Нормализация высвобождения глицерина на основе МТТ для точного количественного определения липолиза в первичных адидидимальных адипоцитах ядомашек крыс

Summary

Экспериментальные артефакты, в том числе колебания жизнеспособности клеток и интерференция анализа, препятствуют точному количественному определению высвобождения глицерина в богатых липидами первичных адипоцитах. Чтобы смягчить эти проблемы, используется стратегия нормализации на основе МТТ для корректировки измерений глицерина для метаболической активности клеток, тем самым повышая надежность количественного определения липолиза.

Abstract

Липолиз, важнейший метаболический путь, включает в себя гидролиз накопленных триглицеридов в свободные жирные кислоты и глицерин. Тем не менее, точное количественное определение выхода глицерина в богатых липидами первичных адипоцитах часто затрудняется экспериментальными артефактами, такими как вариабельность жизнеспособности клеток и интерференция анализа. Для устранения этих ограничений был разработан простой метод нормализации измерений высвобождения глицерина с использованием анализа жизнеспособности клеток на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Этот протокол использует разницу в удельном весе между адипоцитами и водными растворами, что позволяет одновременно количественно оценить липолитический выход и жизнеспособность клеток. В экспериментах по скринингу лекарств правастатин и симвастатин значительно увеличивали высвобождение глицерина из абдоминальных адипоцитов, в то время как аторвастатин и ловастатин существенно не изменяли выход глицерина. Эти результаты свидетельствуют о том, что нормализация на основе МТТ предлагает надежный и удобный подход к точной количественной оценке липолиза с потенциальными приложениями для разработки лекарств, направленных на ожирение и метаболический синдром. Это исследование подчеркивает необходимость переоценки традиционных анализов липолиза, чтобы отличить подлинные метаболические реакции от неспецифической утечки через мембрану.

Introduction

Жировую ткань можно разделить на белую жировую ткань (WAT) и бурую жировую ткань (BAT)¹. WAT выполняет функцию накопления избыточной энергии в виде триглицеридов, в то время как BAT выполняет функцию генерации тепла для поддержания температуры тела, которая преобразует химическую энергию в тепловую энергию при стимуляции холодом¹. Жировая ткань также выполняет эндокринную функцию². Он может выделять различные гормоны, цитокины и метаболиты (в совокупности называемые адипокинами) и контролировать энергетический баланс организма, регулируя пищевое поведение центральной нервной системы и метаболическую активность окружающих^{тканей.}

Липолиз представляет собой поэтапный процесс гидролиза внутриклеточных липидов под действием ряда липолитических ферментов ^3,4. В адипоцитах липиды в основном хранятся в каплях липидов в виде триглицеридов⁵. Липидные капли покрыты семейством липидных капель-ассоциированных белков перилипина, которые препятствуют гидролизу триглицеридов липолитическими ферментами ^6,7. Однако, когда сигнал липолиза усиливается, уровни экспрессии семейства перилипинов в адипоцитах снижаются, и липолитические ферменты попадают в липидные капли ^3,4. Следовательно, триглицериды разлагаются на глицерин и свободные жирные кислоты ^3,4,5.

Липолиз, расщепление накопленных триглицеридов на глицерин и свободные жирные кислоты, является фундаментальным процессом в метаболизме адипоцитов⁸. В то время как прямое измерение продуктов липолиза, таких как глицерин, дает ценную информацию, точное количественное определение было сложной задачей, особенно в взвешенных первичных адипоцитах из-за операционных ошибок, возникающих из-за различий в количестве клеток между экспериментальными группами. Данное исследование было направлено на решение этой проблемы с помощью анализа жизнеспособности клеток для нормализации количественной оценки высвобождения глицерина из первичных абдоминальных адипоцитов крыс. Стандартизировав метод измерения, анализ нормализованного высвобождения глицерина был применен в качестве потенциального инструмента для разработки лекарств, направленных на лечение ожирения и метаболического синдрома в адипоцитах.

Protocol

Этот протокол использует разницу в удельном весе между адипоцитами и водными растворами, чтобы обеспечить одновременное измерение высвобождения глицерина (в качестве индикатора липолиза) и жизнеспособности клеток 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) в одних и тех же лунках 96-луночного планшета, тем самым оптимизируя экспериментальный рабочий процесс и повышая эффективность.

