Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение проницаемости кишечного барьера путем обнаружения потока флуоресцентных индикаторов через монослои колоноидов человека

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод измерения целостности кишечного барьера, в соответствии с которым скорость транслокации флуоресцентно меченного сахара известного размера отражает проницаемость кишечных колоноидов человека, полученных из тканей.

Аннотация

Кишечный барьер является критически важным местом регуляции между люминальными антигенами и иммунной системой хозяина, и его нарушение регуляции связано с множественными желудочно-кишечными заболеваниями. Кишечные органоиды могут быть полезным инструментом для понимания и моделирования различий в целостности кишечного барьера. В этой статье мы опишем протокол, в котором используются человеческие колоноиды для количественной оценки различий функционального кишечного барьера путем измерения потока флуоресцентных индикаторов через монослои органоидов. После выращивания монослоев до слияния мы добавляем флуоресцентный индикатор, такой как FITC-декстран, в апикальную камеру и обнаруживаем его транслокацию в базолатеральную камеру с течением времени. Повышенная транслокация флуоресцентного индикатора отражает более проницаемый или более слабый эпителиальный барьер. Этот протокол представляет собой адаптируемую платформу, которая позволяет оценить различия функционального кишечного барьера при нескольких состояниях одновременно. Используя вариации этого протокола, можно оценить трансэпителиальную проницаемость для молекул различного размера, формы и химической структуры, а также различия в проницаемости в контексте изолированных обработок или изменений микроокружения на апикальной или базолатеральной сторонах эпителиальных клеток. Это позволяет глубже понять механизм и лечение нарушения барьера при заболеваниях.

Введение

Слизистая оболочка кишечника представляет собой сложную структуру, которая играет важную роль в регулировании контакта между метаболитами, антигенами и микробами в просвете кишечника с иммунной системой и кишечным кровообращением. Эпителиальные клетки кишечника являются ключевым компонентом этой системы, и в здоровых условиях образуют высокоселективный барьер. Транспортировка через эпителий может происходить с помощью нескольких механизмов: трансцеллюлярного активного или пассивного транспорта, парацеллюлярных пор или путей утечки, регулируемых плотными соединениями и адгезионными соединениями. Может ли какой-либо из этих путей быть использован молекулой для перемещения по эпителию, определяется гидрофобностью, размером и химической структурой. Попадая через эпителий, эти молекулы могут легче взаимодействовать с иммунными клетками слизистой оболочки и попадать в кровообращение или лимфатическую циркуляцию кишечника 1,2 Нарушение кишечного барьера является отличительной чертой нескольких воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как воспалительные заболевания кишечника и целиакия 1,3,4,5,6,7. Считается, что этот ослабленный кишечный барьер играет роль в патофизиологии этих патологических процессов посредством нерегулируемой транслокации патогенных антигенов, которые затем могут вызывать местную или системную воспалительную реакцию.

Существует несколько установленных протоколов измерения кишечного барьера. В исследованиях in vitro традиционно используются линии раковых клеток, такие как клетки T84 или Caco-2, для измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и количественного определения компонентов плотных и адгезивных соединений8. Ex vivo можно измерить трансэпителиальный ток с помощью камер Уссинга на биопсии или резецированных образцах кишечника9. Исследования in vivo обычно включают пероральный ввод инертных индикаторов с последующим измерением абсорбции этих индикаторов кровью или мочой10,11. Хотя эти методы оказались полезными в изучении кишечного барьера, они имеют несколько ограничений: трансформированные бессмертные клеточные линии по своей природе имеют метаболические и цитоскелетные изменения, которые влияют на кишечный барьер плохо определенным образом; доступ к пациентам, образцам пациентов или модельным организмам может быть ограничен; Исследования in vivo трудно контролировать на предмет искажающих факторов или делать выводы на молекулярном уровне. Таким образом, несмотря на то, что доказательства этого нарушения барьера были зарегистрированы во многих моделях заболеваний, понимание механизма этих дефектов кишечного барьера остается ограниченным, и наша способность нацеливаться и лечить этот аспект желудочно-кишечного заболевания остается недостижимой.

