Оценка атеросклероза аорты у мышей, получавших инъекции AAV8-PCSK9, путем окрашивания маслом Red O

Краткое содержание

Этот протокол описывает пошаговый метод препарирования, перфузии, окрашивания, визуализации и количественной оценки атеросклеротических поражений на лице в аортах мышей с использованием окрашивания Oil Red O.

Аннотация

Мышиные модели уже давно являются фундаментальными инструментами в изучении атеросклероза, обеспечивая критическое понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе образования бляшек, метаболизма липидов и сердечно-сосудистых воспалений. Помимо мышей Apoe^-/- или Ldlr^-/- , инъекция AAV8-PCSK9^D377Y нормальным мышам C57BL/6J с одновременным кормлением диетой западного типа является широко используемой моделью для трансляционных исследований атеросклероза. Окрашивание Oil Red O является краеугольным камнем для визуализации накопления нейтральных липидов в сосудистых тканях. Его простота, экономичность и высокая чувствительность для обнаружения липидных поражений делают его золотым стандартом для оценки нагрузки атеросклеротических бляшек в доклинических исследованиях. В этом исследовании мы предоставляем подробный, воспроизводимый протокол для диссекции, перфузии, продольного вскрытия, окрашивания Oil Red O, визуализации и полуавтоматической количественной оценки атеросклеротической нагрузки в лицевой аорте без необходимости использования штифтов или сложных этапов монтажа. Наши результаты показывают, что комбинация инъекций AAV8-PCSK9^D377Y и диетического питания западного типа эффективно индуцирует образование значительного атеросклеротического поражения у мышей, и что окрашивание Oil Red O является надежным и эффективным методом оценки отложения липидов и бляшек. Кроме того, хотя этот протокол оптимизирован для индуцированной AAV8-PCSK9 модели у мышей C57BL/6J, он может быть легко адаптирован для использования на других моделях и видах, таких как мыши Apoe^-/-, мыши Ldlr^-/- и Ldlr^-/- золотые сирийские хомяки.

Введение

Атеросклероз, характеризующийся отложением липидов и воспалением в артериальной интиме, представляет собой патологическую основу ишемической болезни сердца и широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), включая инфаркт миокарда и инсульт 1,2,3,4. ССЗ остаются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, представляя собой значительное глобальное бремя для здоровья и экономики ^3,5. Будучи основной патологической основой ССЗ, атеросклероз привлек обширное внимание исследований, направленных на раскрытие его основных механизмов и разработку эффективных терапевтических стратегий. Мышиные модели играют центральную роль в выяснении механизмов, лежащих в основе атерогенеза, и в оценке потенциальных терапевтических вмешательств⁶. Разработка животных моделей сыграла важную роль в углублении нашего понимания атерогенеза, позволив исследователям проанализировать задействованные клеточные и молекулярные механизмы и оценить новые терапевтические стратегии ^6,7. Классические мышиные модели атеросклероза, такие как мыши с дефицитом аполипопротеина Е (Apoe^−/−) и мышами с дефицитом рецепторов липопротеинов низкой плотности (Ldlr^−/−), уже давно используются для индуцирования гиперлипидемии и образования устойчивых бляшек. Тем не менее, создание и поддержание этих генетически модифицированных линий требует обширного разведения, которое может быть трудоемким и ограничивать экспериментальную гибкость ^8,9,10. Для преодоления этих ограничений широкое распространение получил альтернативный подход с использованием аденоассоциированного вируса серотипа 8, кодирующего мутацию усиления функции в пропротеинконвертазе субтилизин/кексин типа 9 (AAV8-PCSK9^D377Y). При введении мышам дикого типа C57BL/6J в сочетании с диетой западного типа с высоким содержанием жиров и холестерина, этот метод эффективно индуцирует гиперхолестеринемию и атеросклеротические поражения в течение относительно короткого периода времени - без необходимости сложных генетических скрещиваний или обратного скрещивания на фоне склонности к атеросклерозу ^9,11. Несмотря на свои преимущества, модель AAV8-PCSK9 имеет определенные ограничения, которые заслуживают рассмотрения. Примечательно, что на степень развития гиперхолестеринемии и атеросклеротического поражения могут влиять такие переменные, как доза вируса и способы введения, что может привести к межживотной изменчивости и повлиять на воспроизводимость^{экспериментальных} исходов.

Для оценки бремени заболевания в таких моделях окрашивание аорты методом Oil Red O обеспечивает хорошо зарекомендовавшую себя, чувствительную технику визуализации и количественного определения богатых липидами атеросклеротических поражений вдоль люминальной поверхности сосудистой сети^12,13. Этот подход предлагает как качественные, так и количественные данные и широко используется в доклинических исследованиях для оценки эффектов генетических манипуляций, фармакологического^{вмешательства или} диетической модуляции.