Все процедуры на животных соответствовали рекомендациям ARRIVE, а также проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH No 8023, пересмотренная в 1978 году). Протокол исследования был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (номер одобрения 202112, утвержден 5 мая 2021 года). Самцы крыс линии Wistar, использованные в этом исследовании, были в возрасте не менее 8 недель с массой тела ≥200 г в стандартных условиях содержания. Жировую ткань придатка яичка белого цвета собирали с типичным выходом 0,6-0,8 г на крысу. Примечательно, что у старых крыс или крыс, которых кормили пищей с высоким содержанием жиров, наблюдалось значительно увеличенная масса белой жировой ткани (часто 1,5-3 г), что требовало пропорциональной корректировки концентраций ферментов пищеварения (например, коллагеназы) для поддержания постоянной эффективности диссоциации тканей. Исключительное использование самцов крыс позволило избежать потенциальных искажающих эффектов от гормональных колебаний гормонального цикла самок. Селекция штаммов (например, Sprague-Dawley, Wistar или Long-Evans) постоянно поддерживалась в рамках экспериментов для обеспечения генетической однородности в реакциях жировой ткани. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Выделение первичных абдоминальных адипоцитов крыс

1. Обезболите взрослого самца крысы Вистар с помощью внутрибрюшинной инъекции 7% хлоралгидрата (растворенного в дистиллированном_Н2О) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
2. Подтвердите полную анестезию, проверив отсутствие рефлекторных реакций, затем сделайте средний разрез брюшной полости с помощью стерильных хирургических ножниц.
3. Осторожно удалите висцеральную жировую ткань с левой и правой сторон придаткового жирового пакета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адидидимы придатка яичка относительно большие и плавучие, что облегчает разделение и анализ.
4. Переведите собранную ткань в фосфатно-солевой буфер (PBS; Рисунок 1А).
5. Дважды промойте ткань PBS, чтобы удалить загрязнения, в том числе прилипшие кровеносные сосуды и тромбы.
6. Промытую салфетку нарежьте небольшими кусочками.

2. Очищение первичных абдоминальных адипоцитов крыс

1. Рассеченную жировую ткань инкубировать с трипсином и коллагеназой II типа (10 мг в 10 мл раствора трипсина) при 37 °С в течение 2 ч при встряхивании.
2. Отфильтруйте переваренную жировую ткань через клеточное ситечко (рисунок 1A).
3. Центрифугируйте фильтрат при 120 × г в течение 3 мин при комнатной температуре для удаления остаточной ферментативной активности.
4. Перенесите взвешенные адипоциты (верхний белый слой) в чистую пробирку и промойте их PBS.
5. Центрифугируйте фильтрат при 120 × г в течение 3 мин при комнатной температуре для удаления PBS.
6. Отфильтрованные адипоциты (верхний белый слой) инкубируют в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора пенициллин-стрептомицина в течение не более 30 минут.

3. Анализ выделения глицерина

1. Засейте отфильтрованные адипоциты (10-10-5 клеток на лунку; 200 мкл) в 96-луночный планшет для культивирования клеток.
   Примечание: Адипоциты количественно определяли с помощью стандартного гемоцитометра. Из-за больших различий в размерах адипоцитов некоторые более крупные клетки не могут быть точно подсчитаны. Таким образом, количество клеток может не точно отражать фактическое количество адипоцитов. Основная цель заключалась в том, чтобы добиться равномерного распределения ячеек по лункам, а не точного количественного определения.
2. Обрабатывайте адипоциты 0,05% диметилсульфоксидом (ДМСО; в контрольной группе) и 50 мкМ аторвастатином, правастатином, ловастатином и симвастатином в течение 4 ч при 37 °C при легком встряхивании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия лечения приведены в качестве справочной информации и могут быть скорректированы по мере необходимости в зависимости от конкретных целей и плана эксперимента.
3. Соберите питательную среду для клеток (нижний красный слой) для анализа выброса глицерина, который указывает на начало липолиза (рисунок 1B).
4. Используйте коммерческий набор для анализа высвобождения глицерина для оценки липолиза адипоцитов в ответ на различные методы лечения.
5. Измерьте поглощение на длине волны 570 нм с помощью считывателя микропланшетов.

