Методическая статья

Стимуляция эндотелиальных клеток сосудов с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек в присутствии липопротеинов низкой плотности

981 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

12 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

В этой статье

Краткое содержание

Описан ряд методов, включающий выделение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из плазмы крови человека, дифференцировку клеток HL-60 в нейтрофилоподобные клетки, получение нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) в присутствии ЛПНП и стимуляцию эндотелиальных клеток аорты человека смесью НВЛ и ЛНП.

Аннотация

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО) стали причинными факторами различных неинфекционных заболеваний и связаны с сердечно-сосудистыми расстройствами, такими как атеросклероз и тромбоз. Образование НВЛ наблюдается в сосудистой стенке, и есть убедительные доказательства того, что плазменные маркеры образования НВЛ увеличиваются с тяжестью заболевания. Компоненты НВЛ, полученные из нейтрофилов, включая миелопероксидазы и протеазы, влияют на липопротеины плазмы и сосудистый гомеостаз. Здесь описан ряд методов стимуляции сосудистых клеток с помощью НВЛ, образующихся в присутствии липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). ЛПНП фракционировали из плазмы человека методом ультрацентрифугирования. Клетки HL-60 обрабатывали полностью транс-ретиноевой кислотой для дифференцировки их в нейтрофильные клетки, а затем стимулировали форболом 12-миристат13-ацетатом (PMA) для индуцирования образования НВЛ. После удаления и вымывания PMA клетки дополнительно инкубировали с ЛПНП. Собранные надосадочные жидкости, содержащие НВЛ и ЛПНП, были немедленно использованы для стимуляции эндотелиальных клеток аорты человека (ВАЭК). В качестве репрезентативного ответа морфологическое изменение НАЭК, вызванное лечением НВЛ, усиливалось присутствием ЛПНП, что позволяет предположить, что образование НВЛ в сочетании с ЛПНП усиливает ответ НАЭК. Эти методы полезны для изучения влияния ЛПНП на эндотелиальные клетки при активации нейтрофилов и НВЛ-ассоциированном воспалении, тем самым обеспечивая новое понимание механизмов, лежащих в основе сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с повышением уровня ЛПНП в плазме крови.

Введение

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), продуцируемые активированными нейтрофилами при бактериальной инфекции, а также в неинфекционных физиологически вероятных условиях, высвобождают деконденсированную ДНК и белки, такие как гистоны, миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза1. Поскольку эти компоненты могут разрушать маргинальные клетки и ткани, вызывая стойкое воспаление, образование НВЛ стало причинным фактором в инициации и прогрессировании различных острых и хронических заболеваний, включая ревматоидный артрит, псориаз, диабет, болезнь Альцгеймера, метастазирование рака и сердечно-сосудистыезаболевания. Гистологические анализы сосудистых поражений человека при атеросклерозе3 и аневризме брюшной аорты4 показали, что инфильтрация нейтрофилов и образование НВЛ были колокализованы. В циркулирующей крови уровни маркеров НВЛ, таких как цитруллинированные гистоны, НВЛ-ДНК и МПО, увеличиваются с тяжестью ишемической болезни сердца5. На ранних стадиях атеросклероза образование НВЛ часто предшествует накоплению липидов, которое происходит посредством образования пенистых клеток, вызванных макрофагами 6,7. Эти явления убедительно свидетельствуют о том, что МПО и протеолитические ферменты, высвобождающиеся внеклеточно при образовании НВЛ, могут действовать не только на сосудистые ткани, но и на компоненты крови, такие как липопротеины. Липопротеины представляют собой хрупкие липидно-белковые комплексы, которые могут быть повреждены белками, полученными из НВЛ, такими как MPO8; следовательно, образование НВЛ может вызывать структурные и биохимические изменения в липопротеинах, тем самым влияя на сосудистый гомеостаз. Тем не менее, синергетические эффекты образования НВЛ и липопротеинов на индуцированную сосудистыми клетками дисрегуляцию и воспалительные реакции остаются неясными.

В данной рукописи представлен метод изучения клеточных реакций эндотелиальных клеток сосудов человека, индуцированных обработкой НВЛ, полученными из нейтрофильных клеток, полученных из HL-60, и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), фракционированных из плазмы человека. Репрезентативные результаты демонстрируют фракционирование ЛПНП из плазмы человека путем ультрацентрифугирования и клеточные ответы эндотелиальных клеток аорты человека (ВАЭК), стимулированных НВЛ, после совместной инкубации с ЛНП. Этот метод широко применим для исследования сосудистых клеток с участием других липопротеидов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол подготовки ЛПНП был одобрен этическим комитетом фармацевтической школы Медицинского университета Сёва (No 231). Письменное информированное согласие было получено в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все участники добровольно предоставили свои подписи для участия в данном исследовании. Клетки подвергались асептическим манипуляциям с использованием ламинарного проточного колпака. Критерием включения был возрастной диапазон от 22 до 65 лет. Критерии исключения включали привычку курить, ранее существовавшие сердечно-сосудистые заболевания (такие как ишемическая болезнь сердца, инсульт и заболевания периферических артерий), тяжелую дисфункцию печени и неконтролируемые хронические состояния, включая диабет, гипертонию, дислипидемию, тяжелые воспалительные заболевания и рак. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Выделение ЛПНП из плазмы крови человека

