Описан ряд методов, включающий выделение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из плазмы крови человека, дифференцировку клеток HL-60 в нейтрофилоподобные клетки, получение нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) в присутствии ЛПНП и стимуляцию эндотелиальных клеток аорты человека смесью НВЛ и ЛНП.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Стимуляция эндотелиальных клеток сосудов с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек в присутствии липопротеинов низкой плотности
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО) стали причинными факторами различных неинфекционных заболеваний и связаны с сердечно-сосудистыми расстройствами, такими как атеросклероз и тромбоз. Образование НВЛ наблюдается в сосудистой стенке, и есть убедительные доказательства того, что плазменные маркеры образования НВЛ увеличиваются с тяжестью заболевания. Компоненты НВЛ, полученные из нейтрофилов, включая миелопероксидазы и протеазы, влияют на липопротеины плазмы и сосудистый гомеостаз. Здесь описан ряд методов стимуляции сосудистых клеток с помощью НВЛ, образующихся в присутствии липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). ЛПНП фракционировали из плазмы человека методом ультрацентрифугирования. Клетки HL-60 обрабатывали полностью транс-ретиноевой кислотой для дифференцировки их в нейтрофильные клетки, а затем стимулировали форболом 12-миристат13-ацетатом (PMA) для индуцирования образования НВЛ. После удаления и вымывания PMA клетки дополнительно инкубировали с ЛПНП. Собранные надосадочные жидкости, содержащие НВЛ и ЛПНП, были немедленно использованы для стимуляции эндотелиальных клеток аорты человека (ВАЭК). В качестве репрезентативного ответа морфологическое изменение НАЭК, вызванное лечением НВЛ, усиливалось присутствием ЛПНП, что позволяет предположить, что образование НВЛ в сочетании с ЛПНП усиливает ответ НАЭК. Эти методы полезны для изучения влияния ЛПНП на эндотелиальные клетки при активации нейтрофилов и НВЛ-ассоциированном воспалении, тем самым обеспечивая новое понимание механизмов, лежащих в основе сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с повышением уровня ЛПНП в плазме крови.
Введение
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), продуцируемые активированными нейтрофилами при бактериальной инфекции, а также в неинфекционных физиологически вероятных условиях, высвобождают деконденсированную ДНК и белки, такие как гистоны, миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза1. Поскольку эти компоненты могут разрушать маргинальные клетки и ткани, вызывая стойкое воспаление, образование НВЛ стало причинным фактором в инициации и прогрессировании различных острых и хронических заболеваний, включая ревматоидный артрит, псориаз, диабет, болезнь Альцгеймера, метастазирование рака и сердечно-сосудистые
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол подготовки ЛПНП был одобрен этическим комитетом фармацевтической школы Медицинского университета Сёва (No 231). Письменное информированное согласие было получено в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все участники добровольно предоставили свои подписи для участия в данном исследовании. Клетки подвергались асептическим манипуляциям с использованием ламинарного проточного колпака. Критерием включения был возрастной диапазон от 22 до 65 лет. Критерии исключения включали привычку курить, ранее существовавшие сердечно-сосудистые заболевания (такие как ишемическая болезнь сердца, инсульт и заболевания периферических артерий)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После удаления хиломикронов с последующим удалением фракций ЛПОНП из плазмы человека путем последовательного ультрацентрифугирования плазму человека смешивали с раствором KBr для регулировки плотности до d = 1,063. На этом этапе оставшийся осадок не полностью растворялся в растворе, и удавалось избежать серьезного перемешивания, в результате которого образовывались пузырьки газа, чтобы сохранить ЛПНП в целости и сохранности. После ультрацентрифугирования ЛПНП визуально оценивали на верхнем слое по его желто-оран.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает получение НВЛ из клеток dHL-60, индуцированных сосуществованием ЛПНП, которые впоследствии используются для анализа ответов HAEC. Значение этого протокола заключается в использовании свежей среды, содержащей НВЛ и ЛПНП, для стимуляции клеток, хотя во многих других исследованиях используется исходный раствор НВЛ, замороженный при -20 °C. Поскольку липопротеины представляют собой липидно-белковые комплексы, их интактные структуры и характеристики теряются во время .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было частично поддержано Японским обществом содействия науке, KAKENHI (гранты No 23K10897 и 19K07069). Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,1% поли-L-лизин | СигмаОлдрич | П8920-100МЛ | |
| Блюдо 10 см | Корнинг | 430591 | |
| 12-луночные планшеты для культивирования тканей | Сокол | 353043 | |
| 2% желатина | СигмаОлдрич | Г1393-20МЛ | |
| Трубка 4PC | Химак | S404332A | |
| Полностью транс-ретиноевая кислота | Вако | 188-01113 | Может быть заменен на любого поставщика |
| Трубки для диализа целлюлозы | MISUMI Group Inc. | 0327-23-37-07 (UC18-32-100) | Может быть заменен на любого поставщика |
| ЭДТА | Додзиндо | 345-01865 | Может быть заменен на любого поставщика |
| Среда для роста эндотелиальных клеток 2 Набор | PromoCell | С-22111 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | Может быть заменен на любого поставщика |
| Гепарин натрия (5 000 единиц/5 мл) | Мочида Фармасьютикал Ко., Лтд. | Может быть заменен на любого поставщика | |
| Высокоскоростная охлаждаемая центрифуга | ТОМИЯ | СРХ-201 | Ускорение: 9, Замедление: 7 |
| Эндотелиальные клетки аорты человека | Лонза | СС-2535 | |
| КБр | Вако | 168-03475 | Может быть заменен на любого поставщика |
| Программное обеспечение KEYENCE для микроскопии | КЕЙЕНС | Анализатор BZ-II | |
| Микроцентрифуга | Химак | CS150GX | |
| Микроскопия | ОЛИМП | СК40 | |
| Микроскопия | КЕЙЕНС | БЗ-9000 | Для цейтраферной съемки (опция) |
| Камера для микроскопии | Компания Nikon | ДС-Fi3 | |
| Программное обеспечение камеры для микроскопии | Компания Nikon | ДС-Л4 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Gibco | 15140-122 100МЛ | Может быть заменен на любого поставщика |
| фосфатный буферный солевой раствор (× 10) | Растворите 2,6 г2PO4· 2H2O, 29 г Na2HPO4· 12H2O, 80 г NaCl и 2,0 г KCl в дистиллированной воде и довести до объема 1 л. (Может быть заменен на любого поставщика) | ||
| PMA (Форбол 12-миристат 13-ацетат) | Вако | 162-23591 | Может быть заменен на любого поставщика |
| РеагентПак | Лонза | СС-5034 | (CC-5022: Буферизованный физиологический раствор HEPES, CC-5012: Трипсин/ЭДТА, CC-5002: Нейтрализующий раствор трипсина) |
| Ротор | Химак | S100AT6-0242 | |
| RPMI-1640 (с феноловым красным) | Вако | 189-02025 | Может быть заменен на любого поставщика |
| RPMI-1640 (без фенола красного) | Вако | 186-02155 | Может быть заменен на любого поставщика |
| Фляга Т-25 | Корнинг | 3275 |
Ссылки
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
- Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