Кишечные органоиды человека обладают уникальной и захватывающей способностью выяснять причину и лечить дефекты кишечного барьера. Органоиды кишечника человека, полученные из тканей, представляют собой первичные клеточные культуры, полученные из взрослых стволовых клеток, расположенных в основании кишечных крипт12. Эти клетки могут быть выделены из биопсийных или хирургических образцов и культивированы для поддержания генетических и эпигенетических изменений, наблюдаемых у пациентов, от которых они были получены 13,14,15. Они служат более физиологически значимой моделью, чем традиционные бессмертные клеточные линии, поскольку они не имеют метаболических изменений, как раковые клеточные линии, и могут быть дифференцированы в различные типы клеток, присутствующих в зрелом кишечном эпителии 16,17,18. Кроме того, поскольку они могут быть расширены in vitro, они более доступны и полезны для контролируемых исследований клеточного эффекта различных методов лечения и условий роста параллельно. Несмотря на то, что существуют ограничения, присущие моделям кишечных органоидов, в первую очередь отсутствие других неэпителиальных типов клеток и контекст всей системы организма, было показано, что кишечные органоиды человека обеспечивают надежную модель для многих аспектов желудочно-кишечныхзаболеваний.

Среди них было показано, что кишечные органоиды точно моделируют дефекты кишечного барьера, демонстрируя ожидаемые изменения в организации плотных соединений и TEER в условиях барьерных повреждений 19,20,21. Здесь мы адаптируем один из методов оценки целостности барьера в колоноидах человека, в котором обнаруживается поток флуоресцентно помеченных молекул через монослои органоидов22. В этом протоколе органоиды выращиваются и созревают в поляризованные двумерные монослои на полупроницаемых мембранах. Анализ включает в себя добавление флуоресцентного индикатора к апикальной поверхности эпителиального монослоя, и его присутствие на противоположной стороне количественно оценивается с течением времени. Повышенный поток индикатора является отражением более негерметичного или более проницаемого эпителия. Этот анализ обеспечивает считывание функционального барьера, которое может быть дополнением к оценке структуры плотных и адгезивных соединений. Кроме того, хотя измерения TEER часто используются для базовой оценки целостности барьера, описанный здесь анализ потока может быть адаптирован для определения проницаемости молекул различных классов, заряда и размера, тем самым характеризуя барьер гораздо более подробно. Для этой цели можно использовать несколько коммерчески доступных флуоресцентных индикаторов. Кроме того, с помощью неперекрывающихся флуоресцентных спектров можно одновременно оценить проницаемость для нескольких индикаторов. Кроме того, монослойная конфигурация этого анализа позволяет оценить барьерную реакцию на условия роста, применяемую конкретно к апикальной или базолатеральной поверхности клеток. Благодаря этому возможна контролируемая оценка эффекта терапии, изменений микросреды и условий совместного культивирования.

Известно, что дефекты кишечного барьера играют важную патогенетическую роль в развитии ряда желудочно-кишечных заболеваний, но термин «дырявый кишечник» все чаще используется в популярных средствах массовой информациибез точности. Это подчеркивает необходимость совершенствования моделей для оценки и характеристики кишечного барьера. В описанной системе используются монослои кишечных органоидов, полученных из физиологических тканей человека, для оценки целостности функционального барьера в контролируемых условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все образцы были получены и использованы в соответствии с протоколом, утвержденным Советом по институциональному обзору (IRB) Университета Колорадо, протокол No 14-2012.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на этапах 1-3 должны выполняться в стерильном шкафу биобезопасности с использованием стерильной техники. Схема протокола представлена на рисунке 1.

1. Получение колоноидов человека из замороженных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все материалы готовы в шкафу биобезопасности перед размораживанием клеток, чтобы свести к минимуму воздействие размороженных органоидов на замерзающую среду. Протокол начинается с криоконсервированных тканей человеческих колоноидов. Протоколы получения и криоконсервации колоноидов человека были описаны ранее24.