4. Анализ жизнеспособности клеток

1. Порошок МТТ растворить в концентрации 5 мг/мл в дистиллированном H₂O и стерилизовать через фильтр 0,22 мкм перед использованием.
2. После анализа выделения глицерина добавьте раствор МТТ (до конечного значения 0,5 мг/мл) в клетки и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч.
3. Перенесите взвешенные адипоциты (верхний фиолетовый слой) в чистую пробирку, содержащую ДМСО, для анализа жизнеспособности клеток (Рисунок 1B).
4. В вихре кратковременно для растворения фиолетовых формазана образуются кристаллы.
5. Измерьте поглощение на длине волны 570 нм с помощью считывателя микропланшетов.

5. Расчет нормирования

1. Проводите все эксперименты в трех экземплярах и повторите четыре раза (n = 4).
   Примечание: Для каждого независимого эксперимента (n = 4) адипоциты были выделены от трех крыс, и каждое условие лечения выполнялось в трех экземплярах.
2. Для каждой группы лечения разделите значение абсорбции высвобождения глицерина на соответствующее значение абсорбции жизнеспособности клеток.
3. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение и SD были рассчитаны с помощью Microsoft Excel с функциями =AVERAGE(range) и =STDEV. S(диапазон). Для групповых сравнений непарные двусторонние t-критерий проводили с помощью GraphPad Prism 6 с функцией t-критерия средних Compare.
4. Определите статистическую значимость различий между группами с помощью t-критерия Стьюдента, при этом P-значение менее 0,05 считается статистически значимым.

Results

После предварительного скрининга лекарственных средств для исследования липолитических эффектов в адипоцитах методом нормализованного высвобождения глицерина использовали антигиперлипидемические препараты^{статинов9}.

Влияние статинов на высвобождение глицерина из первичных абдоминальных адипоцитов крыс
Влияние статинов на липолиз в первичных абдоминальных адипоцитах крыс оценивали путем обработки клеток 50 мкМ правастатина, симвастатина, аторвастатина,...

Discussion

Это исследование обеспечивает более точный метод измерения липолиза в первичных адипоцитах, насыщенных липидами. Было обнаружено, что правастатин и симвастатин индуцируют высвобождение глицерина и снижают жизнеспособность в эпидидимальных адипоцитах крыс, в то время как аторвастатин и ловастатин не показали существенных эффектов. Применение симвастатина приводило к минимальному повышению высвобождения глицерина из адипоцитов. Для решения этой проблемы был использован анализ МТТ для станд...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22-&микро; М фильтр	Сангон Биотех Ко. Лтд.	F513165-0001	Шприцевой фильтр, Aquo-система, стерильный
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид	Сангон Биотех Ко. Лтд.	A600799-0001	1 г
96-луночные планшеты для клеточных культур	Сангон Биотех Ко. Лтд.	F603204-0001	стерильный
Аторвастатин кальциевая соль	Кайман Кемикал	10493-5	5 мг
Сетчатый фильтр для ячеек	Сангон Биотех Ко. Лтд.	F513450-0001	Сетка 80
Гидрат хлорала	Сангон Биотех Ко. Лтд.	A500288-0250	250 г
Диметилсульфоксид	Сангон Биотех Ко. Лтд.	A460700-0100	100 мл
Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco	Сангон Биотех Ко. Лтд.	E600003	500 мл, с высоким содержанием глюкозы, стерильный
Фетальная бычья сыворотка	Сангон Биотех Ко. Лтд.	E600001	100 мл, стерильный
Набор для колориметрического анализа глицерина	Кайман Кемикал	10010755-96	96 скважин
Ловастатин	Кайман Кемикал	10010338-5	5 мг
Самцы взрослых крыс	Университет Путян	Вистар	примерно 10-12 недель
Пенициллин-стрептомицин раствор	Сангон Биотех Ко. Лтд.	B540732-0010	10 мл, стерильный
Фосфатно-солевой буфер	Сангон Биотех Ко. Лтд.	E607009-0500	500 мл, стерильный, без кальция и магния
Правастатин натриевая соль	Кайман Кемикал	10010343-5	5 мг
Симвастатин	Кайман Кемикал	10010344-5	5 мг
Раствор трипсина	Сангон Биотех Ко. Лтд.	E607003-0100	100 мл, без ЭДТА и фенола красного, стерильный
Коллагеназа II типа	Сангон Биотех Ко. Лтд.	A004174-0100	100 мг