Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комбинированная амплификация рекомбиназной полимеразы CRISPR/Cas12a Анализ для выявления Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

678 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе проиллюстрирован комбинированный анализ рекомбиназной полимеразы CRISPR/Cas12a для обнаружения инвазивного патогена растений, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Аннотация

Регулярный и точный надзор имеет решающее значение для эффективной борьбы с болезнями растений. В нем может быть указано, какой образ действий является наиболее целесообразным, и требуется ли профилактика, искоренение или отсутствие каких-либо действий. Эпиднадзор, основанный только на симптоматике у растений-хозяев, часто не является надежным из-за сходства симптомов, вызванных биотическим и абиотическим стрессами. Лабораторные молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная (q)ПЦР, являются наиболее распространенными и надежными для обнаружения патогенов растений, но требуют дорогостоящего оборудования и квалифицированных операторов. В данной статье мы описываем протокол, сочетающий в себе упрощенную экстракцию ДНК, рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA) и кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) для обнаружения инвазивного патогена Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4). Этот метод представляет собой простую альтернативу однопробирочному детектированию, которая является аналитически устойчивой с повышенной специфичностью по сравнению с доступными молекулярными детективными анализами и сводит на нет необходимость в дорогостоящем и сложном лабораторном оборудовании.

Введение

Фузариозное увядание, вызываемое почвенным грибковым патогеном Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), во всем мире считается одним из самых разрушительных трансграничных патогенов растений в истории1. После интродукции в новую область Фок остается невидимым до тех пор, пока у зараженных растений не разовьются симптомы. На это могут уйти месяцы, что позволит грибку укорениться и распространиться неосознанно. После укоренения его практически невозможно искоренить экономически из-за производства устойчивых хламидоспор и многолетнего характера производства бананов. Таким образом, важность профилактики и раннего выявления имеет первостепенное значение для защиты уязвимых производителей1. Нынешняя эпидемия заболевания, вызванного Foc тропической расы 4 (TR4), требует выявления с помощью регулярного эпиднадзора для выявления симптоматических банановых растений в районах высокого риска. Абиотические ограничения, такие как водный стресс и дефицит определенных питательных веществ, вызывают внешнее пожелтение, которое похоже на симптомы, вызванные инфекцией Foc TR4. Кроме того, симптомы, возникающие в результате заражения различными расами FOC, не могут быть различимы. Таким образом, лабораторная очистка и последующее фенотипическое и молекулярное обнаружение необходимы для надежного обнаружения Foc TR42. Для обнаружения Foc TR4 доступны различные молекулярные анализы, включая ПЦР, количественную (q) ПЦР и анализы петлевой изотермической амплификации (LAMP) 3,4,5,6,7. Однако большинство из этих протоколов по-прежнему требуют дорогостоящих и специализированных навыков и оборудования, которые должны проводиться в лабораторных условиях. Амплификация рекомбиназной полимеразы (РПА) может быть выполнена изотермически и, следовательно, устраняет необходимость в таком оборудовании и может быть рассмотрена для протоколов обнаружения в полевых условиях8.

Кластеризованные системы с регулярным чередованием коротких палиндромных повторов (CRISPR)-Cas все чаще используются для улучшения молекулярной диагностики9. Эти системы используются, поскольку они недороги, просты и не требуют использования специальных приборов, поэтому могут рассматриваться для обнаружения в полевых условиях. Диагностика на основе CRISPR обычно включает изотермическую амплификацию последовательности-мишени с последующим распознаванием мишени с помощью белков CRISPR-Cas и коллатеральным расщеплением флуоресцентного репортерного красителя ДНК или РНК для указания на присутствие мишени10,11. В системах CRISPR-Cas12a, в частности, CRISPR RNA (crRNA) направляет Cas12a на распознавание и расщепление мишеней нуклеиновых кислот. Эта кРНК может быть сконструирована для нацеливания на конкретную интересующую область ДНК или РНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью. После связывания Cas12a расщепляет мишень с однонуклеотидной специфичностью, за которым следует коллатеральное расщепление репортерных молекул12. В последнее время системы CRISPR-Cas12a были использованы для обнаружения различных экономически важных грибковых патогенов растений 13,14,15,16,17,18,19,20.

В данном протоколе описана разработка однотрубочной методики детектирования, сочетающей в себе упрощенную экстракцию ДНК, амплификацию рекомбиназной полимеразы (RPA) и технологию CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) для обнаружения Foc TR4, который визуализировался как на портативном флуориметре, так и невооруженным глазом под недорогим светоизлучающим (LED) синим световым трансиллюминатором21. Этот метод может быть дополнительно оптимизирован для обнаружения в полевых условиях, чтобы улучшить стратегии предотвращения и сдерживания. Аналогичный подход также может быть использован для разработки анализов обнаружения других патогенов растений на основе Cas12a.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Упрощенное извлечение ДНК из растительного сырья

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор см. на рисунке 1 .