  1. Приготовление органоидной среды для кишечника человека
    1. Готовят кондиционированную среду Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) в соответствии с ранее описанными протоколами25,26.
    2. Дополняйте среду L-WRN следующими факторами роста: эпидермальный фактор роста [50 нг/мл], никотинамид [10 мМ], А83-01 [500 нМ], SB202190 [10 мкМ], CHIR99021 [3 мкМ], тиазовавин [4 мкм], SB431542 [4 мкм], гастрин I [10 нМ].
    3. Смешайте добавленную среду L-WRN в соотношении 1:1 с коммерческими кишечными органоидными средами.
    4. Непосредственно перед применением примите добавку с Y-27632 [10 μM].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный состав органоидной среды для кишечника может варьироваться в зависимости от лабораторной и колоноидной линии. Также возможно использование только добавок среды L-WRN или использование только коммерческих органоидных сред для кишечника. Использование в этом протоколе равных частей кондиционированных сред L-WRN и коммерческих сред более устойчиво к вариабельности от партии к партии по сравнению с использованием только кондиционированных сред и является более экономичным по сравнению с использованием только коммерческих сред.
  2. Приготовление дифференцировочной среды
    1. Дополните DMEM/F12 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллин-стрептомицином и 2 мМ L-аланил-L-глутамином дипептидом.
    2. Смешайте с добавлением DMEM/F12 1:1 с кишечной органоидной средой стебля с шага 1.1
  3. Препарирование внеклеточного матрикса (ВКМ)
    1. Разморозьте ECM на ночь на льду, затем приготовьте 100 μL аликвот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты можно повторно замораживать при температуре -20 °C. Подробности см. в инструкциях производителя.
    2. Инкубируйте аликвоты на льду до момента нанесения покрытий ячеек.
  4. Размораживание и гальванизация органоидов
    1. Разморозьте содержимое криовиала на водяной бане при температуре 37 °C, следя за тем, чтобы флакон оставался погруженным, но крышка находилась над водой, пока он не оттает.
    2. Переложите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 13 мл среды с ледяным добавлением DMEM/F12 (из шага 1.2.1).
    3. Центрифугировать при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 1 мл остаточного объема над клеточной гранулой.
    5. Поставьте трубку на лед. Добавьте 1 мл ледяной добавки DMEM/F12 (из шага 1.2.1) и пипетируйте суспензию пипеткой 10-15 раз, чтобы повторно суспендировать гранулу.
    6. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, оставив как можно меньше остатков промывочной среды над гранулой клетки.
    8. Добавьте в гранулу 100 μл размороженного ECM. Тщательно восстановите суспендию, убедившись, что органоиды равномерно распределены без комков. Делайте пипетку медленно, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.
    9. Планшет ECM путем пипетирования примерно 10 куполов или трехмерных капель ECM, примерно по 10 мкл каждый, в одну лунку 6-луночного планшета.
    10. Быстро переверните пластину и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 5-10 минут или до тех пор, пока купола не затвердеют.
    11. После того, как купола установятся, добавьте в лунку 2 мл кишечных органоидных стеблевых сред (из шага 1.1).
    12. Инкубировать при 37 °C, в увлажненном инкубаторе с 5%CO2. Заменяйте носитель каждые 2 дня.
    13. Приступайте к шагу 2 после того, как органоиды либо занимают более 75% площади купола ECM, либо накапливают центральный мусор.

