, внутренний диаметр 1,14 ммВВРMFLX96460-30
Мастерфлекс&рег; Трубка для переноса, C-Flex, непрозрачная белая, внутренний диаметр 1/8 дюйма x внешний диаметр 1/4 дюйма; 25 футовВВРMFLX06424-67
Мор s Pinchcock для тюбингов ВВР470201-374
Неопреновые резиновые шайбы для крыльев ½ ” OD x ¼ ” Внутренний диаметр x 1/16" Толщина АмазонкаB01A29F1R0
Прецизионное уплотнение резиновых перегородокСигма ОлдричZ553905
Спинбар Micro Stir BarsВВР58948-375
ТетратравлениеКомпания Р.С. ХьюстаТЭ-500
Держатель трубкиПрото-лабораторииNA3D-печать из PA 12 Black. Шаблон см. в дополнительном файле 3.
Многоканальный картриджный насос Watson-Marlow 205SУотсон-Марлоу020.3724.00АСо скидкой, альтернатива: Цифровые перистальтические насосы Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 или Masterflex Ismatec IPC Перистальтические насосы, от 0,1 до 11,25 об/мин, 24-канальные, 115/230 В переменного тока, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).">Gilbert, J. A., et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).
  2. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).">Sarkar, S., et al. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).
  3. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).">Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).
  4. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).">McDonald, J. A. K., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  5. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).">Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).
  6. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  7. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).">Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).
  8. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).
  9. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).">Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).
  10. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).">Hobson, C. A., et al. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).
  11. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).">Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).
  12. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).">Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).
  13. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).">Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
  14. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).">Hobson, C. A., et al. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).
  15. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).">Jensen, N., et al. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).
  16. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).">Ghimire, S., et al. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).
  17. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).">Hu, W., et al. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).
  18. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Minibioreactor ArrayGut MicrobiomeMicrobial CommunitiesContinuous Flow CultureIn Vitro Gut ModelHigh Throughput CultivationMicrobiome ResearchBioreactor AssemblyMicrobial Community AnalysisColonization Resistance

Related Articles