В этом исследовании мы представляем практический и воспроизводимый протокол для выделения, перфузии, продольного вскрытия, окрашивания Oil Red O, визуализации и полуавтоматической количественной оценки атеросклеротических поражений в аортах мышей целиком. В этом протоколе AAV8-PCSK9^D377Y вводится в дозе 5 × 10¹¹ векторных геномов (vg) на мышь путем инъекции в хвостовую вену. В сочетании с диетой западного типа (WD), содержащей 40% ккал из жира и 1,25% холестерина, в течение 12-16 недель может наблюдаться сильное развитие атеросклеротического поражения. Приведенный здесь протокол оптимизирует каждый этап процесса, устраняя необходимость прикалывания тканей к восковым поверхностям и вместо этого используя упрощенную технику сплющивания, которая снижает вариативность и технические требования. Метод не только оптимизирован для модели AAV8-PCSK9^D377Y у мышей C57BL/6J, но также легко применим к другим широко используемым моделям атеросклероза, включая мышей Apoe^-/- и Ldlr^-/-, а также Ldlr^-/- сирийских золотых хомяков 15,16,17,18,19, которые стали многообещающей моделью благодаря своему метаболизму липидов, подобному человеческому.

Протокол

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с руководящими принципами, изложенными в NIH, и были одобрены Комитетом по этике животных Университета науки и технологии Китая (Ethics Approval No. USTCACUC27120124102).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с AAV8-PCSK9, должны проводиться в сертифицированном шкафу биологической безопасности класса II в условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Персонал должен носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки.

1. Индукция атеросклероза у мышей

1. Внутривенно введите 8-недельной мыши C57BL/6J AAV8-PCSK9^D377Y (5 × 10¹¹ vg/мышь через хвостовую вену).
2. Поместите мышь на WD (содержащий 40% ккал из жира и 1,25% холестерина) сразу после инъекции.
3. Кормите мышь WD в течение 12-16 недель, чтобы вызвать образование атеросклеротического поражения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется 12-недельный период кормления, который, как было показано, вызывает явное образование атеросклеротических бляшек, особенно в моделях, индуцированных AAV8-PCSK9. Более длительные периоды (например, 16 недель) могут привести к более поздним поражениям, и оптимальный временной момент должен быть выбран на основе конкретных экспериментальных целей.
4. Регулярно контролируйте массу тела, общее состояние здоровья и уровень липидов в плазме крови в течение всего периода кормления. Для профилирования липидов собирайте образцы крови в исходные и выбранные моменты времени (например, каждые 4 недели) через кровотечение из подчелюстной или хвостовой вены под кратковременной анестезией изофлурана.

2. Эвтаназия и перфузия

1. Введите пентобарбитал натрия (200 мг/кг, внутрибрюшинное введение) для усыпления мыши.
2. Откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце.
3. Сделайте разрез в придатке правого предсердия и проведите холодный фосфатно-солевой буфер (PBS, около 10 мл) через левый желудочек с помощью иглы 21 G для промывания крови.

3. Расслоение аорты

1. Удалите лишние ткани, такие как легкие и тимус, чтобы обнажить грудную аорту от сердца до диафрагмы.
2. Используйте тонкие препарирующие ножницы и прецизионные щипцы для удаления окружающей жировой ткани вокруг дуги аорты. Аккуратно приподнимите жировую ткань, окружающую основание грудной аорты рядом с диафрагмой. Иссекайте вдоль корня жировой ткани с помощью тонких рассекающих ножниц (следя за тем, чтобы сосудистая структура не была повреждена), продолжая рассечение вверх до дуги аорты, чтобы полностью обнажить аортальный сосуд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация периваскулярной жировой ткани от аорты имеет решающее значение, и этот этап рекомендуется выполнять с аортой in situ (до разрезания у мыши), поскольку рассечение периваскулярного жира из аорты технически затруднено после рассечения аорты и установки PBS.
3. Пересектите сосуд у основания грудной аорты с помощью прецизионных ножниц. Поднимите конец разреза с помощью щипцов и рассекайте вверх вдоль сосуда по направлению к дуге аорты. Разрежьте три первичные ветви аорты на соответствующем расстоянии.
4. Разрез у корня аорты, чтобы отделить грудную аорту от сердца, изолировав весь сегмент для дальнейшего анализа.
5. Перелейте иссеченный сосуд в предварительно охлажденный 4% раствор параформальдегида (PFA) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи (12-16 часов). Чтобы стандартизировать обработку и облегчить обработку партий, во время фиксации помещайте отдельные аорты в лунки 24-луночного или 48-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительной фиксации (более 24 часов), так как чрезмерная инкубация в PFA может привести к затвердеванию сосуда, что затруднит продольное сечение и дальнейший анализ.
   ВНИМАНИЕ:4% PFA является токсичным и летучим фиксатором, который создает риск респираторного и кожного воздействия. Все этапы, связанные с фиксацией PFA, должны выполняться в вытяжном шкафу при ношении СИЗ, включая нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Избегайте ингаляций и контакта с кожей. Использованный раствор PFA должен быть собран в специальные контейнеры для отходов формальдегида, четко маркирован и утилизирован как опасные химические отходы институциональной или лицензированной службой утилизации химических отходов.