  1. Провести экстракцию ДНК.
    1. Переложите по 250 мг каждого кусочка симптоматического псевдостебля в отдельный пакет для экстракции (см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте 2 мл 0,5 М NaOH-PVP (Таблица материалов) в пакеты с растительным материалом. Измельчите зараженные сосуды в экстракционном мешке с помощью ручной болгарки, похожей на пестик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 1-2 мл дополнительно 0,5 М NaOH-PVP, если это необходимо, чтобы получить достаточное количество жидкой вытяжки из пакета.
    3. Добавьте 195 мкл 100 мМ Tris-HCL (pH 8,0) (Таблица материалов) в 1,5 мл пробирки.
    4. Пипетку 5 мкл экстракта из пакетика в пробирку объемом 1,5 мл с 195 мкл 100 мМ Tris-HCL (pH 8,0), разбавляя экстракт в 40 раз.
    5. Сделайте пробирки вихревыми в течение 15-30 с и храните при температуре -20 °C до использования.

2. Синтез и контроль качества crRNA

  1. Выполните транскрипцию.
    1. Используя набор для транскрипции РНК (Таблица материалов), добавьте в 0,2 мл ПЦР-пробирки: 1,5 мкл 10x T7 Reaction Buffer, по 1,5 мкл каждого dNTP, 1,5 мкл смеси ДНК-полимеразы T7, 1 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и 10 мкл 100 мкМ матричной ДНК T7 общим объемом 20 мкл.
    2. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C на водяной бане или в ПЦР-машине не менее 4 часов.
    3. Используйте спектрофотометр (Table of Materials) для определения количества транскрибируемой РНК. Разбавьте РНК до 250 нг/мкл (10 мкг) в объеме 40 мкл, используя воду, не содержащую нуклеаз, или TE-буфер (Дополнительный файл 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Транскрибируемую РНК можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока не будет продолжена обработка ДНКазой и этапы очистки.
  2. Проведите обработку ДНКазой и очистку crРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все действия при комнатной температуре. Храните РНК и фермент ДНКазу I на льду.
    1. Обработайте образец РНК ДНКазой I, входящей в набор для очистки РНК (Table of Materials) в соответствии с инструкцией производителя22.
    2. Очистите образец РНК с помощью набора для очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя, в соответствии с Протоколом II22.
    3. Нанокапните очищенную кРНК, чтобы определить количество и качество присутствующей. Разбавьте РНК до 100 нг/мкл с помощью воды, не содержащей нуклеаз, и храните при -80 °C до использования.
    4. Нагрейте кРНК с помощью красителя, загружающего РНК (Таблица материалов) до 70 °C в течение 10 минут на водяной бане, и подвергните кРНК электрофорезу на 1,5% агарозном геле для визуализации синтезированной кРНК (рис. 2).

3. Реакция на амплификацию рекомбиназной полимеразы (RPA)-Cas12a в одной пробирке для обнаружения in vitro Foc TR4

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор см. на рисунке 3 .

  1. Приготовьте реакционные смеси RPA и Cas12a.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эти шаги выполняются в свободном от ДНК пространстве на льду, с предварительно охлажденными реагентами и материалами. Перед экспериментом протрите рабочую поверхность и пипетки отбеливателем и 70% этанолом. В таблице 1 приведена информация обо всех олигонуклеотидах, использованных в данном исследовании.
    1. Приготовьте реакционную смесь Cas12a объемом 20 мкл в отдельной пробирке объемом 0,5 мл (Таблица материалов) со следующими объемами реагентов: 2 мкл 10x NEBuffer r2.1 (50 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл рекомбинантного альбумина, рН 7,9), 0,4 мкл белка 10 мкМ LbCas12a, 0,6 мкл 100 нг/мкл крРНК, 0,4 мкл 10 мкМ репортера и 16,6 мкл деионизированной воды.
      Примечание: Конечные концентрации белка LbCas12a, крРНК и репортера составляют 200 нМ соответственно.
    2. Приготовьте реакционную смесь объемом 9,5 мкл RPA в отдельной пробирке объемом 0,5 мл со следующими объемами реагентов: 5 мкл 2x Reaction Buffer (конечная концентрация 1x согласно рекомендациям производителя), 1,6 мкл dNTP Mix (конечная концентрация 1,6 мМ), 1 мкл 10x Basic E-Mix (конечная концентрация 1x согласно рекомендациям производителя), 0,5 мкл каждого праймера RPA при 10 мкМ (конечная концентрация 0,5 мкМ каждый), 0,5 мкл 20x Core Reaction Mix (конечная концентрация 1x в соответствии с рекомендациями производителя) и 0,4 мкл деионизированной воды.
    3. Поместите полоску из 8 трубок в штатив для труб (Таблица материалов) на льду.
    4. Перенесите реакционную смесь Cas12a объемом 20 мкл в основание пробирки.
    5. Переложите реакционную смесь 9,5 мкл RPA в крышку полоски пробирки. Добавьте 0,5 мкл 280 нМ MgOAc (конечная концентрация 14 нМ) в реакционную смесь RPA в крышке пробирки и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз.
    6. Добавьте 0,5 мкл деионизированной воды в крышку трубки без шаблонного управления (NTC) и осторожно закройте, чтобы убедиться, что реакционные смеси RPA и Cas12a не смешиваются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надежности результатов включен нешаблонный контроль (NTC).
  2. Добавьте шаблон ДНК и запустите реакцию.
    1. Добавьте 0,5 мкл матричной ДНК к 10 мкл реакционной смеси RPA, содержащей MgOAc в крышке полоски пробирки, за исключением NTC, с деионизированной водой вместо ДНК. Всегда добавляйте заведомо положительную контрольную ДНК Foc TR4 в одну лунку, чтобы убедиться, что анализ работает так, как задумано. Перемешайте пипеткой вверх и вниз.
    2. Осторожно закройте крышки пробирок, чтобы убедиться, что реакция RPA и Cas12a не смешивается.
    3. Включите портативный флуориметр (Таблица материалов) и создайте профиль прогона для анализа RPA-Cas12a (Дополнительный файл 2). Откройте сохраненный профиль Run Profile и поместите полоску пробирки в портативный флуориметр для инкубации в течение 30 минут при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не касаться дна трубок при работе с трубкой; Вместо этого придерживайтесь внешних краев в верхнем левом и правом конце.
    4. Снимите трубку с портативного флуориметра через 30 минут. Переверните пробирки шесть раз, чтобы смешать реакции RPA и Cas12a, и вращайте в мини-центрифуге (см. Таблицу материалов) в течение 5 с.
    5. Поместите полоску пробирки обратно в портативный флуориметр и инкубируйте еще 30 минут при температуре 37 °C, используя сохраненный профиль запуска.
  3. Визуализируйте результаты.
    1. Интерпретируйте средние единицы относительной флуоресценции (РФП), измеренные на портативном флуориметре (Дополнительный файл 2 и руководство пользователя23).
    2. Визуализируйте трубки в синем светодиодном свете на длине волны возбуждения 465 нм с помощью трансиллюминатора синего света (Дополнительный файл 3). Делайте снимки с помощью камеры телефона.