2. Пассирование и экспансия колоноидов человека

  1. Для каждой скважины отсасывайте питательную среду из лунок, не нарушая купола ECM.
  2. Аккуратно промойте купола 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS), затем удалите PBS.
  3. Добавьте по 1 мл ледяного трипсина в каждую лунку. С помощью пипетки разбивайте купола ЭХМ путем пипетирования вверх и вниз. Пипеткой нанесите смесь 10-15 раз до полной диссоциации ЭКМ.
  4. Выдерживайте тарелку при температуре 37 °C в течение 3-5 минут.
  5. Добавьте в лунку 1 мл ледяной добавки DMEM/F12 (из шага 1.2.1) для нейтрализации трипсина. Энергично пипетируйте смесь 20-30 раз до тех пор, пока клетки не разделятся на кластеры по 2-3 клетки в каждом.
  6. Перенесите клеточную суспензию в коническую форму объемом 15 мл.
  7. Используйте дополнительно 1 мл дополненного DMEM/F12 (из шага 1.2.1) для промывки лунки и добавьте раствор для промывки в коническую форму объемом 15 мл.
  8. Добавьте дополненный DMEM/F12 (из шага 1.2.1), чтобы получить общий объем 13 мл в конической форме объемом 15 мл.
  9. Выполните шаги 1.4.3-1.4.12 шага 1, используя соответствующее количество ECM для расширения в дополнительные скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сливающаяся лунка органоидов в ЭКМ объемом 100 мкл обычно может быть проведена в 2-3 лунки (200-300 мкл ЭКМ). Одной сливной лунки органоидов достаточно примерно для 3-6 монослоев на этапе 3.

3. Генерация монослоев колоноидов человека

  1. Вставки для клеточных культур с коллагеновым покрытием
    1. Поместите вкладыши из полистироловых клеточных культур (размер пор 0,4 мкм) в 24-луночный планшет и добавьте 100 мкл раствора коллагенового покрытия в апикальную камеру каждого вкладыша.
    2. Запечатайте пластину герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение.
    3. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 4-24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в результатах в течение этого времени инкубации отсутствует, но можно выбрать более короткое или более длительное время инкубации в соответствии с удобной точкой паузы.
  2. Гальваническое покрытие монослоев органоидов
    1. Выполните шаги 2.1-2.5 для диссоциации органоидов.
    2. Пропустите клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
    3. Промойте лунки по 1 мл добавленного DMEM/F12 (с шага 1.2.1). Соберите этот промывочный материал и пропустите его через сетчатое фильтр.
    4. Промойте сетчатый фильтр с добавлением DMEM/F12 (с шага 1.2.1) до тех пор, пока общий объем в конической пробирке объемом 50 мл не достигнет 15 мл.
    5. Перелейте фильтрат в коническую форму объемом 15 мл.
    6. Центрифугировать при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Отсадите надосадочную жидкость, оставив 1 мл над гранулой.
    8. Добавьте еще 1 мл дополненной среды DMEM/F12 (из шага 1.2.1) и повторите.
    9. Исследуйте суспензию под микроскопом, чтобы подтвердить полную диссоциацию. При необходимости энергично пипетируйте клетки до тех пор, пока они не станут в основном одиночными клетками.
    10. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, оставив как можно меньше остатков промывочной среды над гранулой клетки.
    11. Ресуспендируйте в небольшом объеме (200-1000 мкл) кишечную органоидную среду стебля (с шага 1.1). Держите на льду.
    12. Возьмите аликвоту клеточной суспензии для подсчета жизнеспособных клеток предпочтительным методом. Используйте количество жизнеспособных клеток для определения объема суспензии клеток, необходимого для нанесения 100 000 жизнеспособных клеток на одну вставку.
    13. Отсасывайте раствор коллагенового покрытия из каждой вставки, не касаясь мембраны вставки.
    14. Добавьте соответствующий объем кишечных органоидных стволовых сред (начиная с шага 1.1) в апикальную камеру каждого вкладыша, чтобы довести конечный объем до 200 мкл после добавления клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании клеточную суспензию на стадии 3.2.12 можно довести до конечной концентрации 100 000 клеток/200 мкл, а затем 200 мкл можно ввести в апикальную камеру. Однако, если вся суспензия ячеек не используется для нанесения однослойного покрытия, это может привести к чрезмерной трате среды.
    15. Добавьте соответствующий объем клеточной суспензии в апикальную камеру.
    16. Добавьте 500-1000 μL кишечных органоидных стволовых сред в базолатеральную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл достаточно для типичных колоноидов. Если клетки более метаболически активны или иным образом чувствительны к накоплению продуктов жизнедеятельности, использование большего объема в базолатеральной камере может быть полезным для поддержания роста.
    17. Повторите для всех вкладышей/лунок.
    18. Инкубировать при 37 °C, в увлажненном инкубаторе с 5%CO2.
    19. Заменяйте носители один раз в неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представляющие интерес методы лечения могут быть применены к апикальным и/или базолатеральным камерам вкладышей в любое время до или после нанесения покрытия.

4. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и созревания монослоя

  1. Измерение сопротивления
    1. Используйте эпителиальный вольтметр/омметр на настройке ома. Очистите зонд, протерев его салфеткой, смоченной в 70% этаноле. Поместите более длинное плечо электрода в базолатеральный отсек, а более короткое плечо — в апикальный отсек вставки. Запишите измерение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерения TEER также представляют интерес для конечной точки, также проведите измерения сопротивления вставки с коллагеновым покрытием без клеток в качестве фона. Затем TEER рассчитывается как (сопротивление - сопротивление фоновой вставки) x площадь поверхности вставки. Площадь поверхности вставки в этом протоколе составляет 0,33см2. Этот расчет даст TEER в ом·см2. При использовании эпителиального вольтметра/омометра, отличного от указанного в таблице материалов, используйте инструкции производителя по использованию измерителя для измерения сопротивления.
    2. Повторяйте ежедневно до выхода измерений на плато.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плато обычно наступает через 2-3 недели при ТЭР более 200 Ом·см2, но варьируется в зависимости от линии колоноидов и условий роста.
  2. Как только резистентность выйдет на плато, начните созревание органоидов, заменив стебель средой для дифференцировки (начиная с шага 1.2).
  3. Продолжайте ежедневные измерения TEER. Ожидайте увеличения TEER и второго плато.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Второе плато обычно происходит около 7 дней с TEER 1500-2500 Ом·см2, но это зависит от линии колоноидов и условий роста.
  4. После того, как измерения TEER выйдут на плато во второй раз, перейдите к шагу 5.

5. Анализ флюса FITC-декстрана

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется FITC-декстран 4 кДа (радиус Стокса 14 Å). Однако, в зависимости от экспериментальных потребностей, могут быть использованы флуоресцентные индикаторы различных размеров, зарядов и флуорофоров22. Также можно одновременно использовать несколько индикаторов, и в этом случае необходимо подтвердить неперекрывающиеся спектры возбуждения и эмиссионной флуоресценции. Шаги 5.1-5.3 рекомендуется выполнять в согревающем шкафу (неувлажненном, не содержащемCO2 инкубаторе), установленном на 37 °C. Если это невозможно, реагенты следует нагреть до 37 °C перед использованием, а клетки, буферы и собранные образцы следует хранить при 37 °C во время инкубации.