4. Окрашивание маслом Red O

1. Трижды промойте неподвижные аорты PBS, чтобы удалить остатки PFA.
2. Как показано на рисунке 1, откройте аорту в продольном направлении под рассекающим микроскопом с помощью тонких ножниц, начиная от корня аорты вдоль внутренней кривизны. В качестве альтернативы перед фиксацией можно открыть аорту, что может облегчить раскрытие и выравнивание сосуда во время монтажа. При необходимости продольно откройте основные ветви дуги аорты, такие как брахиоцефальная артерия (БЦА), правая сонная артерия (ПКА) и левая подключичная артерия, чтобы обнажить дополнительные области¹¹. Будьте осторожны на этом этапе, так как бляшки в этих областях могут отклеиться или повредиться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой подход может быть выбран в зависимости от предпочтений оператора и состояния ткани.
3. Приготовьте рабочий раствор Oil Red O, разбавив 0,5% бульон в изопропаноле с деионизированной водой в соотношении 3:2 (v/v, конечная концентрация 0,3%). Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут, чтобы краситель полностью растворился.
4. Профильтруйте через мембрану размером 0,22-0,45 мкм для удаления осадков. Держите раствор на водяной бане при температуре 37 °C до использования.
5. Удалите PBS из каждой лунки. Добавьте масло Red O рабочим раствором для полного погружения аорты. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
6. После инкубации отсадите раствор и сразу же добавьте в каждую лунку по 1 мл 60% изопропанола. Поставьте тарелку на шейкер и аккуратно взбалтывайте, чтобы вымыть.
7. Примерно через 30 с, когда неповрежденные участки сосуда кажутся полупрозрачными, прекратите промывание, аспирировав изопропанол. Дважды промойте образцы PBS.
8. После окрашивания Oil Red O при необходимости дополнительно обрежьте остаточную периваскулярную жировую ткань. На этой стадии жировая ткань, как правило, хорошо окрашена и визуально различима, что позволяет более точно идентифицировать и удалить ее без нарушения целостности сосудистой стенки.
9. После окрашивания Oil Red O откройте аорту в продольном направлении и осторожно закрепите ее на предметном стекле для немедленной визуализации под стереомикроскопом.
10. В качестве альтернативы перед визуализацией образцы можно хранить в течение короткого времени в PBS при температуре 4 °C. Для артерий, которые трудно сгладить, прикрепите сосуды к черной восковой пластине с помощью тонких игл, чтобы обеспечить оптимальное позиционирование и прозрачность. Для долговременной сохранности закрепите витражные сосуды на предметных стеклах, запечатайте их глицериновым желатином, а затем непосредственно сфотографируйте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите окрашенные аорты на новую пластину для стирки, чтобы избежать загрязнения остатками масла Red O.
    ВНИМАНИЕ: Масло Red O - это липофильный краситель, обычно получаемый из изопропанола, который является легковоспламеняющимся и раздражающим. Работайте с растворами ORO в вытяжном шкафу для химикатов, чтобы избежать вдыхания паров. Избегайте попадания на кожу и в глаза. Растворы для окрашивания Oil Red O следует собирать отдельно в контейнеры для легковоспламеняющихся химических отходов. Утилизируйте в соответствии с местными правилами утилизации опасных отходов.

5. Визуализация

1. Закрепите окрашенные аорты на белом фоне для усиления контраста. Поддерживайте гибкость судна.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высококонтрастный фон способствует более эффективному распознаванию зубного налета с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Другие цвета фона также могут быть использованы в зависимости от предпочтений пользователя.
2. Получите изображение всей аорты с помощью планшетного сканера или препарирующего микроскопа с камерой высокого разрешения.
3. Обеспечьте равномерное освещение и постоянное увеличение по образцам (например, увеличение от 6 до 8 раз). Если аорта высыхает во время визуализации, восстановите водный баланс с помощью салфеток киви, смоченных в физрастворе или PBS.