  1. Соберите цельную кровь у здорового человека-добровольца в присутствии антикоагулянта гепарина (10 ЕД/мл).
  2. Центрифугируйте 45-50 мл цельной крови человека, полученной в гепариновой пробирке (700 × г в течение 15 мин при 4 °С). Убедитесь, что скорость центрифуги медленно снижается. Соберите верхний слой, содержащий фракцию плазмы.
  3. Дважды (700 × г, 15 мин при 4 °C) выполните центрифугирование с той же настройкой замедления, что и на шаге 1.2, чтобы удалить клетки крови. Добавьте объем 1:1000 250 мМ ЭДТА (pH 7,4), чтобы предотвратить ионно-опосредованное окисление липопротеинов двухвалентными металлами.
  4. Поместите 2,7 мл плазмы в пробирку из поликарбоната объемом 4 мл (4 шт.), наложите 900 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 250 μМ ЭДТА (PBS/EDTA), и ультрацентрифугу (600 000 × г, 7 мин при 4 °C).
  5. Выбросьте 900 мкл верхнего слоя для устранения хиломикрона. Уложите 900 мкл PBS/EDTA в плазму и ультрацентрифугу (600 000 × г, 2,5 ч при 4 °C).
  6. Удалите 900 мкл верхнего слоя, чтобы удалить липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП). Этот шаг важен для предотвращения контаминации ЛПНП другими фракциями липопротеинов.
  7. Добавьте 540 мкл 0,5 мг/мл раствора KBr для регулировки плотности до d = 1,063 с последующим бережным перемешиванием с помощью пипетки, а затем ультрацентрифугой (600 000 x g, 2,5 ч при 4 °C).
  8. Соберите 540 мкл верхнего слоя, содержащего ЛПНП. Желто-оранжевый слой указывает на успешное отделение ЛПНП9. Перенос на диализную мембрану.
  9. Трижды диализируйте фракцию ЛПНП в сравнении с 2 л PBS/EDTA при 4 °C в темноте, чтобы удалить KBr.
  10. Перед применением хранить ЛПНП при температуре 4 °C в темноте.

2. Подготовка лунок, покрытых поли-L-лизином или желатином

  1. Готовят 0,01% раствор поли-L-лизина10 путем разбавления 0,1% раствора поли-L-лизина стерильной водой с последующей фильтрацией с помощью 0,2-мкм стерильного фильтра. Перед применением хранить при температуре 4 °C.
  2. Добавьте 152 μл/лунку 0,01% раствора поли-L-лизина в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте не менее 5 минут.
  3. Удалите раствор, а затем промойте один раз 200 μл/лунку стерильной водой и высушите не менее 2 часов.
  4. Хранить при комнатной температуре перед использованием при приготовлении НВЛ.

3. Подготовка лунок, покрытых желатином

  1. Перед применением приготовьте 0,1% раствор желатина, разбавив 2% раствор желатина стерильной водой.
  2. Добавьте 152 μл/лунку 0,1 % раствора желатина в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте не менее 5 мин11.
  3. Удалите раствор, а затем промойте один раз 200 μл/лунку стерильной водой и высушите не менее 2 часов.
  4. Перед применением хранить при комнатной температуре.

4. Поддержание и препарирование эндотелиальных клеток аорты человека (ВАЭК)

  1. Культивирование первичных НАЭК в колбе для культуры без оболочки с использованием полной среды, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки (СКС), 5 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 20 нг/мл инсулиноподобного фактора роста, 0,5 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов, 1 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 22,5 мкг/мл гепарина и 0,2 мкг/мл гидрокортизона, как указано в инструкции производителя. Меняйте среду через день до тех пор, пока клетки не станут слитыми на 70%-80%.
  2. Для стимуляции затравливают НАЭК в 12-луночные планшеты, покрытые желатином. Меняйте среду через день до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Проведите эксперимент между отрывками 4 и 7.

5. Получение нейтрофилоподобных клеток, полученных из HL-60, с последующими НВЛ

  1. Поддерживайте клетки HL-60 с помощью среды RPMI-1640 с добавлением 5 % фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина/стрептомицина, используя необработанные блюда.
  2. Для получения нейтрофилоподобных клеток, полученных из HL-60, культивируют 2 × 106 клеток на 10 мл клеток HL-60 в течение 4 суток в среде RPMI-1640, содержащей 2 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (AtRA).