  1. Подготовка реагентов
    1. Приготовьте буферный солевой раствор Хэнка (HBSS) с 10 мМ HEPES и отрегулируйте pH до 7,4. Прогреть до 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости приготовьте HBSS+HEPES с интересующими вас процедурами. Приготовьте достаточно для 80 мкл/лунка в апикальной камере и 1 мкл/лунку в базолатеральной камере.
    2. Налейте около 50 мл теплого HBSS+HEPES в небольшой стакан для полоскания вкладышей. Имейте рядом стакан большего размера для жидких отходов.
    3. Полностью разморозить ФИТК-декстран 4 кДа. Приготовьте раствор 1,25 мг/мл в HBSS с помощью HEPES. Приготовьте достаточный объем раствора ФИТК-декстрана, чтобы распределить 80 мкл на лунку и 1 мкл для стандартной кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная концентрация может быть отрегулирована в зависимости от размера и ожидаемой проницаемости индикатора. Например, меньшие или более распространенные индикаторы могут быть добавлены в более низкой концентрации для сохранения реагентов. Если необходимо провести лечение в апикальной камере, приготовьте раствор ФИТК-декстрана в надлежащим образом обработанном HBSS+HEPES.
  2. Применение ФИТК-декстрана к монослоям
    1. Приготовьте свежую 24-луночную пластину, добавив 1 мл HBSS+HEPES (при желании с обработкой) в соответствующие лунки.
    2. Промойте монослои органоидов, захватив вставку щипцами, вытащите ее из колодца, опустите в стакан, содержащий теплый HBSS+HEPES (из шага 5.1.2), чтобы заполнить апикальную камеру, затем переверните его над стаканом для отходов, чтобы слить раствор для промывки.
    3. Повторите эту стирку еще 2 раза.
    4. Поместите вкладыш в соответствующую лунку свежей тарелки, подготовленной на шаге 5.2.1.
    5. Осторожно нанесите пипеткой 80 мкл раствора FITC-декстрана в апикальную камеру. Нанесите пипетку на боковую сторону вкладыша во избежание нарушения монослоя.
    6. Повторите шаг 5.2.5 для всех монослоев.
    7. Добавляйте HBSS или PBS в любые пустые лунки для поддержания влажности.
  3. Сбор проб флюса
    1. Сразу после шага 5.2.7 соберите 70 мкл из базолатеральной камеры каждой лунки в лунку плоского черного 96-луночного планшета с прозрачным дном и храните в защищенном от света месте при температуре 37°С. Это будет временная точка 0.
    2. Инкубируйте тарелку, защищенную от света, при температуре 37 °C.
    3. Каждые 30 мин в течение 2 ч перемешивайте буфер в базолатеральной лунке, затем набирайте дополнительные 70 мкл в пустые лунки 96-луночного планшета с чистым дном из стадии 5.3.1.
  4. Подготовка стандартной кривой
    1. Добавьте 1 мкл зарезервированного раствора ФИТК-декстрана (1,25 мг/мл; шаг 5.1.3) в 999 мкл HBSS+HEPES. Это будет разведение 1:1000 или 1,25 г/мл для стандартной кривой.
    2. Последовательно разбавляйте этот раствор 1:1, взяв 150 мкл раствора и добавив его к 150 мкл HBSS+HEPES, затем хорошо перемешайте. Повторите это еще десять раз, чтобы получить в общей сложности 12-ступенчатое разбавление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаст стандартную кривую: 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,13, 39,06, 19,53, 9,77, 4,88, 2,44, 1,22 и 0,61 нг/мл. В зависимости от проницаемости клеточных линий стандартная кривая может нуждаться в большей или меньшей концентрации. При первом проведении эксперимента резервируйте дополнительный раствор FITC-декстрана 1,25 мг/мл на случай, если стандартную кривую придется перестроить при другой концентрации.
    3. Пипетируйте 70 мкл каждого разбавления стандартной кривой в пустые лунки 96-луночного планшета с прозрачным дном из этапов 5.3.1 и 5.3.3. Повторите для второго повторения.
  5. Измеряют флуоресценцию на люминесцентном считывателе со следующими настройками: возбуждение 490 нм, излучение до 520 нм, считывание с нижней части пластины, с коэффициентом усиления 100 и высотой считывания 7 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте длины волн возбуждения/излучения в соответствии с выбранным флуорофором.
  6. Анализ данных
    1. Постройте стандартную кривую с концентрацией по оси x и флуоресценцией по оси y. Используйте это уравнение для определения уравнения линейной регрессии.
    2. Используйте это уравнение линейной регрессии и флуоресцентные показания образцов для расчета концентрации FITC-декстрана в каждый момент времени для каждого образца.
    3. Постройте график концентрации во времени для каждого образца и рассчитайте наклон уравнения линейной регрессии, который представляет микрограммы/мин (мкг/мин). Разделите это на площадь поверхности вставки для клеточной культуры (0,33 см), чтобы определить скорость потока в микрограммах в минуту на квадратный сантиметр (мкг/мин/см2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью этого протокола была проанализирована проницаемость здоровых колоноидов человека при наличии и отсутствии воспалительной сигнализации. Ранее было показано, что добавление смеси воспалительных цитокинов, называемой цитомиксом, которая включает IFNγ, TNFα и IL-1β (каждый в концентрации 10 нг/мл), индуцирует дисфункцию кишечного барьера, измеренную с помощью TEER в моделях эпителиальных клетоккишечника 20,27. Мы стремились определить, можно ли повторить эт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это протокол для оценки кишечного барьера в физиологически репрезентативной модели монослоев колоноидов человека. Описанный здесь анализ потока флуоресцентных индикаторов предоставляет информацию о функциональной целостности барьера по сравнению с тем, что можно получить с помощью других типов барьерных анализов, таких как TEER, измерения в камере Уссинга или оценка экспрессии белка в узком контакте. Кроме того, использование моделей кишечных органоидов, полученных от пациентов, дает пре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Отсутствует разглашение информации или конфликт интересов.