6. Количественная оценка атеросклеротических поражений

1. Откройте изображение в программе ImageJ. Следующие шаги описывают процедуру анализа на примере ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от предпочтений и доступности пользователя также можно использовать другое программное обеспечение для анализа изображений (например, Zeiss Zen, Фиджи).
2. Установите масштаб с помощью известного эталона (например, масштабной линейки или линейки). Используйте инструмент «Прямая линия» для рисования на известном расстоянии. Перейдите в раздел Анализ > Установить масштаб, введите расстояние и единицы измерения, выберите Глобальный и нажмите OK.
3. Используйте инструмент « Многоугольник» или «Выделение от руки », чтобы обвести всю область аорты.
4. Измерьте площадь с помощью функции «Анализ» > «Измерить».
5. Определите области атеросклеротических бляшек с помощью Image > Adjust > Color Threshold. Отрегулируйте Насыщенность и Яркость, чтобы изолировать масляно-красные O-положительные области.
6. Нажмите кнопку Выбрать, чтобы создать двоичное выделение окрашенных областей. Измерьте выбранные области с помощью функции «Анализ > измерение». Применяйте одинаковые пороговые значения для всех изображений в пакете.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что остаточный жир или артефакты могут привести к ложноположительному окрашиванию, пользователи могут выбрать ручное или полуавтоматическое определение областей бляшки в зависимости от своих конкретных экспериментальных потребностей и качества изображения. Ручная трассировка площади бляшки может быть выполнена с использованием того же метода, что и для определения общей площади сосуда.
7. Экспортируйте результаты (файл > «Сохранить как > результаты») как .csv для дальнейшего анализа.
8. Экспресс-площадь бляшки как площадь бляшки/общая площадь аорты × 100%. Чтобы получить более точную оценку нагрузки атеросклеротической бляшки, количественно оцените площадь бляшки по анатомическим областям (например, дуга аорты, особенно меньшая кривизна, и общая аорта) и выразите результаты в виде процента площади бляшки по отношению к общей площади поверхности каждой соответствующей области: площадь бляшки (%) = (площадь бляшки / общая площадь области) × 100%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потенциальную систематическую ошибку, рекомендуется проводить слепой анализ. При анализе большого количества изображений весь рабочий процесс от порогового значения до измерения может быть автоматизирован с помощью Macro Recorder (Plugins > Macros > Record) и обработан массово с помощью Process > Batch > Macro. Это обеспечивает эффективный и воспроизводимый высокопроизводительный анализ.

Результаты

Чтобы оценить степень отложения липидов в стенке аорты, окрашивание маслом Red O было проведено на аортах, выделенных от самцов мышей C57BL/6J, которым вводили AAV8-PCSK9^D377Y и которых кормили западной диетой в течение 12 недель, вместе с контрольными мышами соответствующего возраста. После системной перфузии с PBS и тщательной диссекции целые аорты были тщательно рассечены в продольном направлении и окрашены Oil Red O для визуализации атеросклеротических поражений, насыщенных липидами. Общая экспериментальна...

Обсуждение

Метод окрашивания маслом Red O, описанный в этом исследовании, предлагает надежный, воспроизводимый и эффективный по времени подход к оценке нагрузки атеросклеротического поражения во всей аорте. В этом исследовании мы специально выбрали дугу аорты и грудную аорту в качестве областей, представляющих интерес для анализа бляшек, а не всю аорту. Это решение было принято с учетом особенностей модели AAV8-PCSK9^D377Y model²⁰, которая обычно приводит к менее о...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышки C57BL/6J	GemPharmatech	NO N000013
4% параформальдегид	Beyotime	P0099	Для фиксации в тканях
AAV8-PCSK9D377Y вирусных частиц	Wzbio	pAV208001	Для индуцирования атеросклероза
Тонкие щипцы	Fine Science Tools	No. 11254-20	Для рассечения аорты
ImageJ	NIH	1.47
Изопропанол	Сангон биотехнологический	A600918	Для очистки от излишков масла красное
масло Красное O 0,5% раствор в изопропаноле	Poly Scientific R& D Corp	S1849-32OZ	Для окрашивания маслом красного цвета
Фосфатно-солевой раствор	Servicebio	G4202	Для перфузии и чистки аорты
Пружинные ножницы	Fine Science Tools	No. 15003-08	Для рассечения аорты
Стереоскопический микроскоп	Mshot	MZ62	Для рассечения аорты и визуализации
Западная диета	Исследование диеты	D12108C	Вызвать атеросклероз