6. Подготовка НЭО с ЛПНП

  1. Соберите клетки HL-60 через 4 дня после обработки 2 мкМ AtRA. После дифференцировки клеток HL-60 в нейтрофилоподобные клетки клетки становятся меньше.
  2. Центрифужные ячейки (220 × г, 4 мин при 18-22 °C). Отсадите надосадочную жидкость и промойте клетки равным объемом бессывороточной жидкости RPMI-1640.
  3. Центрифугируйте клетки (220 × г, 4 мин при 18-22 °C), а затем повторно суспендируйте клетки с помощью RPMI-1640, не содержащего сыворотки.
  4. Подсчитайте клетки, затем ресуспендируйте клетки до 2 × 106 клеток/мл в бессывороточном RPMI-1640 и засейте 0,5 мл клеточной суспензии в лунки 12-луночного планшета, предварительно покрытого поли-L-лизином. Культивировать не менее 30 мин.
  5. Добавьте 100 мкл бессывороточного RPMI-1640 с 300 нМ форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) или без него до конечной концентрации 0 или 50 нМ PMA. Культивирование в течение 30 мин.
  6. Удалите среду и промойте клетки один раз с помощью RPMI-1640, не содержащей сыворотки. Замените среду на бессывороточный RPMI-1640 с 20 мкг/мл ЛПНП или без него, а затем заквашивайте в течение 2 ч.
  7. Соберите питательную среду и центрифугируйте (700 × г, 3 мин при 18-22 °С) для удаления клеточного мусора.

7. Стимуляция НАЭК с помощью НЭО и ЛПНП

  1. Замените среду 0,5 мл свежей питательной среды. Культивируйте не менее чем за 30 минут до стимуляции.
  2. Добавьте 167 мкл питательной среды, содержащей НВЛ и ЛПНП (шаг 6.7) и ЛПНП, в чашки с НАЭС. Проверьте морфологические изменения ВАЭК, индуцированные после стимуляции, в течение 12 ч и более.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После удаления хиломикронов с последующим удалением фракций ЛПОНП из плазмы человека путем последовательного ультрацентрифугирования плазму человека смешивали с раствором KBr для регулировки плотности до d = 1,063. На этом этапе оставшийся осадок не полностью растворялся в растворе, и удавалось избежать серьезного перемешивания, в результате которого образовывались пузырьки газа, чтобы сохранить ЛПНП в целости и сохранности. После ультрацентрифугирования ЛПНП визуально оценивали на верхнем слое по его желто-оран...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает получение НВЛ из клеток dHL-60, индуцированных сосуществованием ЛПНП, которые впоследствии используются для анализа ответов HAEC. Значение этого протокола заключается в использовании свежей среды, содержащей НВЛ и ЛПНП, для стимуляции клеток, хотя во многих других исследованиях используется исходный раствор НВЛ, замороженный при -20 °C. Поскольку липопротеины представляют собой липидно-белковые комплексы, их интактные структуры и характеристики теряются во время ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано Японским обществом содействия науке, KAKENHI (гранты No 23K10897 и 19K07069). Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1% поли-L-лизинСигмаОлдричП8920-100МЛ
Блюдо 10 смКорнинг430591
12-луночные планшеты для культивирования тканейСокол353043
2% желатинаСигмаОлдричГ1393-20МЛ
Трубка 4PCХимакS404332A
Полностью транс-ретиноевая кислотаВако188-01113Может быть заменен на любого поставщика
Трубки для диализа целлюлозыMISUMI Group Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Может быть заменен на любого поставщика
ЭДТАДодзиндо345-01865Может быть заменен на любого поставщика
Среда для роста эндотелиальных клеток 2 НаборPromoCellС-22111
Фетальная бычья сывороткаGibco10270-106Может быть заменен на любого поставщика
Гепарин натрия (5 000 единиц/5 мл)Мочида Фармасьютикал Ко., Лтд.Может быть заменен на любого поставщика
Высокоскоростная охлаждаемая центрифугаТОМИЯСРХ-201Ускорение: 9, Замедление: 7
Эндотелиальные клетки аорты человекаЛонзаСС-2535
КБрВако168-03475Может быть заменен на любого поставщика
Программное обеспечение KEYENCE для микроскопииКЕЙЕНСАнализатор BZ-II
МикроцентрифугаХимакCS150GX
МикроскопияОЛИМПСК40
МикроскопияКЕЙЕНСБЗ-9000Для цейтраферной съемки (опция)
Камера для микроскопииКомпания NikonДС-Fi3
Программное обеспечение камеры для микроскопииКомпания NikonДС-Л4
Пенициллин/стрептомицинGibco15140-122 100МЛМожет быть заменен на любого поставщика
фосфатный буферный солевой раствор (× 10)Растворите 2,6 г2PO4· 2H2O, 29 г Na2HPO4· 12H2O, 80 г NaCl и 2,0 г KCl в дистиллированной воде и довести до объема 1 л. (Может быть заменен на любого поставщика)
PMA (Форбол 12-миристат 13-ацетат)Вако162-23591Может быть заменен на любого поставщика
РеагентПакЛонзаСС-5034(CC-5022: Буферизованный физиологический раствор HEPES, CC-5012: Трипсин/ЭДТА, CC-5002: Нейтрализующий раствор трипсина) 
РоторХимакS100AT6-0242
RPMI-1640 (с феноловым красным)Вако189-02025Может быть заменен на любого поставщика
RPMI-1640 (без фенола красного)Вако186-02155Может быть заменен на любого поставщика
Фляга Т-25Корнинг3275

Ссылки

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HL 60

Похожие статьи