   

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное обнаружение Foc TR4 из зараженного растительного материала с помощью упрощенной экстракции ДНК с последующим комбинированным анализом RPA-Cas12a на портативном флуориметре Genie III показано на рисунке 4A. Положительные образцы показывают видимую флуоресценцию (дорожка 6-8), в то время как отрицательные образцы показывают низкую флуоресценцию конечной точки (полоса 1-5). Когда пробирки с образцами рассматривались под светодиодным синим светом, у инф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Регулярный эпиднадзор является важной стратегией для эффективной профилактики и сдерживания Foc TR4 и других важных инвазивных вредителей. Протоколы обнаружения, которые можно применять в полевых условиях и быстро и точно выявлять патогены, могут ускорить принятие решений и ограничить затраты, связанные с эпиднадзором. С этой целью представленный здесь протокол объединил упрощенную экстракцию ДНК, проведенную непосредственно на отобранном растительном материале, который впоследствии был ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или интеллектуальных интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за финансирование от Национального исследовательского фонда Южной Африки, номер гранта: 138109, в рамках конкурсной поддержки программы для исследователей без рейтинга. Мы также выражаем признательность за финансирование программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» имени Марии Склодовской-Кюри в рамках гранта проекта INDICANTS: 890856.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Белок EnGen Lba Cas12a (Cfp1)New England BiolabsM0653T
EnGen Lba Cas12a DiluentNew England BiolabsB0653A
ПЦР-трубки EppendorfMerckEP0030124332
Микропробирки с безопасным замком EppendorfMerckEP0030121708
Универсальные мешки для извлеченияBIOREBA430100
Лестница ДНК GeneRuler 100 bpThermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Genie Centrifuge Mini-6KOOptiGeneOP-FUGE
Genie IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
Держатель для лент GenieOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Genie StripsOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 — набор для синтеза РНК с высоким выходомNew England BiolabsE2040S
NanoDrop ND-1000 УФ/Vis спектрофотометрThermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
Порошок поливинилпирролидона (PVP)Сигма-Олдрич9003-39-8
Комплект для очистки РНК и концентратора-5Zymo ResearchR1013
Краситель для загрузки РНКThermo Fischer ScientificR0641
SmartBlue Blue Light TransilluminatorAccuris InstrumentsE4000-E
Гранулы гидроксида натрия (NaOH)Merck, EMPARTAK277
Трис (гидроксилметил) аминометанMerck77-86-1
Жидкий базовый набор TwistAmpTwistDxTALQBAS01

Ссылки

  1. Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
  2. Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
  3. Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
  4. Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
  5. Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
  6. Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
  7. Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
  8. Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
  9. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  10. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  11. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  12. Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
  13. Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
  14. Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
  15. Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
  16. Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
  17. Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
  18. Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
  19. Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
  20. Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
  21. Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
  22. RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
  23. Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
  24. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
  25. Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
  26. Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
  27. Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
  28. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  29. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
  30. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
  31. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  32. Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
  33. Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
  34. Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
  35. Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Fusarium OxysporumRPA Cas12a
Комбинированная амплификация рекомбиназной полимеразы CRISPR/Cas12a Анализ для выявления Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.