Благодарности

Доктор Шон Колган финансируется грантами NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 и VA Merit BX002182.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конические центрифужные пробирки объемом 15 млКлеточный тракт229411
2 мл внутреннего резьбового криогенного флакона Корнинг430488
Конические центрифужные пробирки объемом 50 млКлеточный тракт229421
6-луночный планшет, обработанный культурой тканейКлеточный тракт229106
70 μ Сетчатый фильтр M CellСокол352350
96-луночный черный/прозрачная нижняя пластинаТермо Сайентиал165305
А83-01 НИР D2939
Считыватель пластин BioTek SynergyAgilentСинергия H1
Cellometer Auto T4 Счетчик яркопольных ячеекНэкселькомСМТ-АТ4П
Камеры для подсчета клеток на целлометреНэкселькомNC1531583
CHIR99021Сигма-ОлдричSML1046-5МГ
Раствор для коллагенового покрытия Применение ячеек125-50
ДМЭМ/Ф-12Gibco11330057
ДМСОСигма-ОлдричD2650-100МЛ
Этанол 100%Научный центр ФишераА4094
Вольтомметр EVOM2 с электродом STX2Мировые прецизионные приборыNC9792051
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ЦитиваSH30396.03HI
Наконечники для фильтрации пипетокНаучный центр Фишера02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-декстран, 4 кДаСигма-Олдрич46944
Гастрин I (человек)НИР D3006
GlutaMAX Научный центр Фишера35050061200 мМ L-аланил-L-глутамин дипептид
Хэнкс буферизованный солевой раствор 10xТермо Сайентиал14065056
ГЕПЕС 1МТермо Сайентиал15630080
Интерферон гамма рекомбинантный человеческийБиолегенда575308
Интерлейкин 1 бета рекомбинантный человеческийТермонаучная200-01Б-500УГ
IntestiCult Кишечная органоидная среда для роста (человек)Технологии стволовых клеток06010 Коммерческие кишечные органоидные среды
Живой инвертированный микроскопОлимпIX85
МатригельКорнинг354234Внеклеточный матрикс (ВКМ)
Микробиологический инкубаторНаучный центр Фишера151030515
Мультилуночный планшет для суспензионной культуры, 24 лункиGreiner Bio-one662102
НикотинамидНИР D4106
ПарафильмМиллипора СигмаHS234526BГерметизирующая пленка
Пастеровская пипетка (боросиликатное стекло)Научный центр Фишера13-678-20Б
ПБС Gibco10010-023
Пенициллин стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140122
Рекомбинантный эпидермальный фактор роста мышейНИР D2028-ЭГ
Охлаждаемая центрифугаБекман КоултерБЕ-АХ15Р
SB202190 НИР D1264
ТиазовивинНИР D3845
Вкладыш для клеточных культур ThinCert для 24-луночного планшета, 0,4 мкм; mGreiner Bio-one662641
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Научный центр Фишера25200114
Фактор некроза опухоли альфа рекомбинантный человекаНИР D10291-ТА-100
Y-27632 дигидрохлорид ТокрисTB1254-GMP

Ссылки

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FITC
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.